PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE (1)

TTÜ keemiainstituut Bioorgaanilise keemia õppetool
YKL0060 Biokeemia
Laboratoorne töö nr: Töö pealkiri: 3.4. PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE
Õpperühm: Töö teostaja : YAGB22 MIHKEL HEINMAA
Õppejõud: Töö teostatud: Protokoll esitatud: MALLE KREEN 29/04/2010 9/04/2010
Arvutus parandada. Järeldus?
12.04. M.K.
1 PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE (3.4.)
Teooria
Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on rühm ensüüme, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi valkudes ja peptiidides. Reaktsiooniproduktideks on erineva molekulaarmassiga peptiidid ja vabad aminohapped. Valkude hüdrolüüsiks nim proteolüüsi.
Proteolüütilise aktiivuse ühikuks 1 µkat loetakse sellist ensüümi hulka, mis põhjustab 1 µmooli peptiidsidemete hüdrolüüsi 1 s vältel 30 oC juures. Kuna hüdrolüüsunud peptiidsidemete hulk ei ole otseselt mõõdetav, siis on üldlevinud proteolüütiliste ensüümide aktiivsuse avaldamine valgu hüdrolüüsi produktide hulga kaudu.
Sõltuvalt uuritava proteaasi substraadispetsiifilisusest ja aktiivsuse pH-optimumist kasutatakse aktiivsuse määramisel erinevaid substraate. Käesolevas töös kasutati substraadina kaseiini . Ensüümireaktsioonil hüdrolüüsumata valk ja kõrgmolekulaarsed peptiidid sadestatakse lahusest trikloroäädikhappega, mis ühtlasi inaktiveerib ensüümi ja peatab hüdrolüüsireaktsiooni. Siinkasutatav aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja sellele järgneval hüdrolüüsiproduktide sisalduse spektrofotomeetrilisel määramisel. Aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (Tyr, Phe, Trp) neeldumismaksimumid paiknevad lainepikkuse =280 nm piirkonnas. Valgu hüdrolüüsi produktide sisaldus avaldati türosiini mikromoolidena (1 µmol=0,181 mg). Aktiivsus väljendati 1 g ensüümi kohta.
Töö käik
Valmistati savinaasi (uuritav proteaas ) lahus puhvris. Selleks kaaluti analüütilistel kaaludel 0,0049 g ensüümipreparaati ja viidi kvantitatiivselt 5 ml gradueeritud katseklaasi. Lisati väike kogus puhverlahust ja loksutati, kuni ensüüm lahustunud on. Seejärel täideti kolb puhverlahusega 5 ml märgini.
2 Võeti 50 ml mahuga suurem katseklaas , kuhu pieteeriti 25 ml 2% kaseiini lahust ja asetati vesitermostaati 30 oC juures umbes 10 minutiks soojenema.
Võeti 4 kuiva katseklaasi, need nummerdati ja igaühte pipeteeriti 3 ml 5% trikloroäädikhappe lahust.
Kui kaseiin oli 30 kraadini soojenenud, alustati kaseiini hüdrolüüsi. Kaseiinile pipeteeriti juurde 1 ml savinaasi lahust, loksutati ja fikseeriti aeg.
Pärast ensüümi lisamist võeti kiiresti 3 ml reaktsioonisegu ning viidi esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi (0- proov ). Loksutati hoolega. Kolb hüdrolüüsiseguga asetati pärast proovi võtmist kiiresti tagasi termostaati. 5 minuti pärast võeti taas 3 ml reaktsioonisegu ning viidi teise katseklaasi, loksutati klaasi sisu hoolikalt. Sama tegevust korrati 5-minutiliste intervallidega veel kaks korda.
Katseklaasid proovidega jäeti täielikuks sademe formeerumiseks umbes 15 minutiks seisma. Sel ajal pandi valmis 4 puhast ja kuiva katseklaasi ning varustati need sobivate lehtrite ja maberfiltritega.
Proovid filtriti kuivadesse katseklaasidesse. Filtraadid olid täiesti selged, nagu vaja. Spektrofotomeetril määrati nende optilise tiheduse väärtused (D280).
Juhendajalt saadud kaliibrimiskõveralt leiti vastavlt proovide optilise tiheduse väärtustele neis sisalduva türosiini kontsentratsiooni. Saadud andmete alusel koostati graafik: türosiini kontsentratsioon ­ aeg (C, t). Graafikul oleva sirge järgi leiti türosiini juurdekasv C ajavahemikus t ja arvutati preparaadi proteolüütiline aktiivsus A.
Tulemused
Aeg (t) D280 [C]Tyr 0,08 0 0 0,381 0,060 Türosiini kontsentratsioon C, mg/ml
1 5 0,408 0,064 2 10 0,434 0,069 0,075 3 15 0,492 0,078 0,07
0,065
0,06
0,055 0 5 10 15 Aeg t, minutit
3 Preparaadi proteolüütiline aktiivsus A (µkat/g)
Kust selline C väärtus? Milline on tegelikult C, mis vastab hüdrolüüsi kestvusele 300 sekundit? C ­ türosiini kontsentratsiooni muutus mg/ml 0,078-0,064=0,014 t ­ hüdrolüüsi kestus s 600 sek V1 ­ hüdrolüüsisegu üldmaht ml 26 ml 2 ­ TKÄ lahusest tingitud lahjendus 2 V2 ­ ensüümilahuse üldmaht ml 5 V3 ­ ensüümi maht hüdrolüüsisegus ml 1 g ­ proteaasi kaalutis g 0,0049 181 ­ türosiini molekulmass. 181
- 9,77 mikrokatalit grammi kohta ­ 1 g ensüümi katalüütiline aktiivsus on 9,77 katalit. ? Mis toimub 1g ensüümipreparaadi toimel?
PARANDUSED :
Töö oli küll eeskirja järgselt läbi viidud , kui aktiivsus on umbes 3 korda madalam tegelikkusest. Ilmselt on tulnud kusagile viga töö käigus.
6,84 µkat/g ­ 1 g ensüümi katalüütiline aktiivsus on 6,84 katalit ­ 1 g ensüümpreparaadi toimel hüdrolüüsub 6,84 µmooli peptiidsidemeid sekundis.
4