Lipiidide reaktsioonid, karotenoidide identifitseerimine (0)

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL
KEEMIAINSTITUUT
Bioorgaanilise keemia õppetool
YKL0060 Biokeemia praktikum
Laboratoorne töö
1. Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega
1.3 Lipiidide reaktsioonid
2.5 Karotenoidide identifitseerimine ja sisalduse määramine
Üliõpilane
Matrikli nr
Õpperühm
Juhendaja :
Tallinn 2011
1. AINETE TUVASTAMINE KVALITATIIVSETE REAKTSIOONIDEGA
Kvalitatiivsed reaktsioonid võimaldavad kindlaks teha mingi keemilise elemendi, funktsionaalse rühma, ühendi või teatud omadustega ainete grupi olemasolu või puudumist uuritavas keskkonnas. Enamasti hinnangut antakse värvuse tekke, sademe moodustumise, gaasi eraldumise või muu silmaga nähtava muutuse alusel. Kvalitatiivsed reaktsioonid ei nõua aine täpset doseerimist, enamasti võib piirduda silmamõõduga.
1.3 LIPIIDIDE REAKTSIOONID
TÖÖ TEOREETILISED ALUSED
Lipiidid on heterogeenne ühendite rühm, kuhu kuuluvad ained on oma keemiliselt ehituselt enamasti estrid. Reeglina lipiidid vees ei lahustu, kuid lahustuvad orgaanilistes solventides, teistes lipiidides ning leelismetallide soolade lahustes. Lipiidide omadus mitte vees lahustuda põhineb hüdrofoobsete aatomirühmade ja radikaalide sisaldusest. Lipiidid kuuluvad rakumembraanide koostisesse, on loomsetes organismides energeetiliseks varuaineks ning täidavad mitmesuguseid kaitse-ja regulatoorseid funktsioone.
1.3.1 Rasvapleki proov
Kõikide lipiidide ühiseks omaduseks on lahustuvus orgaanilistes lahustites . Lipiidi sisaldava lahuse tilga kandmisel paberile ja lahusti aurustumisel moodustub lipiide sisaldava proovi korral paberile rasvaplekk , millest paberi läbipaistvus suureneb. Rasvaplekk on vastu valgust vaadates muust paberist heledam ja pimeda poole vaadates tumedam . Oluline on meeles pidada, et järeldusi saab teha kuiva(tatud) proovidega paberit uurides, sest niiske paberi läbipaistvus on suurenenud ka lipiide mittesisaldavate lahuste korral.
Töö käik: Kahte katseklaasi panin umbes 1g kummastki tahke aine proovist. Mõlemasse valasin umbes 1ml orgaanilist lahustit, milleks kasutasin etanooli ja lasin 5 min seista. Mõlemast katseklaasist kandsin tilga paberile ja kuivatasin.
Järeldus: Kuivade paberite võrdlusel oli näha proovi nr 2 tulemusel tekkinud rasvaplekke, sellest järelduvalt: proov nr 2 sisaldas lipiide.
1. 1.3.2. Emulsioonitest
Emulsioonid on üks liik kahe- või enamafaasilistest süsteemidest, mida tuntakse kolloidide nime all. Kolloidid koosnevad kahest mittesegunevast vedelikust, millest üks (dispergeerunud faas) on jaotunud mikroskoopiliste tilgakestena teises vedelikus (pidevas faasis). Kuna emulsioonid hajutavad läbivat valgust, siis emulsiooni moodustumisest annab informatsiooni selge lahuse muutumine häguseks.
Rasvade kui rasvhapete glütserüülestrite iseloomulikuks tunnuseks on hüdrofoobsus ja lahustumatus vees ja vesilahustes. Küll aga lahustuvad nad orgaanilistes solventides, nagu kloroform, benseen , aga ka atsetoon , metanool jt. Kui taolises solvendis valmistatud rasvalahus viia hüdrofiilsesse vesikeskkonda ja seda intensiivselt segada või loksutada , siis moodustub õli-vees tüüpi emulsioon .
Töö käik: Kahte kuiva katseklaasi valatakse 2 ml 96%-list etanooli ja lisatakse 2 ml kahte erinevat uuritavat lahust, millest üks sisaldab lipiidi, teine mitte. Katseklaase loksutatakse kuni homogeense lahuse moodustumiseni. Seejärel lisatakse mõlemasse 4 ml destilleeritud vett ja loksutatakse taas intensiivselt. Jälgitakse, kumba proovi sisaldavas katseklaasis muutub segu häguseks ja tehakse järeldus lipiidi sisaldumise kohta.
Järeldus: Pärast dest vee lisamist ja loksutamist hägustus esimese prooviga tehtud lahus. Sealt järeldub, et esimene proov sisaldab lipiide.
1.3.3 Akroleiiniproov
Glütserooli (propaantriooli) kuumutamisel, eriti vett siduvate ainete juuresolekul, tekib terava lõhnaga küllastamata aldehüüd propenaal ehk akroleiin . Sama reaktsiooni annavad rasvad ja glütserofosfolipiidid, kuid ei anna glütserooli mittesisaldavad lipiidid (vahad, sfingolipiidid jt). Seega võimaldab akroleiini moodustumine otsustada, kas tegemist on glütserooli sisaldava või mittesisaldava lipiidiga.
Töö käik
Kahte kuiva katseklaasi kantakse ~1g KHSO4 või NaHSO4 ja lisatakse mõni tilk kahest erinevast uuritavast materjalist (tähistatud akroleiinitesti proovid 1 ja 2). Katseklaase kuumutatakse tõmbekapis gaasipõleti kohal kuni soola sulamise ja proovi tumenemiseni. Viimane annabki märku reaktsiooni toimumisest ja akroleiini moodustumisest. Nuusutatakse ettevaatlikult katseklaasidest eralduvat lõhna (NB! Akroleiin on mürgine!), tõmmates käega katseklaasi kohalt õhku enda suunas ja tehakse järeldus, kumb proovidest sisaldas lipiidi, mille koostisse kuulub glütserool..
Järeldus: Esimene proov säilitas mingil määra meeldiva lõhna, teist proovi sisaldanud katseklaasi sisu hakkas jubedalt kärssamise järgi haisema . Seega järeldub, et teine proov sisaldas lipiidi, mille koostisse kuulub glütserool.
1.3.4 Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiidides
Küllastumata rasvhapete esinemise kindlakstegemiseks lipiidides kasutatakse
analoogiliselt süsivesinike uurimisega reaktsiooni halogeenidega. Küllastunud rasvhappeid sisaldava proovi reaktsioonil broomiga viimasele iseloomulik pruun värvus võib küll veidi lahjeneda, kuid ei kao, samas aga küllastumata rasvhapete sisalduse puhul muutub lahus toimuva liitumis-reaktsiooni tõttu momentaalselt värvituks.
Töö käik
Kolme puhtasse ja kuiva katseklaasi valatakse igasse 2 ml erineva lipiidi lahust
orgaanilises lahustis :

Steariinhape

Või

Kookosrasv
Kõigisse katseklaasidesse lisatakse tilkhaaval võrdne kogus (kuni 10 tilka)
broomi lahust kloroformis e triklorometaanis, loksutatakse ning jälgitakse toimuvaid muudatusi. Rasvhapet sisaldavas katseklaasis peaks broomi lahus säilitama iseloomuliku kollakas -pruuni värvuse, teistes kahes aga toimub värvuse muutus. Tehakse järeldused uuritavate lipiidi proovide küllastumatuse (küllastumata rasvhapete sisalduse) kohta.
Järeldus: Kõigist võimalikest lipiidilahustest säilitasid värvi vaid steariinhappe ning kookosrasva lahused . See näitab nende lahuste küllastumata rasvhapete sisaldust.
1.3.5 Liebermann -Burchard'i kolesterooli määramise test
Kolesterooli reageerimisel äädikhappe anhüdriidiga (CH3CO)2O väävelhappe keskkonnas moodustub tume sinakas -rohelise värvusega reaktsioonisegu. Tegemist on mitmeastmelise reaktsiooniga ja lõpliku värvuse kujunemist võib märgata üle punase ja sinise vaheühendi. Reaktsiooni sinakas-rohelises staadiumis on TMR-meetodil identifitseeritud arvukalt (kuni 20) reaktsiooniprodukte, mis näitavad, et kolesterooli molekulis leiab aset rida transformatsioone: toimub steraanituuma oksüdeerumine, mis viib
küllastamatuse suurenemisele ja sulfoneerumine erinevates punktides. Lõppkokkuvõttes tekib kolesterooli polüeensete sulfoonhappe derivaatide segu. Samas aga positsioonis C17 paiknev süsivesinikradikaal reaktsioonis ei osale.
Töö käik: Kolme puhtasse ja kuiva katseklaasi valatakse igasse 2 ml erineva lipiidi lahust ,metüleenkloriidis:

Kolesterool

Kookosrasv

Searasv
Igasse katseklaasi lisatakse 6...7 tilka värsket äädikhappe anhüdriidi ja 4...5 tilka kontsentreeritud väävelhapet ning loksutatakse hoolikalt. Jälgitakse katseklaasides toimuvaid värvuse muutusi ning reaktsioonisegu lõpliku värvuse kujunemist. Tehakse järeldused kolesterooli sisalduse kohta uuritavates proovides.
Järeldus: Kolesterooli lahus värvus tugevalt rohekas-sinakaks. Seismisel värvus ka searasv õrnalt sinakaks, kookosrasv jäi värvituks. Järeldusena saab öelda, et kookosrasv ei sisalda praktiliselt kolesterooli, searasv sisaldab, kuid ka mitte väga suures hulgas.
2.2 KAROTENOIDIDE IDENTIFITSEERIMINE JA SISALDUSE MÄÄRAMINE
TÖÖ TEOREETILISED ALUSED
Klorofüllid on fotosünteesi põhipigmenid ja annavad taimedele rohelise värvuse. Abipigmentideks on karotenoidid ja fikobiliinid (kollased, punased, purpursed).
Karotenoidid on loomsetes organismides vitamiin A provitamiiniks.
Karoteeni isomeeridest on tähsaim β- karoteen , kristalliline vees mittelahustuv aine, selle molekul annab loomorganismis poolestudes kaks retinooli (vitamiin A1 molekuli).
Etanoolis lahustub karoteen piiratud ulatuses, apolaarsetes lahustites hästi ( petrooleeter , bensiin dietüüleeter). Karoteen ei oma optilist aktiivsust.
Karotenoidid (ka karoteen) sisaldavad hulgaliselt konjugeeritud kaksiksidemeid ja neelavad intensiivselt valgust spektri nähtavas osas.
Puhtal karoteenil on apolaarsetes lahustites iseloomulikud neeldumismaksimumid spektri sinises piirkonnas 450 – 480 nm. Kui proov sisaldab üheaegselt erinevaid karotenoide, võib spekter muutuda (kui on ka klorofülli on maksimumid lainepikkustel 425 – 650 nm).
Töö eesmärgiks on taimsest materjalist eraldatud karotenoidide segu võ karotenoidide ja klorofülli segu neeldumisspektri määramine spektrofotomeetril, uuritava materjali karotenoidse koostise iseloomustamine ,β-karoteeni sisaldus määramine uuritavas proovis, klorofülli olemasolu kindlakstegemine.
Töö käik:

Karotenoidide isoleerimine taimsest materjalist:

• Peenestasin tüki tomatit noaga , kaalusin tehnilisel kaalul 1,10 g materjali. Uhmris lisasin porgandile pestud liiva ja uhmerdasin kuni segu oli ühtlane mass.
  
• Lisasin veevaba NaHSO4 vee sidumiseks ja segasin kuni segu oli ühtlane kuiv pulber .
  
• Karotenoidide ja klorofülli ekstraktsioon: lisasin massile portsjonitena petrooleetrit, segasin. Filtrisin ekstrakti klaaslehtriga ja läbi paberfiltri mensuuri .
  
• Kordasin protsessi kuni kuni ekstrakt oli värvitu. Ühendasin saadud ekstraktiportsjonid.
  
• Määrasin ekstrakti üldmahu (29 ml).
  

Kasutades spektrofotomeetrit mõõtsin uuritava lahuse neeldumisspektrid (aparaat muutis sujuvalt lainepikkuseid vahemikus 350 – 600 nm), võrduslahuseks puhas lahusti (petrooleeter).
Võrdlesin saadud tulemusi laborimaterjalidega, sain tulemuseks, et minu proov sisaldas lükopeeni.
ABS
nm
0,648
500,5 nm
0,768
469,5 nm
0,542
443,0 nm

Lükopeeni kvalitatiivne määramine: kasutan optilist tihedust mis on mõõdetud lainepikkusel 450 nm.
K = D * V * d * 103 / E1cm1% * g
D – ekstrakti optiline tihedus
0,768 ABS
E1cm1% - 1%-lise karoteeni lahuse ekstinktsioon (optiline tihedus) lainepikkusel 450 nm
3450 ABS
V – ekstrakti kogumaht
29 ml
d – ekstrahendi tihedus
0,69 g/cm3
g – uuritava proovi mass
1,1 g
103 – tegur üleminekuks grammidel
103
K = 0,768 * 29 * 0,69 * 103 / 3450 * 1,1 = 4,05 mg%
Järeldus:
Tomatis sisaldub põhiliselt lükopeen.
Tööd teostatud: