spektrofotomeetrilisel meetodil. Lisaks kõrgmolekulaarsete peptiidide sadestamisele lõpetab TKÄ ka ensüümireaktsiooni kulgemise. Lahusesse jäävad vaid vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (türosiin, trüptofaan, fenüülalaniin) sisalduse alusel. Need aminohapped omavad neeldumismaksimume lainepikkustel 270-280 nm, kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus väljendatakse türosiini kontsentratsioonina. Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine • Uuritava proteaasi lahusena kasutatakse alkalaasi. • Alkalaasi kaaluti analüütilisel kaalul 17,9 mg ja tehti sellest 5 ml lahust boraatpuhvris (pH 8,4) gradueeritud katseklaasi Ensüümireaktsiooni läbiviimine
Pärast sademe eraldamist jäävad lahusesse vaid vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (türosiin, trüptofaan, fenüülalaniin) sisalduse alusel. Need aminohapped omavad neeldumismaksimume UV- piirkonnas lainepikkustel 270–280 nm, tänu millele on nad spektrofotomeetriliselt hõlpsalt detekteeritavad. Kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldust väljendatakse türosiini kontsentratsioonina mg/ml või µmol/ml, kusjuures 1 µmol = 181µg = 0,181 mg. Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine Alkalaasi preparaadist valmistasin ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahuse. Arvutasin, et 5 ml lahuse valmistamiseks on vaja 10 mg alkalaasi preparaati
Lisaks kõrgmolekulaarsete peptiidide sadestamisele lõpetab TKÄ ka ensüümireaktsiooni kulgemise. Lahusesse jäävad vaid vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (türosiin, trüptofaan, fenüülalaniin) sisalduse alusel. Need aminohapped omavad neeldumismaksimume lainepikkustel 270- 280nm, kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus väljendatakse türosiini kontsentratsioonina. Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine · Uuritava proteaasi lahusena kasutatakse alkalaasi (leelisproteaas, pH 8,4) · Alkalaasi kaaluti analüütilisel kaalul 7,6 mg (soovitatav oli 7,5 mg) ja tehti sellest 5 ml lahust boraatpuhvris (pH 8,4)
määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetaksegi kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust (= absorptsiooni = optilist tihedust, tähis A või D) uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorptsioon on tingitud kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentratsioonina mg /ml või mol /ml (1 mol = 181g = 0,181 mg). Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget A (D) versus CTyr leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik Puhvri valmistamine: Kaalusin 0,12 g boorhapet lisades dest vett kuni 10 ml. Kaalusin 0,19 g booraksit lisades vett kuni 10 ml. Väikese keeduklaasi pipeteerisin 5,5 ml boorhappe lahust ja 4,5 ml booraksi lahust
trikloroäädikhappega, mis ühtlasi inaktiveerib ensüümi ja peatab hüdrolüüsireaktsiooni. Siinkasutatav aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja sellele järgneval hüdrolüüsiproduktide sisalduse spektrofotomeetrilisel määramisel. Aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (Tyr, Phe, Trp) neeldumismaksimumid paiknevad lainepikkuse =280 nm piirkonnas. Valgu hüdrolüüsi produktide sisaldus avaldati türosiini mikromoolidena (1 µmol=0,181 mg). Aktiivsus väljendati 1 g ensüümi kohta. Töö käik Valmistati savinaasi (uuritav proteaas) lahus puhvris. Selleks kaaluti analüütilistel kaaludel 0,0049 g ensüümipreparaati ja viidi kvantitatiivselt 5 ml gradueeritud katseklaasi. Lisati väike kogus puhverlahust ja loksutati, kuni ensüüm lahustunud on. Seejärel täideti kolb puhverlahusega 5 ml märgini.
spektrofotomeetrilisel meetodil. Trikloroäädikhappe toimel sadenevad lahusest välja tervikvalgud ja kõrgmolekulaarsed peptiidid (Mr > 10000), samuti inaktiveerib TKÄ ensüümi ning peatab edasise hüdrolüüsi toimumise. Sademe eraldamise järel lahusesse jäävate vabade aminohapete ja madalmolekulaarsete peptiidide kontsentratsioon määratakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel spektrofotomeetriliselt (väljendatakse türosiini kontsentratsioonina mg/ml või µmol/ml) Töö käik Uuritavaks proteaasiks oli esperaas. Sellest valmistati töölahus kontsentratsiooniga 3-4 mg/ml. Analüütilistel kaaludel kaaluti 0,0203 g tahket ensüümpreparaati, viidi see gradueeritud katseklaasi, lisati puhverlahus (5 ml) ning segati klaaspulgaga, kuni ensüüm oli lahustunud. 50 ml katseklaasi pipeteeriti 25 ml 2% kaseiini lahust, katseklaas suleti korgiga ning asetati vesitermostaati 30 °C juurde 5-10 minutiks.
inaktiveerub ja peatab edasise hüdrolüüsi. Sademe eraldamise järel jäävad lahusesse vabad aminohapped ja peptiidid. Nende kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel: fenüülalaniin (Phe), türosiin (Tyr) ja trüptofaan (Trp). Nad omavad neeldumismaksimume lainepikkustel 270-280 nm ja on tänu sellele spektrofotomeetriliselt kenasti dekteeritavad. Kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldust väljendatakse aga siiski vaid türosiini kontsentratsioonina mg/mL olemasoleva kaliibrimissirge alusel. Töö käik Valmistan juhendaja näpunäidete järgi sobiva pH-ga esperaasi lahuse, kasutades lahustiks atsetaatpuhvrit. Optimaalne kontsentratsioon esperaasi jaok on 4 mg 1 ml puhvri kohta, seega pean 5 ml lahuse jaoks kaaluma 20 mg ehk 0,0200 g esperaasi analüütilisel kaalul. Seejärel lisan väikese koguse puhverlahust ja segan klaaspulgaga, kuni ensüüm on lahustunud (kuna preparaat
on nad spektrofotomeetriliselt hõlpsasti detekteeritavad. Reaktsioonisegust võetud proovides mõõtsin kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust ( = absorptsiooni = optilist tihedust, tähis A või D) uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorbtsioon on tingitus kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentratsioonia mg/ml või µmol/ml. Kasutasin olemasolevat kaliibrimissirget A versus CTyr leidsin absorbtsiooni väärtuse järgi türosiini kontsentratsiooni kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. 2. Töö käik 1.3 Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine Minu uuritav preparaat oli alkanaas. Valmistasin uuritavast preparaadist ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahus, milles ensüümi kontsentratsioon oli 1,5 mg/ml
· Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhin kaseiini hüdrolüüsil proteaasi toimel ja järgneval trikloorädikhappega mittesadeneva hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilise meetodi kasutades. · Aromaattuuma omavad aminohapped ( Tyr, Phe, Trp) omavad neeldumismaksimume UV- piirkonnas lainepikkusel 270-280 nm, siis väljendatakse kasieiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentatsioonina mg/ml ja kasutades kaliibrimisgraafikut leitakse absorbtsiooni väärtuse järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik. · Valmistame proteaasi preparaadist lahuse valmistamine.(Alkalaas) Peab olema sobiv pH (meie juhul aluliseline). Lahuse ensüümi kontsentratsioon on 1,6 mg/ml . Paneme gradueeritud katseklaasi 8 mg ensüümipreparaadi ja lisame puhverlahust 5 milliliitrini.
(Phe) omavad neeldumismaksimume UV- piirkonnas lainepikkustel 270280 nm ja tänu sellele on nad spektrofotomeetriliselt hõlpsasti detekteeritavad. Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetaksegi kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorbtsioon ( opiline tihedus, A) on tingitud kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentratsioonina mg /ml või mol /ml (1 mol = 181g = 0,181 mg). Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget A versus CTyr leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine Uuritavast proteaasi preparaadist (esperaas) valmistatakse ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahus, milles ensüümi kontsentratsioon on 4 mg/ml. Puhvri (boraatpuhver), lahuse
trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetaksegi kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust (= absorptsiooni = optilist tihedust, tähis A või D) uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorptsioon on tingitud kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentratsioonina mg /ml või mol /ml (1 mol = 181g = 0,181 mg). Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget A (D) versus CTyr leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik Kaalusin 0.005 g tahke proteaasi (amülaasi) preparaati, valasin selle gradueeritud katseklaasi ning lisasin vajaliku koguse puhvrit, et lahuse üldmaht oleks 5 ml Segasin lahust proteaasi lahustumiseks 5 minuti vältel.
Katseklaasid proovidega jätsin sademe täielikuks formeerumiseks 20-ks minutiks seisma. Sellel ajal panin valmis neli puhast ja kuiva katseklaasi koos lehtrite ja paberfiltritega. Järgmisena filtrisin proovid kuivadesse katseklaasidesse. Filtraat tuli täiesti selge ja läbipaistev. Siis määrasin spektrofotomeetril nende optilised tihedused lainepikkuse 280 nm juures. Vastavalt nendele väärtustele leidsin tabelist neis proovides sisalduvad türosiini kontsentratsioonid. Andmed kandsin allolevasse tabelisse: Optiline tihedus D280 Türosiini kontsentratsioon mg/ml I katseklaas (0-proov) 0,375 0,059 II katseklaas (1-proov) 0,477 0,076 III katseklaas(2-proov) 0,516 0,081 IV katseklaas (3-proov) 0,569 0,092
kindla lainepikkuseda valguskiirguse neelduvust uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorptsioon on tingitud kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentratsioonina mg/ml või mol/ml (1 mol = 181 g = 0,181 mg). Töö käik: Ensüümiprepadaadist töölahuse valmistamine Uuritavast proteaasi preparaadist valmistan lahus, milles ensüümi kontsentratsioon võrdub 1,5 mg/ml. Ensüümina kasutan savinaasi. Analüütilistel kaaludel kaalun 7,5 mg ensüümi. Minu kaalutis on 0,0081 g.
mõõdetakse kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust uuritavas lahuses. Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik: Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine · Uuritavast proteaasi preparaadist valmistatakse ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahus, milles ensüümi kontsentratsioon on vahemikus . · Arvutasin välja ensüümipreparaadi kaalutise suuruse.
peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel (nt türosiin, fenüülalaniin, trüptofaan). Neeldusmismaksimumid UV-piirkonnas asuvad lainepikkustel 270-280 nm, mistõttu on nad spektrofotomeetriliselt hõlpsasti detekteeritavad. Reaktsionisegu proovides mõõdetakse kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust ehk optilist tihedust (D)/absorptsiooni (A). Kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus väljendatakse türosiini kontsentratsioonina mg/ml või mikromooli/ml (1 mikromool = 181 mikrogrammmi = 0,181 mg), kuigi lahuses võib olla ka teisi aromaatse tuumaga aminohappeid. Antud kaliibrimissirge abil leitakse A väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik Töölahuse valmistamine: Valmistada uuritavast proteaasi preparaadist ensüümile sobiva pH-ga puhvris lahus, milles ensüümi kontsentratsioon on vahemikus 1-5 mg/ml
peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel (nt türosiin, fenüülalaniin, trüptofaan). Neeldusmismaksimumid UV-piirkonnas asuvad lainepikkustel 270-280 nm, mistõttu on nad spektrofotomeetriliselt hõlpsasti detekteeritavad. Reaktsionisegu proovides mõõdetakse kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust ehk optilist tihedust (D)/absorptsiooni (A). Kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus väljendatakse türosiini kontsentratsioonina mg/ml või mikromooli/ml (1 mikromool = 181 mikrogrammmi = 0,181 mg), kuigi lahuses võib olla ka teisi aromaatse tuumaga aminohappeid. Antud kaliibrimissirge abil leitakse A väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik Töölahuse valmistamine: Valmistada uuritavast proteaasi preparaadist ensüümile sobiva pH-ga puhvris lahus, milles ensüümi kontsentratsioon on vahemikus 1-5 mg/ml
· Sademe eraldamise järel jäävad lahusesse vabad amh-d ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni saab kaudselt iseloomustada aromaatset tuuma sisaldavate amh-te sisalduse alusel Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped: 1. Tyr (türosiin) 2. Trp (trüptofaan) 3. Phe (fenüülalaniin) Kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldust väjendatakse türosiini kontsentratsioonina mg/ml või mol/ml (1 mol= 181 g=0,181 mg). Kui kasutada kaliibrimissirget A vs CTyr leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. 3.2.2 Töö käik ENSÜÜMPREPARAADIST TÖÖLAHUSE VALMISTAMINE: 1. Valmista uuritavast protaasi preparaadist (ALKALAAS) ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahus. NB! Ensüümi kontsentratsioon olgu vahemikus 1-5 mg/ml 2
trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetaksegi kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust (= absorptsiooni = optilist tihedust, tähis A või D) uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorptsioon on tingitud kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentratsioonina mg /ml või mol /ml (1 mol = 181g = 0,181 mg). Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget A (D) versus CTyr leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik Kaalusin 0.02 g tahke proteaasi (esperaas) preparaati, valasin selle gradueeritud katseklaasi ning lisasin vajaliku koguse puhvrit, et lahuse üldmaht oleks 5 ml. Segasin lahust proteaasi lahustumiseks 5 minuti vältel.
vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse kaudu. Aromaatse tuumaga aminohapped türosiin, trüptofaan ja fenüülalaniin omavad neeldumismaksimume UV-piirkonnas lainepikkustel 270-280 nm ja seetõttu saab neid hästi detekteerida spektrofotomeetriliselt. Proovides mõõdetakse kindlal lainepikkusega valguskiirguse neelduvust. Kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus väljendatakse türosiini kontsentratsioonina mg/ml. Kasutades kaliibrimissirget saadakse optiliste tiheduste kaudu türosiini kontsentratsioon kindlatel ajahetkedel reaktsioonisegust võetud proovidel. 2. Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine Uuritavast proteaasi preparaadist, milleks antud töös oli savinaas, valmistati ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahus, mille kontsentratsioon oli 1,5 mg/ml. Arvutasin savinaasi kaalutise suuruse, milleks oli 0,0075 grammi
katseklaasi, kus oli TKÄ lahus ja loksutasin ja nii neli korda. 5. Lasin proovidel seista ja seejärel filtrisin kõik neli proovi puhastesse katseklaasidesse. 6. Määrasin spektromeetril nende optilised tihedused. Proovide optilised tihedused: D0 = 0,386 A D1 = 0,561 A D 2 = 0,853 A D3 = 1,156 A Aromaatset tuuma sisaldavad aminohaooed on tänu 280nm piirkonnas paiknevate neeldumismaksimumide spektrofotomeetriliselt detekteeritavad. Hüdrolüüsi produktide sisaldus avaldatakse türosiini mikromoolidena. Õppejõult saadud kaliibrimisgraafiku alusel sain türosiini kontsentratsiooniks: C 0 =0,06 mg/ml 0s C1 =0,09 mg/ml 300s C 2 =0,1370mg/ml 600s C 3 =0,1840mg/ml 900s Arvutan preparaadi proteolüütilise aktiivsuse vastavalt järgmisele valemile: C 10 3 V1 2 V 2 A= t 181 V3 g Kus: C - türosiini kontsentratsiooni muutus mg/ml: 0,1840-0,098=0,086mg/ml
Filtrisin proovid kuivadesse katseklaasidesse, teades, et filtrile jäänud sade pole vajalik. Saadud filtraadid olid täiesti selged (kui nad seda poleks olnud, oleks tulnud uuesti filtrida). Määrasin spektrofotomeetril nelja, erineval ajal reaktsioonisegust võetud proovi optilise tiheduse väärtused lainepikkusel = 280 nm (D280), kasutades selleks 1 cm läbimõõduga kvartsküvette. Leidsin kaliibrimisgraafikult vastavalt proovide optilise tiheduse väärtustele D280 neis sisalduva türosiini kontsentratsiooni ning saadud katseandmete põhjal koostasin graafiku, mis väljendab türosiini kontsentratsiooni ja reaktsiooni kestvuse vahelist sõltuvust CTyr = f(t). Tabel . Katsetulemused Joonis . Türosiini kontsentratsiooni ja reaktsiooni kiiruse vaheline sõltuvus, CTyr = f(t) Arvutasin ensüümipreparaadi proteolüütilise aktiivsuse A (kat/g) vastavalt valemile: kus: C(Tyr) türosiini kontsentratsiooni muutus valitud ajavahemikus, mg/ml
määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. TKÄ (5%) lisamisel peatatakse edasine hüdrolüüs ja tervikvalgud ning peptiidid,mille Mr>10 000 sadestuvad. Sademe eraldamisel jäävad lahusesse vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse aromaatsete tuumade sisalduse järgi, mis on spektrofotomeetiliselt hõlpsasti detekteeritavad. Saadakse kätte türosiini sisaldus erinevatel aegadel võetud proovidest. Töö käik Alkalaasi preparaadist valmistati boraatpuhvris, mille pH=8,4, lahus, lisades 0,01g alkalaasile 5ml boraatpuhvrit. Lahust segati klaaspulgaga kuni alkalaas lahustus. 50ml katseklaasi pipeteeriti 25ml 2%-list kaseiini lahust ja asetati vesitermostaati 30-kraadi juurde 10 minutiks. Samal ajal valmistati ette 4 katseklaasi, pipeteerides igaühte 3ml TKÄ lahust (5%).
Osaleb ka rasvhapete ainevahetuses ning aitab lõhustada rasvasid maksas ja veresoonestikus, mis kergendab vere ringlemist elundite vahel ning kaitseb sedasi veresoonkonnahaiguste eest. Metioniin vähendab stressi ning aitab vältida nõrkust ja väsimust. Samuti on vajalik karnitiini tootmiseks organismis. Veel hoolitseb juuste, naha ja küünte heaolu eest. Fenüülalaniin Fenüülalaniin on asendatava aminohappe türosiini eelühend. Türosiini kasutatakse meeleolu ja ainevahetust mõjutavate tähtsate hormoonide sünteesis. Fenüülalaniini ülesanded on seetõttu sarnased türosiini omadega, kuid eelkõige tuntakse teda fenüülketonuuria nimelise päriliku haiguse tõttu, mille korral aminohape ei lagune normaalselt ja põhjustab haigele psüühikahäireid, kui just fenüülalaniini sisaldust toidus ei piirata oluliselt. Nende haigete jaoks on türosiin asendamatu aminohape. Muidu on fenüülalaniin oluline
2) Teine katseklaas- 8-ndal minutil võetud proov 0,198 ABS 3) Kolmas katseklaas 13-ndal minutil võetud proov 0,220 ABS 4) Neljas katseklaas 18-ndal minutil võetud proov 0,222 ABS (See tulemus ei võtta arvesse,sest see ei ole täpne ja tõenäoline.Selline tulemus tuli välja,sest katseklaasi oli valatud liiga suur või liiga väike kogus reaktsioonisegu,või pärast kolmanda proovi võttmist on möödunud vähe aega.) Türosiini kontsentratsioon graafiku alusel (mg/ml): 1) 0,028 mg/ml 2) 0,032 mg/ml 3) 0,035 mg/ml 4) 0,037 mg/ml( ei võtta arvesse) Graafik: Ensüümipreparaadi proteolüütilise aktiivsuse arvutamine A = CTyr · 103 · V1 · V2 · 2 / t · 181 · V3 · g CTyr türosiini kontsentratsiooni muutus valitud ajavahemikus (mg/ml), t hüdrolüüsi kestus st valitud ajavahemik (s), V1 reaktsioonisegu (substraat + ensüüm) üldmaht (ml),
neutraalseid (pH~7,2), leelisproteaase (pH~9). Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsi uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega mittesadenevaid hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilistel meetoditel. Reaktsioonil võetud proovides mõõdetakse kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust uuritavas lahuses. Kasutades olemasolevaid kalibrimissirgeid leitakse absorbtsiooni väärtuse järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine · Pidin valmistama 5 mL lahust kontsentratsiooniga 1,5 mg/mL. Minu poolt uuritavaks proteaasi preparaadiks oli Alcalase. Kaalusin analüütilisel kaalul 7,1 mg uuritavat proteaasi ja viisin selle kvantitatiivselt gradueeritud katseklaasi. Järgnevalt lisasin uuritavale ainele boraatpuhvrit (pH=8,4), esialgu väiksema koguse.
eraldamisel jäävad lahusesse alles aga vabad aminohapped ning madalmolekulaarsed peptiidid nende kontsentratsioon määratakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse algusel. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped nagu Tyr, Trp ja Phe omavad neeldumismaksimume UV-piirkonnas lainepikkusel 270-280 nm ning selle tõttu on nad kergesti tuvastatavad spektrofotomeetriliselt. Antud katses väljendatakse kaseiini hüdrolüüsiproduktide sisaldus türosiini kontsentratsiooniga. Kasutades kaliibrimissirget, leitakse absorbtsiooni väärtuse järgi türosiini kontsentratsioon. Töö käik Ensüümpreparaadist töölahuse valmistamine Valmistada proteaasi preparaadist sobiva pH väärtusega puhvris lahus, ensüümi (antud juhul alkalaas) kontsentratsioon peaks olema lahuses 1-5 mg/ml, antud katses oli ensüümi kontsentratsiooniks 1,56 mg/ml (kaalutis 7,8mg). Kui ensüümpreparaadile on väike kogus
ning filterpaberitega. Proovid filtritakse kuivadesse katseklaasidesse. Filtrile jäänud sade pole vajalik. Filtraadid peavad aga olema täiesti selged. Seejärel määratalse spektrofotomeetril nende optiliste tiheduse väärtused (D280), kasutades 1 cm läbimõõduga kvartskvürette. Katseandmed ja nende töötlus: D0 = 0,733 A D1 = 0,569 A D2 = 0,587 A D3 = 0,644 A Õppejõult saadud kaliibrimisgraafiku alusel saan türosiini kontsentratsiooniks: C0 = ei määranud, kuna mõõtmis tulemus ei sobinud, st 0-proovi optiline tihedus oleks pidanud väiksem olema kui I proovi oma. C1 = 0,091 mg/ml C2 = 0,094 mg/ml C3 = 0,12 mg/ml Saadud andmete alusel koostan graafiku: türosiini kontsentratsioon (C) aeg (t). Arvutan preparaadi proteolüütilise aktiivsuse vastavalt järgmisele valemile: A = C * V1 * 2 * 103 * V2 t * 181 * g * V3
trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetaksegi kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorptsioon on tingitud kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentratsioonina mg /ml või mol /ml (1 mol = 181g = 0,181 mg). Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget A (D) versus CTyr leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik · Kaalusin 0.0076 g tahke proteaasi (alealase) preparaati, valasin selle gradueeritud katseklaasi ning lisasin vajaliku koguse puhvrit, et lahuse üldmaht oleks 5 ml. Segasin lahust proteaasi lahustumiseks
kõigi nelja proovi optiliste tiheduste vahe olema (enam-vähem) võrdne. Esimese katseklaasi viga võis seisneda selles, et pärast reaktsioonisegu valmimist ei segatud seda piisavalt. Graafiku tegemisel kasutan kolme järgmist tulemust: 0.05 0.05 0.04 f(x) = 0x + 0.02 0.04 0.03 0.03 Türosiini kontsentratsioon 0.02 0.02 0.01 0.01 0 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Aeg, s Arvutused Valem: CTyr 103 V 1 V2 2 A t 181 V 3 g
pärast. 5. Kui kõik neli TKÄga katseklaasi olid täidetud hüdrolüüsi seguga jätsime need sadestuma 15neks minutiks. Selle ajal valistasime 4 tühja varustatud lehtritega ja filtripaberitega katseklaasi. 6. Filtrisime lahused ära ja saadud läbipaistvatel filtraatidel mõõtsime optilise tiheduse fotospektromeetril laine pikusel 280,0 nm. 4. Arvud ja arvutused: Leiame optiliste tiheduste abil kaliibrimis graafikult türosiini kontsentratsioonid. Siis tehakse graafiku Türosiini konts. aeg. Ja veel lisaks arvutatakse kontsentratsiooni vastavalt valemile: A = delta C x 103 x V1 x 2 x V2 / delta T x 181 x V3 x g deltaC - turosiini kontsentratsiooni muutus mg/ml delta T - hudroluusi kestus s V1 - hudroluusisegu uldmaht ml 2 - TKÄ lahusest tingitud lahjendus V2 - ensuumilahuse uldmaht
Reaktsioonisegu asetasin tagasi termostaati. 6. 5 minuti ja 45 sek pärast võtsin sama pipetiga 3 ml reaktsioonisegu teise katseklaasi ja loksutasin. Samas asja kordasin veel kaks korda 5-minutiliste intervallidega. 7. Jätsin proovid settima 15 minutiks ning filtreerisin iga proovi ümber. 8. Spektrofotomeetril mõõtsin proovide optiliste tiheduste väärtused lainepikkusel = 280 nm. Saadud tulemused, koos optilisele tihedusele vastavate türosiini sisaldustega on alljärgnevas graafikus: Optiline tihedus, Türosiini A sisaldus, mg/ml Aeg, sek 0,210 0,033 0 0,280 0,045 345 0,361 0,057 645 0,426 0,067 945 Ensüümipreparaadi proteolüütilise aktiivsuse leian alljärgneva valemiga: CTyr = 0,067 0,045 = 0,022
oranzi värvuse. Töö käik:1 ml munavalgu lahusele lisada 6 tilka kontsentreeritud HNO3. Loksutada, soojendada, kuni sade on kollane. Jahutada. Lisada NH4OH lahust kuni ilmub ammoniaagi lõhn. Tulemus: Valge sade muutus soojendades kollaseks. NH4OH lisades muutus sade oranzikaks. Katse tõestas, et munavalk sisaldab aromaatset tuuma sisaldavaid aminohappeid. 1.1.3 Milloni reaktsioon Milloni reaktiiviga reageerivad fenoolset hüdroksüülrühma sisaldavad ühendid(türosiini radikaalid). Valgu lahus või sade värvub soojendamisel roosakaks või punaseks. 1. katseklaas 2. katseklaas Töö käik: Võetakse 1 ml munavalgu lahust ja Töö käik: Võetakse 1 ml zelatiini lahust ja lisatakse 6 tilka Milloni reaktiivi. lisatakse 6 tilka Milloni reaktiivi. Reaktsioonisegu soojendatakse. Reaktsioonisegu soojendatakse.
D280;2=0,154 D280;3=0,219 D280;4=0,269 CTyr;1=0,024 M CTyr;2=0,025 M CTyr;3=0,034 M CTyr;4=0,043 M Esimeses katseklaasis saadud tulemus ei saanud õige olla. Nimelt oleks pidanud kõigi nelja proovi optiliste tiheduste vahe olema (enam-vähem) võrdne. Esimese katseklaasi viga võis seisneda selles, et pärast reaktsioonisegu valmimist ei segatud seda piisavalt. Graafiku tegemisel kasutan kolme järgmist tulemust: Arvutused Valem: CTyr 103 V1 V2 2 A= t 181 V3 g CTyr türosiini kontsentratsiooni muutus valitud ajavahemikus (mg/ml) t hüdrolüüsi kestus (s) V1 reaktsioonisegu üldmaht (26 ml) V2 valmistatud ensüümilahuse üldmaht (10 ml) 2 TKÄ lahusest tingitud proovi lahjendus (3 ml 6 ml, seega L=2) V3 ensüümi math hüdrolüüsisegus (1 ml) g proteaasi (alkalaas) preparaadi kaalutis (12 mg = 0,012 g) 181 türosiini molekulmass (0, 043 - 0, 025)mg / ml 103 26ml 10ml 2 0, 018mg / ml 103 26ml 10ml 2
Järeldus: Helekollase sademe teke näitab aromaatsete tuumade nitreerumist, on tekkinud nitrofenooli tüüpi ühend. Leeliselises keskkonnas on see oranz. Võime järeldada, et munavalgu lahus sisaldas aromaatseid tuumi sisaldavaid aminohappeid. 1.1.3 Milloni reaktsioon Milloni reaktiiv on elavhõbe(II) nitraadi lahus lämmastikhappes vähese NaNO2 lisandiga. Milloni reaktiiviga reageerivad fenoolset hüdroksüülrühma sisaldavad ühendid, valkude puhul türosiini radikaalid. Türosiini olemasolul valgu koostises värvub valgu lahus või sade roosakaks kuni punaseks. Töö käik: Ühte katseklaasi valasin 1 ml munavalgu lahust ja teise 1 ml zelatiini lahust. Lisasin mõlemasse 6 tilka Milloni reaktiivi ning soojendasin segusid vesivannis. Tulemus: Milloni reaktiivi lisamisel tekkis munavalgulahuses sade, zelatiinilahuses mitte. Soojendamisel värvus munavalgu lahuses olev sade roosakaks, zelatiinilahusega ei toimunud muutuseid.
Segu jahutatakse, lisatakse NH3H2O lahust ammoniaagi lõhna ilmumiseni ja loksutatakse. Kollane sade muutub oranziks. Järeldus Mulderi reaktsioonis tekkisid nitrofenoolid, see tõestab aromaatsete aminohapete olemasolu munavalgus. 1.1.3. Milloni reaktsioon Kasutatakse Milloni reaktiivi, mis on elavhõbe(II)nitraadi lahus lämmastikhappes vähese NaNO2 lisandiga. Milloni reaktiiviga reageerivad fenoolset hüdroksüülrühma sisaldavad ühendid ehk türosiini (Tyr) radikaalid. Positiivse Milloni reaktsiooni korral lahus või denatureerunud valgu sade värvuvad soojendamisel roosakaks kuni tume(telliskivi)-punaseks. Töö käik Võetakse 2 katseklaasi, ühte valatakse 1ml munavalgu lahust, teise 1ml zelatiini lahust. Mõlemasse katseklaasi lisatakse 5-6 tilka Milloni reaktiivi. Segu soojendatakse 40-50 kraadini. Zelatiinis denatureerunud valku sademena ei teki, munavalgus tekkis roosa sade. Järeldus
lisamisel, mis tekitab leelise keskkonna, omandab segu intensiivsema värvuse, lõpuks muutub see oranžiks Järeldus: Munavalgu lahuses olid aromaatsete tuumadega aminohapped. 1.1.3 Millioni reaktsioon Reaktsiooni läbiviimiseks kasutatakse Milloni reaktiivi, mis kujutab endast elavhõbe(II)nitraadi lahust lämmastikhappes vähese NaNO2 lisandiga Reaktsioonidega saab kindlaks teha fenoolset hüdroksüülrühma sisaldavate aminohapete sisaldumist, seega valkude puhul türosiini (Tyr) radikaalid. Positiivse Millioni reaktsiooni annab enamik valke, denatureerunud valgu sade värvub roosakaks. Töö käik: Võtame kaks katseklaasi, ühte neist valatakse 1 ml munavalgu lahust, teise 1 ml želatiini lahust. Mõlemasse katseklaasi lisame 5–6 tilka Milloni reaktiivi. Reaktsioonisegu soojendame 40–50°C-ni. 3 Tulemus: Lisades munavalgu lahusele Milloni reaktiivi esialgu tekib valge sade ning pärast
südamele ja veresoonkonnale. Šokolaad sisaldab antioksüdante (alagrupp- polüfenoole), mis kaitsevad südant ja veresoonkonda, kaitsevad keharakke vabade radikaalide kahjulike mõju eest, aitavad vähendada mälukaotuse, kasvajate, silmakahjustuste, Alzheimeri tõve, parkinsonismi ja veel mitmete tõsiste tervisehäirete tekkimise ohtu. Viimaste aastate uuringud on tõestanud ka, et šokolaad ei tekita aknet ega hambakaariest. Šokolaadis on leitud meeleolutõstjat türosiini, mis alandab vererõhku, stabiliseerib veresuhkru taset ning aktiviseerib kilpnääret, kiirendades nõnda ainevahetust ja alandades kehakaalu. Türosiin on lisaks ka üheks lähteaineks „õnnehormooni” ehk serotoniini tekkimisele organismis (serotoniin reguleerib und, pärsib näljatunnet, väldib meeleolu kõikumisi, kontrollib söömisel õigeaegselt küllustunde tekkimist ja teeb reipamaks). Kõige puhtamas ja järelikult ka kõige kõrgema
vitamiini sünteesi. C-vitamiinid ❏ rasvhapete ja A-, D-, E-, B1-, B2-vitamiinide oksüdatsiooni vähendamiseks ning kaitsmaks valke, rasvu, süsivesikuid ja nukleiinhappeid (RNA, DNA) vabade radikaalide kahjuliku toime eest, ❏ organismi vastupanuvõime tõstmiseks, kevadväsimuse ja stressi peletamiseks, ❏ ühendavate kudede moodustamiseks nahas ja luudes, mis aitab säilitada veresoonte elastsust, ❏ aminohapete (fenüülalaniini, türosiini) ainevahetuses, ❏ vähendamaks nitrosoamiinide teket, ❏ foolhappe ja B12-vitamiini ainevahetuseks, ❏ aju normaalseks funktsioneerimiseks, ❏ vere kolesteroolitaseme tasakaalustamiseks, ❏ luude vastupidavuse, tervete hammaste ja igemete tagamiseks, ❏ raua omastumise suurendamiseks teraviljatoodetest. ❏ Parimateks C-vitamiini allikateks on marjad, puu- ja köögiviljad, nt mustsõstrad, astelpaju, kiivi, paprika, tsitruselised, kaalikas ja kartul.
Sellest võime järeldada, et munavalgus lahus sisaldas aromaatseid tuumi sisaldavaid aminohappeid, nagu türosiin, trüptofaan, fenüülalaniin. 1.1.3.Milloni reaktsioon Teoreetilised alused Reaktsiooni läbiviimiseks kasutatakse Millioni reaktiivi, mis kujutab endast elavhõbe(II)nitraadi lahust lämmastikhappes vähese NaNO2 lisandiga. Millioni reaktiividega reageerivad fenoolset tüüpi hüdroksüülrühma sisaldavad ühendid, valkude puhul türosiini radikaalid. Türosiini olemasolul valgu koostises värvus lahus või sade roosakas kuni tumepunaseks. Reaktsioonivõrrandist pilt biokeemia laboratoorsete tööde juhendist Töö käik Ühte katseklaasi valasin 1 ml munavalgu lahust ja teise sama kogus želatiini lahust. Lisasin mõlemasse katseklaasi 6 tilka Millioni reaktiivi ning soojendasin segusid vesivannil. Tulemus Munavalgu lahus muutus koheselt ähmaseks. Kuumutamise ajal hakkas värvus põhjast muutuma roosakaks
Selle lahuse soojendamisel toimub aromaatsete tuumade nitreerumine, mis tekitab kollase värvuse ja aluselise lahuse lisamisel muutub see oranziks, sest nitrofenool käitub leeliselises keskkonnas kui hape. Struktuurid? 1.1.3 Milloni reaktsioon Reaktsiooni läbiviimiseks kasutatakse Milloni reaktiivi, mis kujutab endast elavhõbe(II)nitraadi lahust lämmastikhappes vähese NaNO2 lisandiga. Milloni reaktiiviga reageerivad fenoolset hüdroksüülrühma sisaldavad ühendid (türosiini radikaalid). Töö käik: Võtame kaks katseklaasi, ühte neist valatakse 1 ml munavalgu lahust, teise 1 ml zelatiini lahust. Mõlemasse katseklaasi lisame 56 tilka Milloni reaktiivi. Reaktsioonisegu soojendame 4050°C-ni. Tulemus: Lisades munavalgu lahusele Milloni reaktiivi esialgu tekib valge sade ning pärast soojendamist muutub valgu sade roosakaks. Millise struktuuriga ühend tekib? Milloni
Segu jahutamisel ja ammooniumhüdroksiidi lahuse lisamisel leeliselise keskkonna loomiseks omandas segu oranzi värvuse, mis on tingitud nitrofenool tüüpi ühendi hape/alus indikaatoriks olemisest. Katse tõestas, et munavalk sisaldab aromaatsed tuumi omavaid aminohappeid. 1.1.3 Milloni reaktsioon Töö teoreetilised alused: Töö eesmärgiks oli tõestada, et valk sisaldab fenoolset hüdroksüülrühma, ehk türosiini (Tyr). Milloni reaktsiooni põhimõte seisneb Milloni reaktiivi, milleks on elavhõbe(II)nitraadi lahus lämmastikhappes vähese NaNO2 lisandiga, reageerimisel fenoolse hüdroksüülrühmaga. Valgu denatureerunud sade värvub soojendamisel punakaks. Töö käik: 1) Võtsin 2 katseklaasi, ühte valasin 1 ml munavalgu lahust, teise 1 ml zelatiinilahust. 2) Mõlemasse katseklaasi lisasin 5 tilka Milloni reaktiivi. 3) Soojendasin reaktsioonisegusid 40-50°C.
C -vitamiin - askorbiinhape C-vitamiini on vaja: · rasvhapete ja A-, D-, E-, B1-, B2-vitamiinide oksüdatsiooni vähendamiseks ning kaitsmaks valke, rasvu, süsivesikuid ja nukleiinhappeid (RNA, DNA) vabade radikaalide kahjuliku toime eest, · organismi vastupanuvõime tõstmiseks, kevadväsimuse ja stressi peletamiseks, · ühendavate kudede moodustamiseks nahas ja luudes, mis aitab säilitada veresoonte elastsust, · aminohapete (fenüülalaniini, türosiini) ainevahetuses, · vähendamaks nitrosoamiinide teket, · foolhappe ja B12-vitamiini ainevahetuseks, · aju normaalseks funktsioneerimiseks, · steroidhormoonide sünteesi mõjutamiseks ja sapphappe tekkimiseks kolesteroolist ning vere kolesteroolitaseme tasakaalustamiseks, · luude vastupidavuse, tervete hammaste ja igemete tagamiseks, · raua omastumise suurendamiseks teraviljatoodetest. C-vitamiini saadakse: · puu- ja köögiviljadest · marjadest
kuumutamisel värvuselt punakaks. Töö käik Valasin katseklaasi 1ml munavalgu lahust, teise 1ml zelatiini lahust. Mõlemasse katseklaasi lisasin 5 tilka Miloni reaktiivi ning soojendatakse. Munavalgu lahus muutus värvuselt punaseks, mis tõestas, et munavalgus on aromaatsete tuumadega aminohappeid. Zelatiini lahuses aga ei toimunud mingeid värvi muutuseid, mistõttu võib öelda, et sealt puuduvad türosiini radikaalid. Järelikult on see katse sobiv selgitamaks, kas valgu lahuses leidub türosiini radikaale. Sulfhüdrolüüsireaktsioon (tioolreaktsioon) Tõestab SH rühma olemasolu valkudes. Leeliselises keskkonnas ja Pb++ juuresolekul ning lahuse kuumutamisel tekib must/tumepruun sade kui valgu lahuses on SH ioone. Töö käik Valasin katseklaasi 1ml Pb(CH3COO)2 O,5% lahust, millele lisasin tilgakaupa 20% NaOH lahust kuni sademe tekkmiseni. Lisasin 0,5ml munavalgu lahust ning keetsin vesivannil. Tekkis pruun kolloidne sade, mis näitab tsüstesiini sisaldust valgus
kehavõõraste ühendite detoksikatsioonil jne). Metioniin on veel tsüsteiini ja meile vähemtuntud ning valkude koostises mitteesinevate aminohapete karnitiini ja tauriini (vt. allpool) eelühendiks. Trüptofaan on asendamatu aminohape, mis on näiteks vitamiini niatsiin ning neuroülekandeaine serotoniini eelühend. Fenüülalaniin on asendamatu aminohape ning ta on aminohappe türosiin eelühend. Kui organism saab piisavalt türosiini, pole fenüülalaniini vajadus eriti akuutne. Türosiini vajatakse muuhulgas ka türoksiini ja adrenaliini (need on hormoonid!) ning pigmendi melaniin sünteesiks. Valiin, leutsiin, isoleutsiin on kõik asendamatud aminohapped. Et nende radikaal on hargnenud, rühmitatakse neid tavaliselt hargnenud külgahelaga aminohapete hulka. Neid aminohappeid kasutatakse traumade ja mõningate raskete haiguste ravis. Raviefekti on saadud ka neerupuudulikkuse ja maksahaiguste puhul. Sellealased uuringud jätkuvad. Lüsiin on asendamatu aminohape
Järeldus: Segu värvus tumekollaseks värvuseks pärast NH 4OH lahuse lisamist, enne soojendamist oli helekollane. Segu käitub hape/alus indikaatorina, omandades leeliselises keskkonnas oranži värvuse. 1.1.3 Milloni reaktsioon Reaktsioonis kasutatakse Milloni reaktiivi, mis kujutab endast elavhõbe(II)nitraadi lahust lämmastikhappes vähese NaNO2 lisandiga. Milloni reaktiiviga reageerivad fenoolset hüdroksüülrühma sisaldavad ühendid, seega valkude puhul türosiini (Tyr) radikaalid. Kuna türosiin esineb enamiku valkude koostises, siis suurem osa valkudest annab positiivse Milloni reaktsiooni, mille puhul valgu lahus või denatureerunud valgu sade värvuvad soojendamisel roosakaks kuni tume(telliskivi)- punaseks. Töö käik: Võetakse kaks katseklaasi, ühte neist valatakse 1 ml munavalgu lahust, teise 1 ml želatiini lahust. Katseklaasidesse lisatakse 5–6 tilka Milloni reaktiivi. Reaktsioonisegud soojendatakse.
Järeldus: Segu värvus tumekollaseks värvuseks pärast NH 4OH lahuse lisamist, enne soojendamist oli helekollane. Segu käitub hape/alus indikaatorina, omandades leeliselises keskkonnas oranzi värvuse. 1.1.3 Milloni reaktsioon Reaktsioonis kasutatakse Milloni reaktiivi, mis kujutab endast elavhõbe(II)nitraadi lahust lämmastikhappes vähese NaNO2 lisandiga. Milloni reaktiiviga reageerivad fenoolset hüdroksüülrühma sisaldavad ühendid, seega valkude puhul türosiini (Tyr) radikaalid. Kuna türosiin esineb enamiku valkude koostises, siis suurem osa valkudest annab positiivse Milloni reaktsiooni, mille puhul valgu lahus või denatureerunud valgu sade värvuvad soojendamisel roosakaks kuni tume(telliskivi)- punaseks. Töö käik: Võetakse kaks katseklaasi, ühte neist valatakse 1 ml munavalgu lahust, teise 1 ml zelatiini lahust. Katseklaasidesse lisatakse 56 tilka Milloni reaktiivi. Reaktsioonisegud soojendatakse.
NH4OH lahust ja loksutan lahust. Järeldus Lahus värvus küll kollaseks, mis tõestab aromaatset tuuma, kuid ammooniumhüdroksiidi lisamisel ei värvunud oranziks. Selle põhjuseks võis olla vähene ammooniumhüdroksiidi lisamine, mille tagajärjel ei tekkinud piisavalt aluseline keskkond. 1.1.3.Milloni reaktsioon Milloni reaktiiviga (elavhõbe(II)nitraadi lahus lämmastikhappes vähese NaNO 2 lisandiga) reageerivad fenoolset hüdroksüülrühma sisaldavad ühendid (türosiini radikaalid). Positiivse Milloni reaktsiooni korral värvub lahus või denatureerunud valgu sade roosakaks kuni telliskivipunaseks. Töö käik Valan ühte katseklaasi 1 ml munavalgu lahust ja teise 1 ml zelatiini lahust. Mõlemasse katseklaasi lisan 5-6 tilka Milloni reaktiivi ja soojendan segu 40-50 oC- ni. Järeldus Munavalgu lahuses tekkis paksem roosakas sade, seega sadestus denatureerunud türosiin välja. Zelatiini lahus värvus roosakaks, türosiin ei sadestunud välja
tõestab ammoniagi eraldamine. Parandage ära. Ammooniumhüdroksiidi tuli lisada, mitte ei eraldunud. Kollase värvuse tumeduse muutumuisest tuleb teha järeldus keskkonna pH kohta ja kas tekkinud ühend käitub pH-indikaatorina. See reaktsioon tõestas aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete olemasolu valgus. 1.1.3 Milloni reaktsioon Kvalitatiivne reaktrsioon. Milloni reaktiiviga reageerivad fenoolset hüdroksüülrühma sisaldavad ühendid, seega valkude puhul türosiini (Tyr) radikaalid. Kasutatud ained: 1 ml munavalgu lahust, 1 ml zelatiini lahust 5-6 tilka Milloni reaktiivi (Hg(NO3)2+ HNO3 ) Töö käik: Paneme ühte katseklaasi 1 ml munavalgu lahust, teise 1 ml zelatiini lahust. Mõlemasse katseklaasi 5-6 tilka Milloni reaktiivi (Hg(NO 3)2+ HNO3 ) Tekkis valge sade, mis soojendamisel muutus punaseks. Milloni reaktiiviga reageerivad aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped
Järeldus: Alguses oli lahus helekollane, pärast tumekollane. Kollaseks värvus nitrofenooli tüüpi ühend, mis käitub hape-alus indikaatorina ja omandab aluselises keskkonnas oranzi värvuse. Järelikult leidus valgus aromaatset tuuma sisaldavaid aminohappeid. 1.1.3 Milloni reaktsioon Milloni reaktiivi on elavhõbe(II)nitraadi lahus lämmastikhappes vähese NaNO 2 lisandiga. Milloni reaktiiviga reageerivad fenoolset hüdroksüülrühma sisaldavad ühendid (nt Tyr radikaalid. Türosiini leidub enamikes valkudes ning seega toimub nendega Milloni reaktsioon, mille puhul lahus sade valgulahuses värvuvad soojendamisel roosakaks kuni tume(telliskivi)- punaseks. Töö käik: Ühte katseklaasi valatakse 1 ml munavalgu lahust, teise 1 ml zelatiini lahust. Mõlemasse katseklaasi lisatakse 56 tilka Milloni reaktiivi. Reaktsioonisegu soojendatakse. Järeldus: Munavalgu lahus sisaldab Türosiini radikaale, sest lahus värvus soojendamisel roosaks. 1.1
Ammoniaagi lisamisel värvus sade tumedamaks erksaks päikesekollaseks- järelikult täitis nitrofenooli ühend oma hape/alus indikaatori ülesannet värvudes aluselises keskkonnas tumekollaseks-oranziks. 1.1.3 Milloni reaktsioon Reaktsiooni jaoks on vaja kasutada Milloni reaktiivi, mis kujutab endast elavhõbe(II)nitraadi lahust lämmastikhappes vähese NaNO2 lisandiga. Selle reaktiiviga reageerivad fenoolset hüdroksüülrühma sisaldavad ühendid, valkude puhul türosiini radikaalid. Türosiini esineb enamus valkude koostises, suurem osa valke annab positiivse reaktsiooni. Positiivses reaktsioonis värvub valgu sade või lahus soojendamisel roosaks kuni telliskivi punaseks. Töö käik: Vaja on kaks katseklaasi. Ühte katseklaasi valasin u. 1ml munavalgu lahust, teise u. 1ml zelatiini lahust. Mõlemasse katseklaasi lisasin 5 tilka Milloni reaktiivi (munavalgu lahuses tekkis sade) ning soojendasin mõlemat katseklaasi vesivannis. Soojendamise käigus zelatiini
annaabi.ee 
