Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil (0)

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL
Keemia instituut
Bioorgaanilise keemia õppetool
Biokeemia praktikumi laboratoorne töö
2.1 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil
Üliõpilane: Liis Hendrikson
Matrikli nr: 104191
Õpperühm: KATB 41
Juhendaja : Tiina Randla
2.1 AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL
Töö teoreetilised alused:
Geelkromatograafia ehk geelfiltratsioonikromatograafia on üks kromatograafia meetoditest , mille põhimõte on lahuses sisalduvate ainete lahutamine ehk fraktsioneerimine nende molekulmassi suuruse järgi. Lahuses sisalduvad erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise ja võimalikult ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega. Geelkromatograafiat kasutatakse makromolekulide lahutamiseks, lisandite eemaldamiseks, soolade eraldamiseks või puhvri vahetamiseks. Proov transporditakse läbi kolonni vesilahuse abil.
Geelkromatograafias viiakse protsess läbi kinnises süsteemis ehk kolonnis , mis on täidetud pundunud geeligraanulitega, mille pooride mõõtmed on samas suurusjärgus lahuses sisalduvate makromolekulide dimensioonidega. Geelkromatograafias kasutatavad geelid koosnevad kas dekstraanist, agaroosist või polüakrüülamiidist.
Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud:

• kolonni vaba maht ehk graanulitevahelise vedeliku maht
  
• graanulitesisese vedeliku maht
  
• geelimaterjali ehk maatriksi maht
  
• täidise kogumaht ehk üldmaht
  

Kui läbi geelkromatograafia kolonni juhtida erineva molekulmassiga ainete segu, siis molekulid lahtuvad üksteisest vastavalt nende suurusele. Et uuritava ainete segu läbi kolonni transportida ja et erineva molekulmassiga ained saaksid üksteisest eralduda, voolutatakse (elueeritakse) koloni sobiva vesilahusega ja kolonnist väljuvat lahust (eluaati) kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueemiris - ehk väljumismaht , mille arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Uuritavas segus sisalduv aine
väljumis- ehk elueerimismaht
on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon , milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena, st minimaalse elueerimismahuga , mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga.
Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et täielikult difundeerida geeli pooridesse, liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga , mis on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule . Kromatografeerimise protsessi võib lugeda lõpetatuks, kui kolonnist väljunud eluaadi üldmaht võrdub ligikaudu kolonni kogumahuga.
Kui geelimaatriksi maht
on teada, siis võib maksimaalse elueerimismahu
välja arvutada.
Geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kolonni vaba mahtu
(eluaadi maht, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu) ja maksimaalset elueerimismahtu
(eluaadi maht, millega väljuvad need molekulid, mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad). Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht
vaadeldavas kolonnis on kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga .
Kus .
Eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nimetatakse kromatogrammiks.
Näitena on toodud näidiskromatogramm kolmekomponentsele segule , millel on näha suurte, geeli pooridesse mittemahtuvate (aine 1), geeli pooridesse osaliselt difundeeruvate (aine 2) ja pooridesse täielikult difundeeruvate (aine 3) molekulide elueerimisprofiilid.
Ainete väljumis- ehk elueerimismahtusid näitavad nende fraktsioonide elueerimismahud, milles vastava aine kontsentratsioon on kõige kõrgem (graafikul tipule vastav maht).
Kromatografeerimissüsteem koosneb kolonnist, eluendi reservuaarist ja automaatsest fraktsioonikogurist ehk kollektorist.
Kolonni ülaosa on suletud korgiga , mida läbib klaastoru, mis ühendatakse kolonnist kõrgemal aletseva eluendi reservuaariga. Väljavooliukraani avamisel hakkab koheselt eluendi pealevool kolonni täidisele ja fraktsioonikoguri käivitamisel algab automaatne fraktsioonide kogumine.
Töö käik:
Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine

• Kontrollisin kolonni vertikaalsust ja vajadusel korrigeerisin kolonni asendit.
  
• Märkisin ples kasutatava kolonni täidiseks oleva Serphadex’i margi ja seda iseloomustava teguri k.
  

Sephadex’i mark:
Tegur k:

• Mõõtsin geelisamba (täidise) kõrguse L ja diameetri d.
  

Täidise kõrgus:
Täidise diameeter :

• Arvutasin täidise kogumahu .
  

• Arvutasin geelmaatriksi mahu ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustava maksimaalse elueerimismahu .
  

• Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml.
  

• Katseklaasistatiivi asetasin fraktsioonide arvule vastava hulga kindla mahu järgi (2 ml) kaliibritud katseklaase ja nummerasin.
  
• Kolonni lähedusse paigutasin voolutuslahuse (eluendi) pudeli ja märkisin üles eluendi koostise. Varusin 25 ml pipeti, millega voolutuslahust kolonni viia.
  
• Varusin väikese (50 ml) keeduklaasi, kuhu kogusid kolonni täidise pinnal oleva eluendi, mis enne uuritava segu sisestamist kolonnist välja lasin.
  

Segu komponentide lahutamine.

• Avasin ettevaatlikult kolonni väljavooluava ja täidise kohal olev voolutuslahus hakkas aeglaselt kolonni alla asetatud anumasse tilkuma.
  
• Kui vedeliku tase kolonnis langes täidise pinnani, sulgesin kiiresti kolonni väljavooluava ja kolonn oli valmis uuritava proovi sisestamiseks.
  

Vedeliku nivoo ei tohtinud langeda geelipinnast allapoole.
Proovi sisestamine .

• Uuritava segu doseerimiseks ja kolonni sisestamiseks kasutasin sobiva mahuga (1 ml) mõõtpipetti, mille otsas on tükike peenikest voolikut.
  
• Pipeti võtsin juhendaja poolt määratud 1 ml uuritavat proovi ja viisin selle kolonni, jättes pipeti otsa umbes 5 mm kaugusele geeli pinnast.
  
• Proovi lasin tilkuda geeli pinnale nii, et see seal võimalikult ühtlaselt jaotuks.
  

Proovi sisestamise ajal hoidsin kolonni väljavooluava suletud.
Kolonni voolutamine.

• Enne voolutamise algust asetasin asetasin väljalaskeava alla 100 ml mõõtesilindri.
  
• Pärast proovi geeli pinnale kandmist, avasin väljavoolu kolonnist ja eluaati hakkasin koguma mainitud mõõtesilindrisse.
  
• Kohe, kui proov oli täidisesse sisenenud, viisin kiiresti pipetiga geeli pinnale väikese koguse (0,5 – 1 ml) voolutuslahust ja lasin sellel täidisesse imbuda.
  
• Sama kordasin teisegi korra.
  
• Kui kogu uuritav proov oli kolonni sisenenud, kandsin geeli pinnale suurema hulga voolutit, et moodustuks 4 – 5 cm kõrgune vedeliku kiht.
  

Elueerimislahus: 20 nM Tris/HCl
0,15 M NaCl
pH – 7,5

• Samal ajal jälgisin, kuidas liikus kolonnis esimene värviline riba ( dekstraansinine ).
  
• Kui see lähenes kolonni põhjale, siis eemaldasin kolonni alt kolbi ühendatud fraktsiooniga ja jätkasin eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena kaliibritd ja eelnevalt nummerdatud katseklaasidesse.
  
• Elueerimise lõpetasin, kui eluaat muutub värvituks.
  

Fraktsioonide analüüsimine.

• Aine kontsentratsiooni väljendasin igas fraktsioonis lahuse optilise tiheduse väärtusena, mida mõõtsin aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel.
  
• Absorptsiooni mõõdsin spektrofotomeetril.
  

Katseandmete tabel.
Lainepikkus , nm
Fraktsiooni nr
Elueerimismaht V, ml
Optiline tihedus, A
Ühendatud fraktsioon
29,0
0
1
31,0
0,003
2
33,0
0,026
3
35,0
0,156
4
37,0
0,133
5
39,0
0,031
6
41,0
0,041
7
43,0
0,133
8
45,0
0,466
9
47,0
0,991
10
49,0
1,292
11
51,0
1,139
12
53,0
0,753
13
55,0
0,415
14
57,0
0,206
31
91,0
0,235
32
93,0
0,368
33
95,0
0,499
34
97,0
0,574
35
99,0
0,557
36
101,0
0,451
37
103,0
0,303
38
105,0
0,184
39
107,0
0,096
Tulemused ja nende interpreteerimine:
Kolonni iseloomustavad parameetrid .
Täidise mark ja materjal: Sephadeks G-75
Pundumistegur k: k=0,1
Täidise kõrgus: 32,7 cm
Kolonni sisediameeter: 2,2 cm
Täidise kogumaht : 124, 26
Maksimaalne elueerimismaht : 111,834
Fraktsioonide üldarv: 55,917
56
Uuritav lahus oli D.
Kromatogramm.
Aine 3
Aine 2
Aine 1
Kõige esimesena väljus kolonnist dekstraansinine , selle osakesed olid väga suured ja ei mahtunud geeli pooridesse. Dektraansinine on nendest kolmest ainest kõige väiksema molekulmassiga. Dekstraansinise kontsentratsioon uuritavas lahuses oli kõige väiksem.
Teisena väljus kolonnist müoglobiin , mille osakesed difundeerusid geeli pooridesse osaliselt. Müoglobiini kontsentratsioon uuritavas lahuses oli kõige suurem.
Viimasena väljus kolonnist DNP- aspartaat , sest tema osakesed difundeerusid täielikult geeli pooridesse, mistõttu tema osakesed liikusid kolonnis kõige aeglasemalt. DNP-aspartaat on nendest kolmest ainest kõige suurema molekulmassiga.
Arvutuslikult tuli kolonnist viimasena väljunud komponendi kõrgeima kontsentratsioonida fraktsiooni eluaadi maht , mis on veidi suurem, kui katseliselt saadud tulemus. Tulemuste erinevus arvutusliku ja katselise vahel võis tulla kas arvutustel tehtud ümardustest või kogenematusest antud katse meetodi läbiviimisel.
Liikuvustegur :
Järeldused:
Antud laboratoorse töö käigus lahutasin kolmekomponentse uuritava lahuse geelkromatograafia meetodit kasutades. Uuritav segu koosnes dekstraansinisest, müoglobiinist ja DNP-aspartaadist. Kõige väiksema molekulmassiga neist oli dekstraansinine, mis väljus kolonnist esimesena, ja kõige suurema molekulmassiga neist oli DNP-aspartaat, mis väljus kolonnist viimasena. Liikuvusteguri väärtus tuli arvutuslikult 0,185, mis jääb ilusti ettemääratus vahemikku .