Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil (0)

TTÜ Keemiainstituut
Bioorgaanilise keemia õppetool
YKL0061 Biokeemia I
Laboratoorne töö nr. 2
Töö pealkiri:
2.1 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil
Õpperühm:
YAFB21
Töö teostaja :
Jana Sarnavskaja(YAFB163900)
Õppejõud:
Tiina Randla
Töö teostatud:
20.02. 2017
Protokoll esitatud:
05.03.2017
Protokoll arvestatud:
2.1 AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL
Kromatograadia on segu komponentide lahutamise meetod, mis põhineb nende erineval jaotumisel liikuva (mobiilse) ja liikumatu (statsionaarse) faasi vahel. Kromatograafilisi meetodeid kasutatakse laialdaselt amiohapete, valkude, süsivesikute jt ainete segude lahutamisel.
Geelkromatograafia ehk geelfiltratsioonkromatograafia on üks kromatograafia meetoditest , mille põhimõtteks on lahuses sisalduvate ainete lahutamine ehk fraktsioneerimine nende molekulmassi suuruse järgi. Lahuses sisalduvad, erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise, võimalikult ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega.
Geelkromatograafiat kasutatakse makromolekulide lahutamiseks, lisandite eemaldamiseks, soolade eraldamiseks või puhvri vahetamiseks, kusjuures proov transporditakse läbi kolonni vesilahuse abil.
Segu geelkromatograafilise lahutamise põhimõte
Geelkromatograafias viiakse protsess läbi kinnises süsteemis – kolonnis , mis on täidetud pundunud geeligraanulitega, mille pooride mõõtmed on samas suurusjärgus lahuses sisalduvate makromolekulide dimensioonidega. Kasutatavad geelid koosnevad kas dekstraanist (glükoosi polümeer ), agaroosist (lineaarne punavetikate polüsahhariid) vōi polüakrüülamiidist.
Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud:

• kolonni vaba maht ehk graanulitevahelise vedeliku maht (Vv),
  
• graanulitesisese vedeliku maht (Vs),
  
• geelimaterjali ehk maatriksi maht (Vg),
  
• täidise kogumaht ehk üldmaht (Vt).
  

Vt = Vv + Vs + Vg
Kui läbi geelkromatograafia kolonni juhtida erineva molekulmassiga ainete segu, siis molekulid lahutuvad üksteisest vastavalt nende suurusele. Selleks, et uuritavat ainete segu läbi kolonni transportida ja et erineva molekulmassiga ained saaksid üksteisest eralduda, voolutatakse (elueeritakse) kolonni sobiva vesilahusega ( puhver , soolalahus vm) ja kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa.
Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx. Aine x väljumis- ehk elueerimismaht on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon , milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne.
Kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena (kõige kiiremini), st minimaalse elueerimismahuga Vxmin , mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga Vv. Vxmin = Vv
Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse, liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, milline on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule Vt. Vxmax = Vt. Kromatografeerimise protsess on lõppenud, kui kolonnist väljunud vedeliku (eluaadi) üldmaht võrdub ligikaudu kolonni kogumahuga.
Kui geelimaatriksi maht Vg on teada, siis vōib arvutada maksimaalse elueerimismahu Vxmax = Vt – Vg
Kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kolonni vaba mahtu Vv (= Vxmin) ja maksimaalset elueerimismahtu Vxmax.
Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf, mis arvutatakse vastavalt valemile:
Rf = (Vx – Vxmin) / (Vxmax – Vxmin)
Rf arvväärtused jäävad vahemikku 0....1.
Eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nimetatakse kromatogrammiks. Ainete väljumis- ehk elueerumismahtusid näitavad nende fraktsioonide elueerumismahud, milles vastava aine kontsentratsioon on kõige kõrgem („tipule” vastav maht).
Kromatografeerimissüsteem:
Tüüpiline kromatografeerimissüsteem koosneb kolonnist, eluendi reservuaarist ja fraksioonikogurist ehk kollektorist.
Töös oli kasutatud klaaskolonne, mis juba eelnevalt oli täidetud pundunud dekstraangeeliga Sephadex. Vältimaks täidise väljavoolamist on kolonni alumine osa täidetud klaasvillaga. Kolonn on kinnitatud statiivi külge sellisele kõrgusele, et selle alla mahuks katseklaas. Täidise kōrgus kolonnides on 25–30 cm.
Ainete kontsentratsioonide kindlakstegemiseks eluaadi fraktsioonides kasutati spektrofotomeetrilist meetodit.
TÖÖ KÄIK
Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine

• kolonni täidis Sephadex G75, k=0,1
  
• Geelisamba täidise kõrgus L=24 cm, diameeter d=2 cm
  
• Täidise kogumaht Vt = π•(d:2)2•L = 3,14• (2:1)2•24 = 75,40 cm3 = 75,40 ml
  
• Geelimaatriksi maht Vg = k•Vt = 0,1•75,40 = 7,54 ml, kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt – Vg = 75,40–7,54 = 67,86 ml.
  
• Fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; n = Vxmax/2 = 67,86/2 = 33,93.
  

Avasin kolonni vooluava ning täidise kohal olev voolutuslahus hakkas aeglaselt mööda kolonni liikuma. Vedeliku tasemel lasin langeda kuni täidise pinnani, sulgesin kolonni vooluava ning panin peale uuritavat proovi, mis koosnes: dekstraansinisest, müoglobiinist ja DNP-aspartaadist. Dekstraansinine väljub minimaalse väljumismahuga ning tänu sellele on komponentide lahutumine paremini jälgitav.
Kolonni voolutamine
Võtsin uuritavat proovi 0,5 ml ning lasin sel voolata geeli pinnale võimalikult ühtlaselt. Seejärel avasin voolutusava ning kuni alaossa jõudis kõige kiiremini liikuv osa, milleks on dekstraansinine, väljus kolonnist puhas vooluti, mille kogusin ühendatud fraktsioonina (16,75 ml). Seda kogusin sinnamaani, kuni nägin kolonnis, et dekstraansinine hakkas jõudma üpris kolonni alaossa. Seejärel hakkasin koguma fraktsioone 2 ml kaupa. Lisasin pidevalt juurde eluenti, milleks oli 0,15 M NaCl. Eluaadi kogumise lõpetasin, kui see oli muutunud värvusetuks.
Fraktsioonide analüüsimine
Ainete kontsentratsiooni antud töös väljendatakse igas fraktsioonis lahuse optilise tiheduse väärtusena, mida mõõtsin aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Lainepikkused sõltuvad uuritava ainesegu koostisest: dekstraansinine- 670 nm, aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped (türosiin Tyr, fenüülalaniin Phe, trüptofaan Trp) - 280 nm ja DNP- aspartaat - 360 nm.
Katseandmete tabel
Fraktsiooni nr
Elueerumismaht ml
Optiline tihedus, A
Ühendatud fraktsioon
16,75
0
1
18,75
0,0961
2
20,75
0,1959
3
22,75
0,3551
4
24,75
0,6745
5
26,75
0
6
28,75
0,0661
7
30,75
0,0520
8
32,75
0,0447
9
34,75
0,0422
10
36,75
0,0400
11
38,75
0,0462
12
40,75
0,0453
13
42,75
0,0484
14
44,75
0,0483
15
46,75
0,0444
16
48,75
0,0438
17
50,75
0,0423
18
52,75
0,0412
19
54,75
0,0440
20
56,75
0,0524
21
58,75
0,1019
22
60,75
0,1935
23
62,75
0,3328
24
64,75
0,4233
25
66,75
0,4367
26
68,75
0,3561
27
70,75
0,2505
28
72,75
0,1436
29
74,75
0, 0724
30
76,75
0
670 nm
280 nm
360 nm
Tulemused ja nende interpreteerimine
A.

• täidise materjal Sephadex G75
  
• k = 0,1
  
• täidise kõrgus L = 24 cm, kolonni sisediameeter d = 2 cm
  
• Täidise kogumaht Vt = π•(d:2)2•L = 3,14• (2:1)2•24 = 75,40 cm3 = 75,40 ml
  
• kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt – Vg = 75,40–7,54= =67,86 ml
  
• Fraktsioonide üldarv n = Vxmax/2 = 67,86/2 = 33,93
  

B. Mõõtmistulemuste tabeli alusel koostatud kromatogramm
Aine 1 – dekstraansinine
Aine 2 - aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped (türosiin Tyr, fenüülalaniin Phe, trüptofaan Trp)
Aine 3 – DNP - aspartaat
C.
aine 1 = Vxmin = 24,75 ml
aine 2 = Vx = 28,75 ml
aine 3 = Vxmax = 66,75 ml.
Kõige esimesena väljus dekstraansinine, mille molekulid ei mahtunud geelipooridesse ning seetõttu oli minimaalse elueerimismahuga. Järgmisena väljus aromaatne valk ning viimasena, geeli pooridesse mahuvana, maksimaalse elueerimismahuga DNP - aspartaat.
• Eluaadi maht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsioonini (Vxmin = Vv) oli 24,75 ml
• Eluaadi maht valgu kõrgeima kontsentratsiooni fraktsiooni väljumiseni oli 28,75 ml.
• Eluaadi maht viimasena väljunud komponendil oli 66,75 ml.
D.
Viimasena väljunud komponendi elueerumismahtu võrdlus arvutusliku Vxmax väärtusega.
Arvutuslik Vxmax = 67,86 ml
Katset läbiviides sain viimasena väljunud komponendi elueerumismahuks 66,75 ml.
Minu saadud tulemus erineb arvutuslikust 1,11 ml võrra. Suhteline viga seejuures on umbes 1,64%, mis tähendab, et tulemused on üsnagi kokkulangevad. Viga võis tekkida kolonni mahu mõõtmisel.
E.
Rf = (Vx – Vxmin) / (Vxmax – Vxmin)
Segu sisaldas aromaatse tuumaga valku, seega leian tema liikuvusteguri väärtuse:
Rf = (28,75 - 24,75) / (66,75 - 24,75) = 0,095