Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine (0)

Tallinna Tehnikaülikool
Keemia instituut
Bioorgaanilise keemia õppetool
Laboratoorne töö nr 3.2
PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE
Tallinn 2013
Teooria
Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid . Protreolüütiliste ensüümide esindajad omavad erinevat toimespetsiifikat. Mõned lõhustavad eelistatult spetsiifilisi, vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid, teised toimivad kõikidele peptiidsidemetele.
Samas paljud bakteriaalsed proteaasid omavad väga nõrka spetsiifikat ja lagundavad valkudes praktiliselt kõiki peptiidsidemeid produtseerides vabu aminohappeid.
Sõltuvalt sellest, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele sidemetele eristatakse endo- ja eksopeptidaase. Lisaks eristatakse proteaase veel optimaalse keskkonna pH järgi, kas hapudeks-, neutraalseteks- või leelisproteaasideks. Oluliseks proteaaside klassifikatsiooni aspektiks on aktiivtsenti ehitus ja sellest tulenev ensüümi toimemehhanism. Proteaasid jagunevad seriin-, tiool -, aspartaat -, ja metalloproteaasideks.
Kuna hüdrolüüsinud peptiidsidemete hulk ei ole otseselt mõõdetav siis avaldatakse proteaaside aktiivsus valgu hüdrolüüsil vabanevate produktide hulga kaudu.
Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgnevad trikloroäädikhappega mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil.

Töö käik

• Alkalaasi ensüümist valmistati 5ml lahust, kus ensüümi konsentratsioon oli 1,5mg/ml. Selleks kaaluti analüütilisel kaalul kaaluklaasi 5 · 1,5 = 7,5mg = 0,0075g ensüümipreparaati ja viidi see kvantitatiivselt gradueeritud katseklaasi.
  
• Lisati väike kogus boraatpuhvrit (pH = 8,4) ja segati 5 min klaaspulgaga. Seejärel täideti katseklaas
  5ml-se mahuni boraatpuhvriga ja loksutati läbi.
  
• Võeti 50ml mahuga katseklaas ning pipeteeriti sinna 25ml 2% kaseiini lahust, mille pH oli regluleeritud ensüümile sobivale väärtusele. Katseklaas kaetakse korgiga ning asetati 10 minutiks vesitermostaati 30±1C juurde soojenema.
  
• Võeti 4 kuiva 20ml katseklaasi ning nummerdati need. Igasse katseklaasi pipeteeriti 3ml 5% TKÄ lahust.
  
• Kui kaseiini lahus on 30-ni soojenenud, pipeteeritakse kaseiini lahusele juurde 1ml valmistatud alkalaasi töölahust ning loksutati kiiresti läbi. Pärast loksutamist võeti kuiva pipetiga 3ml reaktsioonisegu ning pipeteeriti TKÄ lahusesse. Käivitatati stopper.
  
• 5 minuti pärast võeti sama pipetiga 3ml reaktsioonisegu ning pipeteeriti teise katseklaasi ja katseklaasi sisu loksutatakse hoolega läbi. Sama operatsiooni korratakse veel 10-ndal ja 15-ndal minutil.
  
• Proovidega katseklaasid jäeti 15-ks minutiks seisma, ning valmistatati ette neli puhast (ja kuiva) katseklaasi ja varustatati need lehtrite ja paberfiltritega.
  
• Proovid filtritakse kuivadesse katseklaasidesse. Kuna esimesel filtrimisel ei saanud päris läbipaistvat lahust siis filtrisin kaks korda.
  
• Spektrofotomeertil määrasin proovide optilised tihedused lainepikkusel 280nm, kasutades 1cm läbimõõduga kvartsküvette.
  

Optilised tihedused

• Null lahus - 0,0281 – 0,045mg/ml
  
• 5 min lahus – 0,343 – 0,057mg/ml
  
• 10 min lahus – 0,411 – 0,065 mg/ml
  
• 15 min lahus – 0,493,9 – 0,076 mg/ml
  

Graafiku abiga leidsin neile tiheduse väärtustele vastavad kontsentratsioonid.
Proteaasi aktiivsuse arvutamine
A = [ΔCTyr · 103 · V1 · V2 · 2] / [Δt · 181 · V3 · g]
ΔCTyr = [C1 – C0 + C2 – C1 + C3 – C2 ] / 3
ΔCTyr = [0,055 – 0,045 + 0,067 – 0,055 + 0,078 – 0,068] / 3 = 0,01mg/ml
A = [0,01 · 103 · 5 · 26 · 2] / [300 · 181 · 0,0075 · 1] = 6,3μkat/g
Tulemuste analüüs
Kuna kõik punktid graafikul asuvad peaaegu ühel joonel , siis võib lugeda katse edukaks. Vähest kõikumist võis tuleneda aja ebatäpsest fikseerimisest, esimeste proovide puhul võis minna aega natuke rohkem üle, kuna alguses ei tulnud süstlaga pipeteerimine nii hästi välja kui viimaste proovide puhul.