Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine (1)

3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine
Teooria
Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi valkudes ja peptiidides, mille tulemusel tekivad madalama molekulmassiga peptiidid ja vabad aminohapped.
Erinevad proteolüütilised ensüümid omavad erinevat toimespetsiifikat. Mõned lõhustavad eelistatult vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (piiratud proteolüüs), teised aga toimivad kõikidele peptiidsidemetele (piiramatu proteolüüs).
Vastavalt sellele, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele, eristatakse endo-ja eksopeptidaase.
Optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi, milles ensüüm toimib, eristatakse hapusid (pH 2,5), neutraalseid (pH 7,2) ja leelisproteaase (pH 9,0)
Proteolüütilise aktiivuse ühikuks 1 kat loetakse sellist ensüümi hulka, mis põhjustab 1 mooli peptiidsidemete hüdrolüüsi 1 s vältel 30 °C juures. Kuna hüdrolüüsunud peptiidsidemete hulk ei ole otseselt mõõdetav, siis on üldlevinud proteolüütiliste ensüümide aktiivsuse avaldamine valgu hüdrolüüsi produktide hulga kaudu.
Käesolevas töös kasutati substraadina kaseiini ­ see on piima põhivalk, koostiselt fosfoproteiin. Proteaasi aktiivsuse hindamiseks jälgitakse kaseiini hüdrolüüsi algstaadiumit, kui valgu polüpeptiidahelas on katkenud vaid üksikud peptiidsidemed ning on tekkinud vaid vähesel määral vabu aminohappeid ja madalmolekulaarseid peptiide.
Proteaasi aktiivsuse määramine põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ning seejärel trikloroäädikhappega mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil.
Trikloroäädikhappe toimel sadenevad lahusest välja tervikvalgud ja kõrgmolekulaarsed peptiidid (Mr > 10000), samuti inaktiveerib TKÄ ensüümi ning peatab edasise hüdrolüüsi toimumise. Sademe eraldamise järel lahusesse jäävate vabade aminohapete ja madalmolekulaarsete peptiidide kontsentratsioon määratakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel spektrofotomeetriliselt (väljendatakse türosiini kontsentratsioonina mg/ml või µmol/ml)
Töö käik Uuritavaks proteaasiks oli esperaas . Sellest valmistati töölahus kontsentratsiooniga 3-4 mg/ml. Analüütilistel kaaludel kaaluti 0,0203 g tahket ensüümpreparaati, viidi see gradueeritud katseklaasi, lisati puhverlahus (5 ml) ning segati klaaspulgaga, kuni ensüüm oli lahustunud.
50 ml katseklaasi pipeteeriti 25 ml 2% kaseiini lahust, katseklaas suleti korgiga ning asetati vesitermostaati 30 °C juurde 5-10 minutiks.
1 4 kuiva 20 ml katseklaasi pipeteeriti 3 ml 5% trikloroäädikhappe lahust.
Kui kaseiini lahus oli termostaadis soojenenud, pipeteeriti sellele 1 ml proteaasi töölahust, segu loksutati. Kohe võeti sellest 3 ml reaktsioonisegu ning viidi esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi (0-proov). Reaktsiooniseguga katseklaas pandi tagasi termostaati.
3 ml reaktsioonisegu võeti ka 5, 10 ja 15 min pärast reaktsiooni algust ning viidi igaüks eraldi TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi.
Katseklaasid jäeti veel ~10 minutiks seisma, et toimuks sademe täielik formeerumine . Seejärel filtriti proovid kuivadesse katseklaasidesse, saadud filtraat pidi olema täiesti selge.
Lainepikkusel =280 nm mõõdeti kõigi nelja proovi optiline tihedus. Vastavalt optilistele tihedustele leiti kaliibrimisgraafikult neis sisalduva türosiini kontsentratsioon.
Tulemused Proovi aeg Optiline tihedus Türosiini kontsentratsioon min D280 mg/ml 0 0,159 0,025 5 0,191 0,031 10 0,290 0,046 15 0,368 0,059 Saadud andmete alusel koostati graafik , mis väljendab türosiini kontsentratsiooni ja reaktsiooni kestvuse vahelist sõltuvust CTyr = f(t)
0,07
0,06
0,05 C (mg/ml)
0,04
0,03
0,02
0,01
0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 t (s)
2 Ensüümi proteolüütiline aktiivsus arvutatakse vastavalt valemile:
CTyr ­ türosiini kontsentratsiooni muutus valitud ajavahemikus (mg/ml) t ­ hüdrolüüsi kestus valitud ajavahemikus (s) V1 ­ reaktsioonisegu (substraat + ensüüm) üldmaht (ml) V2 ­ valmistatud ensüümilahuse üldmaht (ml) 2 ­ TKÄ lahusest tingitud proovi lahjendus V3 ­ ensüümi maht hüdrolüüsisegus (ml) g ­ proteaasi preparaadi kaalutis (g) 181 ­ türosiini molekulmass
1 g ensüümi toimel toimub 2,83 µmol peptiidsidemete hüdrolüüs 1 sek jooksul 30°C juures
3