Geelkromatograafia (0)

Biokeemia
Laboratoorne töö nr:
1
Töö pealkiri: Segude lahutamine ja ainete identifitseerimine
Juhendaja :
Malle Kreen
Töö teostaja : Erki Aun
Õpperühm:
YAGB21
Üliõpilaskood:
112262
2. Segude lahutamine ja ainete identifitseerimine
2.1 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil

• Töö teoreetilised alused
  

Töö eesmärgiks oli segu erinevate komponentide lahutamine. Selleks kasutasin kromatograafilist meetodit – segu komponentide lahutamise meetod, mis põhineb nende erineval jaotumisel liikuva (= mobiilse) ja liikumatu (=statsionaarse) faasi vahel. Kromatograafilise protsessi realiseerisin kinnises süsteemis – kolonnis (kolonnkromatograafia). Kromatograafia liigina kasutasin geelkromatograafiat – selle meetoditest omakorda kasutasin kõige tuntumat ehk geelfiltratsiooni, meetodit tuntakse ka molekulaarsõelte, aga samuti eksklusioonkromatograafia nime all. See on ainete lahutamise, puhastamise ja analüüsi meetod, mis baseerub segus olevate ainete molekulmasside erinevusele. Lahuses sisalduvad erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise, võimalikult ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega.
Pärast komatograafiakolonni voolutamist analüüsitakse lahustunud aineid sobival meetodil. Aine kvantitatiivse analüüsi eluaadi fraktsioonides viisin läbi mõõtes optilist tihedust nähtavas ehk visuaalses (VIS) piirkonnas, kuna töös uurisin värvilistest komponentidest koosnevaid segusid.
Tööd alustan kolonni iseloomustamisega, et teaksin vajalikke suurusi ning arve töö käigust arusaamiseks ning hilisemate arvutuste tegemiseks. Samuti valmistan kolonni tööks ette, et töö kulgeks sujuvalt ning ilma takistusteta ja asjaoludeta, mis võikisd katseandmeid moonutada. Seejärel hakkan segu komponente lahutama, et saaksin määrata eluendi mahud kuni segus sisalduvate ainete kõrgeimate kontsentratsioonidega fraktsiooni väljumiseni. Seejärel sisestan proovi, et saaks alata vedeliku voolamine läbi kolonni ning ained segust saaksid hakata eralduma.
Vaatlesin oma uuritava segu koostist, et teaksin mis ained ja mis järjekorras hakkavad kolonnist väljuma. Seejärel asun kolonni voolutama, et ained kanduksid koos voolutiga läbi kolonni katseklaasidesse. Siis asun fraktsioone analüüsima, et saada teada erineva mahuga väljunud fraktsioonide ainete sisaldust (fraktsioonide optilise tiheduse kaudu).
Geelkromatograafiakolonni iseloomustavad mahud

• Töö käik etappide kaupa
  

Kõigepealt iseloomustasin kolonni ja valmistasin selle ette:

• Kontrollisin kolonni vertikaalsust, geelisamba vertikaalsema piiri saamiseks sai seda loksutatud ning lastud sellel uuesti settida.
  
• Märkisin ülesse kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex’i margi – Sephadex G-75 ja seda iseloomustava teguri k=0,1.
  
• Mõõtsin geelisamba (täidise) kõrguse l=32 cm ja diameetri d=1,6 cm, kasutades sobivat joonlauda.
  
• Arvutasin täidise kogumahu Vt = Vv + Vs + Vg = PI*(d/2)2*l = 64 cm2.
  
• Arvutasin geelmaatriksi mahu Vg = k*Vt = 0,1*6,4= 6,4 cm2 ja sellest lähutvalt kolonni iseloomustava maksimaalse elueerimismahu Vxmax = Vt – Vg = 64cm2 – 6,4 cm2 = 57,6 cm2.
  
• Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n= Vxmax/2 = 57,6/2 =~29.
  
• Katseklaasistatiivile asetasin fraktsioonide arvule (29) vastava hulga kindla mahu järgi (2 ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdasin.
  
• Kolonni lähedusse paigutasin voolutuslahuse (eluendi) pudeli ning märkisin ülesse voolutuslahuse koositse – tris – HCl, 0,15 M NaCl, pH=7,5. Varusin sobiva mahuga pipeti (20 ml, 25 ml), millega voolutuslahust kolonni viia.
  
• Varusin väikse keedukolvi (50 ml) enne uuritava segu sisestamist kolonnist välja lastava kolonni pinnal oleva eluendi jaoks.
  

Lahutasin segu komponendid.
Pärast ülalkirjeldatud ettevalmistuste tegemist avasin ettevaatlikult kolonni väljavooluava ja kolonni kohal olev voolutuslahus hakkas aeglaselt kolonni alla asetatud anumasse tilkuma. Samal ajal reguleerisin kolonni voolukiiruse reguleerimisklambi abil piiridesse 0,7 – 1 mL minutis , mis tähendab, et iga 2-milliliitrise fraktsiooni kogunemise ajaks kujunes 2-3 minutit. Kui vedeliku tase kolonnis langes täidise pinnani, sulgesin kiiresti kolonni väljavooluava.
Proovi sisestamine
Uuritava segu doseerimiseks ja kolonni sisestamiseks kasutasin sobiva mahuga (1 ml) mõõtpipetti. Pipetiga võtsin juhendaja poolt soovitatud koguse (0,5 ml) uuritavat proovi ning viisin selle kolonni, jättes pipeti otsa umbes 5 mm kaugusele geeli pinnast. Proovil lasin voolata (tilkuda) geeli pinnale nii, et see seal võimalikult ühtlaselt jaotuks.
Uuritavad segud
Koosnes 3-st erineva molekulmassiga komponendist. Segus olid kõik ained värvilised, et komponentide lahutumine oleks kolonnis ka visuaalselt jälgitav ja geelkromatograafia põhimõte arusaadavam.
Ühe komponendina sisaldas praktikas uuritav segu dekstraansinist (3mg/ml), mis elueerus minimaalse väljumismahuga ja mille järgi sain teada kasutatava kolonni vaba mahu ( Vxmin = Vv). Dekstraansinine on kõrgmolekulaarne dekstraan (Mr = 2*106), mille külge on kovalentselt seotud sinine värvaine, mistõttu ta omab neeldumismaksimumi λmax lainepikkusel 625 nm.
Lisaks sisaldas uuritav segu Müoglobiini (6mg/ml), mille molekulmass on 16800 Da ja DNP-aspartaati (0,3 mg/ml).
Kolonni voolutamine
Enne kõige kiiremini liikuvat komponenti (dekstraansinist) kolonnis väljuva puhta vooluti kogun ühendatud fraktsioonina, milleks asetan enne voolutamise algust kolonni väljalaskeava alla 100 ml kuiva kolvi.
Olnud proovi eelkirjeldatud viisil geeli pinnale kandnud, avasin väljavoolu kolonnist ja hakkasin eluaati koguma ülalnimetatud kolbi. Niipea kui proov oli täidisesse sisenenud, viisin kiiresti pipeti abil geeli pinnale väikse koguse (0,5-1 ml) voolutuslahust ja lasin täidisesse imbuda. Sama kordasin veel teisegi korra ja alles seejärel, kui olin veendunud, et kogu uuritav proov oli kolonni sisenenud, kandsin geeli pinnale suurema hulga voolutit, nii et moodustus 4-5 cm kõrgune vedelikukiht.
Samas jägisin, kuidas liikus kolonnis esimene värviline riba (dekstraansinine). Kui see lähenes kolonni põhjale, siis eemladasin kolonni alt kolvi ühendatud fraktsiooniga ja jätkasin eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena kaliibritud ja eelnevalt nummerdatud katseklaasidesse.
Kogu voolutamise vältel jälgisin, et kolonni täidise kohal oleks piisavalt eluenti ja lisasin seda vastavalt vajadusele juurde. Samuti vahetasin õigeaegselt katseklaase, et eluaat saaks kogutud täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa.
Elueerimise lõpetamise üle otsustasin eluaadi summaarse mahu järgi, mis ei tohi olla väiksem kui kolonni kogumaht Vt.
Fraktsioonide analüüsimine
Et väljendada aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõtsin aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Absorbtsiooni mõõtsin spektromeetril. Mõõtmist alustasin kui olin saanud praktikumi juhendajalt loa.
Lahuste absorbtsiooni (optilist tihedust) mõõtsin elektromagnetilise kiirguse visuaalses (VIS) piirkonnas. Mõõtsin vaid selliste fraktsioonide absorbtsiooni, milles võis silma järgi täheldada vähimatki värvust.
Koostasin 3-veerulise katseandmete tabeli. Mõõtmistulemused kandisn tabelisse, fikseerides ka värvusetute fraktsioonide numbrid ja elueerimismahud, märkides nende optiliste tiheduste väärtuseks 0.
Katseandmete tabel
Fraktsiooni nr.
Elueerimismaht
V, mL
Optiline tihedus, A
Ühendatud fraktsioon
18
0
1
20
0,141
2
22
0,388
3
24
0,064
4
26
1,984
5
28
3,436
6
30
3,436
7
32
2,533
8
34
1,065
9
36
0,339
10
38
0,142
11
40
0,05
12
42
0,021
13
44
0,01
14
46
0,006
15
48
0,039
16
50
0,193
17
52
0,587
18
54
1,258
19
56
1,917
20
58
1,762
21
60
1,084
22
62
0,46
23
64
0,136
24
66
0,036
25
68
0,013

• Tulemuste analüüs ja kokkuvõte või järeldus tööst
  

A. Kasutatud kolonni iseloomustavad parameetrid:

• täidise materjal - dekstraangeel ja mark – Sephadex G-75,
  
• k = 0,1 - täidist iseloomustav pundumistegur,
  
• täidise kõrgus l = 32 cm ja kolonni sisediameeter d = 1,6 cm,
  
• arvutatud täidise kogumaht Vt = 64 cm2,
  
• arvutatud maksimaalne elueerimismaht Vxmax = 57,6 cm2,
  
• arvutuslik fraktsioonide üldarv n = 29.
  

B. Mõõtmistulemuste tabel ja selle alusel koostatud kromatogramm, st graafiline sõltuvus.
Mõõtmistulemuste tabel:
Fraktsiooni nr.
Elueerimismaht
V, mL
Optiline tihedus, A
Ühendatud fraktsioon
18
0
1
20
0,141
2
22
0,388
3
24
0,064
4
26
1,984
5
28
3,436
6
30
3,436
7
32
2,533
8
34
1,065
9
36
0,339
10
38
0,142
11
40
0,05
12
42
0,021
13
44
0,01
14
46
0,006
15
48
0,039
16
50
0,193
17
52
0,587
18
54
1,258
19
56
1,917
20
58
1,762
21
60
1,084
22
62
0,46
23
64
0,136
24
66
0,036
25
68
0,013
Tabeli alusel koostatud kromatogramm:
C. Kromatogrammi info:
Ainetest kõige esimesena väljus dekstraansinine, sest tema molekulmass on kõige suurem (2 000 000 daltonit), ainetest järgmisena väljus Müoglobiin kuna tema molekulmass on suuruselt järgmine ( 16 800 daltonit) ja ainetest viimasena väljus DNP – aspartaat , sest tema molekulmass on kõige väiksem (299,5 daltonit). Mida suurem on aine molekulmass, seda vähem difundeerub ta geeli pooridesse ja seda kiiremini ta kolonnist väljub.
Eluaadi maht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni (kaasa arvatud) väljumiseni Vxmin = Vv = 22 ml.
Eluaadi maht kuni müoglobiini kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni (kaasa arvatud) väljumiseni Vx = 30 ml.
Eluaadi maht kolonnist viimasena väljunud komponendi DNP- aspartaadi kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni (kaasa arvatud) väljumiseni Vxmax = 56 ml.
D. Viimasena väljunud komponendi (DNP-aspartaat) elueerimismaht oli 56 ml. Arvutuslik Vxmax = 57,6. Need arvud langevad suhteliselt kokku, järelikult on töö korrektset läbiviidud.
E. Segus sisaldunud valgu jaoks liikuvusteguri Rf väärtuse arvutamine, kasutades Rf arvutusvalemis kolonni arvutuslikku Vxmax väärtust.
Rf = Vx-Vxmin/Vxmax-Vxmin = 0,225 - Rf arvväärtused jäävad vahemikku 0...1 (0