Proteaasi aktiivsuse määramine (0)

Töö 3.2
PROTEAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE
Marilin Karu
142627YAGB22
Juhendaja : Malle Kreen

Töö teoreetilised alused

Proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides.
E + S = ES = EP -> E + P
Töös kasutati proteaasi alkalaas , mis lagundab valkudes praktiliselt kõiki peptiidsidemeid, saades vabu aminohappeid. Alkalaas kuulub endopeptisaaside rühma. Alkalaasi aktiivsuse määramine toimus pH=8,4 juures (boraatpuhvri pH=8,4), mis tähendas, et tegu oli leelisproteaasiga.
Substraadiks kasutati kaseiini (2%). See on piima põhivalk, koostiselt fosfoproteiin.
Proteaasi aktiivsust määratakse meetodiga, mis põhineb kaseiini hüdrolüüsil alkalaasi toimel ja järgneval TKÄ-ga (trikloroäädikhappega) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. TKÄ (5%) lisamisel peatatakse edasine hüdrolüüs ja tervikvalgud ning peptiidid ,mille Mr>10 000 sadestuvad. Sademe eraldamisel jäävad lahusesse vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse aromaatsete tuumade sisalduse järgi, mis on spektrofotomeetiliselt hõlpsasti detekteeritavad. Saadakse kätte türosiini sisaldus erinevatel aegadel võetud proovidest.

Töö käik

Alkalaasi preparaadist valmistati boraatpuhvris, mille pH=8,4, lahus, lisades 0,01g alkalaasile 5ml boraatpuhvrit. Lahust segati klaaspulgaga kuni alkalaas lahustus.
50ml katseklaasi pipeteeriti 25ml 2%-list kaseiini lahust ja asetati vesitermostaati 30-kraadi juurde 10 minutiks. Samal ajal valmistati ette 4 katseklaasi, pipeteerides igaühte 3ml TKÄ lahust (5%).
Pärast kaseiini soojendamist pipeteeriti kaseiinile juurde 1ml valmistatud alkalaasi töölahust, segu loksutati kiiresti läbi, fikseeriti aeg, võeti kuiva pipetiga 3ml reaktsioonisegu ja asetati katseklaas tagasi termostaati.
3ml reaktsioonisegu pipetis viidi esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi, see oli 0-prooviks. Edasi võeti iga viie minuti järel reaktsioonisegu termostaadist, et võtta sealt 3ml segu ja viia järgmistesse ette valmistatud TKÄ-d sisaldavatesse katseklaasidesse (kokku neli korda).
Kõik neli katseklaasi jäeti 10 minutiks seisma, et sade formeeruks. Edasi filtreeriti kõik kurdfiltri ja plastlehtite abil uutesse kuivadesse katseklaasidesse. Teine ja neljas proov ei olnud pärast esimest filtreerimist veel selged, seega korrati nende filtrimist .
Spektrofotomeeter seadistati lainepikkusele O=280nm ja proovid pandi ükshaaval 1cm läbimõõduga kvartsküvettidesse, mis asetati spekrofotomeetrisse, et määrata nende optiline tihedus.
Tulemused:
I katseklaas (0-proov) 0,4362
II katseklaas (5min proov) 0,5790
III katseklaas (10min proov) 0,7444
IV katseklaas (15min proov) 0,9232
Kaliibrimisgraafikult leiti vastavalt optilistele tihedustele proovides sisalduva türosiini kontsentratsioon.
Tulemused:
I katseklaas 0,068 mg/ml
II katseklaas 0,09 mg/ml
III katseklaas 0,117 mg/ml
IV katseklaas 0,145 mg/ml
Ensüümipreparaadi proteolüütiline aktiivsus arvutati valemile:
A = ΔCTyr • 103 • V1 • V2 • 2 / (Δt • 181 • V3 • g)
ΔCTyr = 0,055 mg/ml
Δt = 600 s
V1 = 26 ml
V2 = 5ml
2 – TKÄ lahusest tingitud proovi lahjendus (3 ml o 6 ml, seega L = 2),
V3 = 1ml
g = 0,01g
181 – türosiini molekulmass.
A=13,2 µkat/g

Kokkuvõte

Kuna türosiini kontsentratsiooni muutuvuse graafik ajas tuli peaaegu sirge, olid mõõtmistulemused õiged. Täielikult täpsete mõõtmistulemuste kohaselt oleksid kõik 4 punkti graafikul asuma ühel sirgel.
Alkalaasi proteolüütiline aktiivsus oli 13,2 µkat/g. Ühik kat/g tähendab, et 1 sekundi jooksul 1g alkalaasi katalüüsib 1mol kaseiini.