Seejärel täideti katseklaas 5ml-se mahuni boraatpuhvriga ja loksutati läbi. · Võeti 50ml mahuga katseklaas ning pipeteeriti sinna 25ml 2% kaseiini lahust, mille pH oli regluleeritud ensüümile sobivale väärtusele. Katseklaas kaetakse korgiga ning asetati 10 minutiks vesitermostaati 30±1C juurde soojenema. · Võeti 4 kuiva 20ml katseklaasi ning nummerdati need. Igasse katseklaasi pipeteeriti 3ml 5% TKÄ lahust. · Kui kaseiini lahus on 30-ni soojenenud, pipeteeritakse kaseiini lahusele juurde 1ml valmistatud alkalaasi töölahust ning loksutati kiiresti läbi. Pärast loksutamist võeti kuiva pipetiga 3ml reaktsioonisegu ning pipeteeriti TKÄ lahusesse. Käivitatati stopper. · 5 minuti pärast võeti sama pipetiga 3ml reaktsioonisegu ning pipeteeriti teise katseklaasi ja katseklaasi sisu loksutatakse hoolega läbi. Sama operatsiooni korratakse veel 10-ndal ja 15-ndal minutil.
väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik: Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine · Uuritavast proteaasi preparaadist valmistatakse ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahus, milles ensüümi kontsentratsioon on vahemikus . · Arvutasin välja ensüümipreparaadi kaalutise suuruse. Minu katses kasutatud ensüüm oli alkalaas. Tehtava töölahuse täpne maht on ja ensüümi kontsentratsioon selles . · Analüütilistel kaaludel kaalusin sobiva suurusega kaaluklaasi vajaliku koguse ensüümipreparaati ja viisin kadudeta (kvantitatiivselt) lahuse valmistamiseks gradueeritud katseklaasi. Kaalutis = 0,0074 g
ensüümi kontsentratsioon on 1 mg/ml ja kogu lahuse maht on 5 ml. Ensüümi kontsentatsioon on 1 mg/ml ,lahuse maht on 5 ml tuleb kaaluda analüütilisel kaaludel 5 mg (0,005 g) Alcalase. Selleks,et valmistada töölahust tuleb: · loputada kaaluklaasi 8,2 pH väärtusega puhverlahusega · kaaluda analüütilise kaaludel kaaluklaasi ilma ensüümideta · kaaluda vajalik ensüümi kogus · lisada väike kogus puhverlahust,loksutada hoolikalt · valada kaaluklaasist lahus lahuse valmistamiseks sobiva anumasse (10 ml katseklaas) · lisada kuni 5 ml kriipsuni puhverlahust ja loksutada. Ensüümireaktsiooni (kaseiini hüdrolüüsi) läbiviimine 1) Võtan 50 ml mahuga suur katseklaas,kuhu pipeteerin 25 ml 2%-list kaseiini lahust.Klaasi peale panen parafilmi ja asetan vesitermostaati °C juurde umbes 5-10 minutiks soojenema. 2) Võtan 4 kuiva katseklaasi (20 ml) ja nummerdan.Igaühte pipeteerin 3 ml 5%-list TKÄ lahust.
Kuna preparaadid sisaldavad ka täiteainet, siis selget lahust ei tekkinud. Ensüümireaktsiooni ehk kaseiini hüdrolüüsi läbiviimine 50 ml mahuga katseklaasi pipeteerisin 25 ml 2%-list kaseiini lahust, mille pH oli reguleeritud ensüümile sobivale väärtusele. Katsin klaasi korgiga ja asetasin vesitermostaati 30 °C juurde soojenema. Võtsin 4 kuiva normaalmõõdus katseklaasi ja nummerdasin nad. Igaühte pipeteerisin 3 ml 5%-list TKÄ lahust. Kui kaseiini lahus oli 30 °C-ni soojenenud, pipeteerisin kaseiinile juurde 1 ml valmistatud proteaasi töölahust. Loksutasin reaktsioonisegu kiiresti läbi ning võtsin puhta ja kuiva pipetiga 3 ml reaktsioonisegu, mille lisasin esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi. Peale proovi võtmist asetasin reaktsiooniseguga katseklaasi tagasi termostaati. 5 minuti pärast võtsin sama pipetiga uuesti 3 ml reaktsioonisegu teise katseklaasi ja loksutatakse klaasi sisu hoolega läbi
Analüütilistel kaaludel kaaluti 0,0203 g tahket ensüümpreparaati, viidi see gradueeritud katseklaasi, lisati puhverlahus (5 ml) ning segati klaaspulgaga, kuni ensüüm oli lahustunud. 50 ml katseklaasi pipeteeriti 25 ml 2% kaseiini lahust, katseklaas suleti korgiga ning asetati vesitermostaati 30 °C juurde 5-10 minutiks. 1 4 kuiva 20 ml katseklaasi pipeteeriti 3 ml 5% trikloroäädikhappe lahust. Kui kaseiini lahus oli termostaadis soojenenud, pipeteeriti sellele 1 ml proteaasi töölahust, segu loksutati. Kohe võeti sellest 3 ml reaktsioonisegu ning viidi esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi (0-proov). Reaktsiooniseguga katseklaas pandi tagasi termostaati. 3 ml reaktsioonisegu võeti ka 5, 10 ja 15 min pärast reaktsiooni algust ning viidi igaüks eraldi TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi. Katseklaasid jäeti veel ~10 minutiks seisma, et toimuks sademe täielik formeerumine. Seejärel filtriti
reaktsioonisegu, mis on 0-prooviks, ja viin esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi. Loksutan läbi ja jätan sademe settima. Kaseiini asetan tagasi termostaati 5 minutiks. Kordan sama operatsiooni 5-minutiliste intervallidega veel 3 korda. Jätan katseklaasid proovidega umbes 10-15 minutiks täielikuks sadestumiseks seisma. Panen valmis 4 puhast katseklaasi koos plastlehtrite ja paberfiltritega. Kui sademed on põhja settinud, filtrin selged lahused kuivadesse katseklaasidesse. Kui mõni lahus on pärast filtrimist veel hägune, filtrin seda lahust uuesti. Määran nende nelja proovi optilise tiheduse väärtused spektrofotomeetria meetodil lainepikkusel 240 nm. Kasutan 1 cm läbimõõduga kvartsküvette. Saan järgmised tulemused. 0,24 0-proov 61 0,27 5:20 min 49 10:20 0,39 min 42 15:15 0,45 min 56 Leian vastavalt nenedele optilistele tihedustele türosiini kontsentratsiooni
väjendatakse türosiini kontsentratsioonina mg/ml või mol/ml (1 mol= 181 g=0,181 mg). Kui kasutada kaliibrimissirget A vs CTyr leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. 3.2.2 Töö käik ENSÜÜMPREPARAADIST TÖÖLAHUSE VALMISTAMINE: 1. Valmista uuritavast protaasi preparaadist (ALKALAAS) ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahus. NB! Ensüümi kontsentratsioon olgu vahemikus 1-5 mg/ml 2. Kooskõlasta juhendajaga: · Alkalaasile sobiv puhver Boraatpuhver, pH= 8,4 · Lahuse täpne maht 5 ml · Alkalaasi kontsentratsioon lahuses 1,66 mg/ml 3. Arvuta ensüümpreparaadi kaaluklaasi vajalik kogus ensüümpreparaati (analüütiline kaal): 4. Kaalu sobiva suurusega kaaluklaasi vajalik kogus (8,3 mg) alkalaasi. 5. Vii kadudeta (kvalitatiivselt) preparaat lahuse valmistamiseks sobivasse anumasse
Tallinna Tehnikaülikool 3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Liina Reimann 134537KATB Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaase leidub kõikides organismides, nad seedivad näiteks toiduvalke. Mõned proteolüütilised ensüümid lõhustavad eelistatult spetsiifilisi, vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (piiratud proteolüüs), teised toimivad kõikidele peptiidsidemetele (piiramatu proteolüüs). Piiratud proteolüüsi viivad läbi näiteks trüpsiin, kümotrüpsiin, pepsiin, mis produtseerivad enamasti peptiide. Subtilisiin, savinaas ja alkalaas on bakteriaalsed proteaasid, mis lagundavad praktiliselt kõiki peptiidsidemeid, produtseerides vabu aminohappeid
Kõik kommentaarid