Ainete lahutamine geelkromatograafiaga (0)

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL
Õppeaine YKL0063
Biokeemia
PRAKTIKUM :
Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil
Üliõpilane: Juhendaja : 
Kood:
Esitatud:
Sooritatud :
2.1 AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL
Teooria
Geelkromatograafia põhimõtteks on lahuses sisalduvate ainete lahutamine nende erinevate molekulmasside järgi. Lahuses sisalduvad ained liiguvad läbi geeli erineva kiirusega. Geelkromatograafiat kasutatakse makromolekulide lahutamiseks, lisandite eemaldamiseks, soolade eraldamiseks või puhvri vahetamiseks. Proov viiakse läbi kolonni vesilahuse abil. Geelkromatograafia protsess toimub kolonnis , mis on täidetud pundunud geeligraanulitega, mille pooride mõõtmed on samas suurusjärgus lahuses sisalduvate makromolekulidega. Geelkromatograafias kasutatavad geelid koosnevad kas dekstraanist, agaroosist või polüakrüülamiidist.
Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud:
kolonni vaba maht ehk graanulite vahelise vedeliku maht (Vv),
graanulite sisese vedeliku maht (Vs),
geelimaterjali ehk maatriksi maht (Vg),
täidise kogumaht ehk üldmaht (Vt).
Seega: Vt = Vv + Vs + Vg
Selleks, et uuritavat ainete segu läbi kolonni transportida ja et erineva molekulmassiga ained saaksid üksteisest eralduda, voolutatakse kolonni sobiva vesilahusega. Kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Molekulid, mis ei mahu geeli pooridesse väjuvad kõige esimesena, st minimaalse elueerimismahuga Vxmin , mis on võrdne kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv Ained, mis mahuvad geeli pooridesse, liigavad kõige aeglasemalt ja väjuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, milline on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule. Et täidis väja ei voolaks, on kolonni alumine ots täidetud klaasvillaga. Eluendi lisamine kolonni ja eluaadi fraktsioonide kogumine toimub käsitsi. Ainehulkade kindlakstegemiseks kogutud fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrit.
Töö käik
Kontrollisin kolonni vertikaalsust. Tegin vastavaid mõõtmisi (kõrgus L ja diameeter d) ja kirjutasin endale Sephadex’i mark ja seda iseloomustav tegur k.
Avasin kolonni väljavooluava ja täidise kohal olev voolutuslahus hakkas aeglaselt kolonni alla asetatud anumasse tilkuma. Kui vedeliku tase kolonnis langes täidise pinnani, sulgesin kolonni väljavooluava (tuleb vältida, et vedeliku nivoo ei langeks geelipinnast allapoole ja õhk ei tungiks geelikihti).
Sisestasin 0,5 ml uuritavat proovi «DB+Lysozyne+DnAsp» kolonni, jättes umbes 5 mm kaugusele geeli pinnast. Proov lastakse tilkuda geeli pinnale nii, et see seal võimalikult ühtlaselt jaotuks. Kui proov on sisestatud , avasin väljavool ja lisasin kiiresti pipeti abil väike kogus eluneti (NaCl). Seda tegevust korratakse kuni proov on täidisesse imbunud. Seejärel lisasin suurema koguse voolutuslahust. Kui esimene värviline riba hakkas lähenema kolonni alumisele osale alustasin eluaati koguma valmispandud katseklasidesse. Elueerimist lõpetasin, kui väljuv eluaat on värvitu.
Analüüsisin võetud proovid spekrofotomeetriga, tegin vastavaid arvutusi ja kõveraid.
Mõõtmised
Sephadex’i mark = G75
k = 0,1
l = 24 cm
d = 2 cm
Vt = πr2l = 75,4 cm3
Vg = k * Vt = 7,54 cm3
Vx max = Vt - Vg = 67,86 cm3
n = Vx max / 2 = 33,93
Katseandmed
Fraktsiooni number
Elueerimismaht (ml)
Optiline tihedus (A)
Lainepikkus (nm)
1
20
0,0089
670
2
22
0,1642
670
3
24
0,3314
670
4
26
0,2637
670
5
28
0,1491
670
6
30
0,0451
670
7
32
0,0757
280
8
34
0,0626
280
9
36
0,0841
280
10
38
0,1356
280
11
40
0,1907
280
12
42
0,2603
280
13
44
0,3196
280
14
46
0,3533
280
15
48
0,3553
280
16
50
0,3365
280
17
52
0,3083
280
18
54
0,2719
280
19
56
0,2473
280
20
58
0, 2200
280
21
60
0,2398
360
22
62
0,3031
360
23
64
0, 3731
360
24
66
0,4132
360
25
68
0,4470
360
26
70
0,4535
360
27
72
0,5185
360
28
74
0,3655
360
29
76
0,2970
360
30
78
0,2394
360
31
80
0,1655
360
32
82
0,1116
360
33
84
0,0694
360
34
86
0,0402
360
35
88
0,0251
360
Elueeritud segus oli:

Dekstraansinine - absorbeerib lainepikkusel 670 nm. Sinise värvusega aine, mis väljub esimesena, sest dekstraansinine on kõrgmolekulaarne (suured molekulid), mille tulemusena molekulid ei mahu geeligranulite pooridesse ja liikuvad kiiresti nende vahel. Kromatogrammi järgi elueerimismaht on Vx min = 24 ml

Teisena väljus Lysozyme, mis absorbeerib lainepikkusel 280 nm Vx = 48 ml

DNP - Aspartaat - absorbeerib lainepikkusel 360 nm. Kollase värvusega aine väljub viimasena, kuna temal on kõige väiksem molekulaarmass ja molekulid hästi mahuvad pooridesse, mis pidurdavad nende liikumist. Vxmax = 72 ml
Liikuvusteguri Rf väärtus:
Järeldus
Liikuvusteguri Rf väärtuseks sain 0,5 , mis vastab vahemikule 0 Arvutuslikult sain maksimaalseks elueerimismahuks Vxmax = 67,82 ml. Katse tegemisel selgus, et tegelik maksimaalne elueerimismaht oli Vxmax = 72 ml.
Katse viga tuleb: . See ei ole suur erinevus, mis võis tulla näiteks sellest, et mõõtsin geelisamba kõrguse või kolonni diameetri ebatäpselt.