Proteaasi aktiivsus (0)

Biokeemia Laboratoorne töö
“Protelüütilise ensüümi ehk proteaasi aktiivuse määramine”
Nimi
Grupp
1. Töö eesmärk:
Määrata antud protelüütilise ensüümi aktiivsust ja teha vastavad arvutused.
Ensüüm: Alkalaas
2. Teooria
Proteolüü tilised ensüümid ehk proteaasid (EC 3.4.4., peptiid - peptiidhüdrolaasid) on arvukas rühm ensüüme, mis katalüü sivad peptiidsidemete hüdrolüüsi valkudes ja peptiidides.
Reaktsiooniproduktideks on erineva molekulmassiga peptiidid ja vabad aminohapped .
Proteolüütilise aktiivsuse ühikuks 1 mikro kat loetakse sellist ensüümi hulka, mis põhjustab 1 mikro mooli peptiidsidemete hüdrolüüsi 1 s vältel 30 °C juures.
Kuna hüdrolüüsunud peptiidsidemete hulk ei ole otseselt mõõdetav, siis on üldlevinud proteolüütiliste ensüümide aktiivsuse avaldamine ülalnimetatud tingimustel toimuval valgu hüdrolüüsil vabanevate produktide (aminohapped, peptiidid) hulga kaudu. Sõltuvalt uuritava proteaasi substraadispetsiifilisusest ja aktiivsuse pH - optimumist kasutatakse aktiivsuse määramisel erinevaid substraate ja iga ensüümipreparaat lahustatakse talle sobiva pH - ga puhvris. Kasutatakse järgmisi pH - piirkondi: 2,5 ± 0,5 - hapud proteaasid, 7,2 ± 0,5 - neutraalsed proteaasid, 9,0 ± 0,5 - leelisproteaasid. Enne tööle asumist informeerib praktikumi juhendaja , millise pH juures toimub uuritava proteaasi aktiivsuse määramine. Käesolevas töös kasutatakse ensüümi substraadina kaseiini . Ensüümireaktsioonil hüdrolüüsumata valk ja kõrgmolekulaarsed peptiidid (Mr > 10 000) sadestatakse lahusest trikloroäädikhappega (TKÄ), milline ühtlasi inaktiveerib ensüümi ja peatab edasise hüdrolüüsi. Siinkasutatav aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsile uuritava proteaasi toimel ja järgnevale TKÄ - ga mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse spektrofotomeetrilisele määramisele. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped (Tyr, Phe, Trp) on tänu 280 nm piirkonnas paiknevale neeldumismaksimumile spektrofotomeetriliselt hõlpsasti detekteeritavad. Seetõttu avaldatakse valgu hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini mikromoolidena (1 mikro mol = 0,181 mg). Aktiivsus väljendatakse 1 g ensüümi või 1 ml ensüümilahuse kohta (mikro kat/g, mikro kat/ml).
3. Töö käik:

Võtsime antud ensüümi alkalaasi ja tegime segu: 0,0055 grammi ensüümi (kaalusime analüütilistel kaaludel) lahjendasime 5 ml-ni boraat puhvri lahuega.

Võtsime 50 ml-lise katseklaasi ja valasime sinna kaseiini, panime 10ks minutiks termostaati 30ne kraadi juurde soojenema

Siis valmistasime 4 katseklaasi kuhu panime TKÄ 3 ml igasse .

Kui 10 minutit möödus, võtsime 1 ml ensüümi lahust elektroonpipetiga ja panime selle kaseiini, loksutasime ja võtsime 3ml 0-proovi, lisasime selle esimesse katseklaasi TKÄga. Siis panime 5ks minutiks seisma termostaati, et lahu hüdrolüüsiks edasi. Pärast 5 minuti võtsime veel proovi 3ml ja panime selle teisse katseklaasi TKÄga. Sama protsessi kordusime 10ne ja 15ne minuti pärast.

Kui kõik neli TKÄga katseklaasi olid täidetud hüdrolüüsi seguga jätsime need sadestuma 15neks minutiks. Selle ajal valistasime 4 tühja varustatud lehtritega ja filtripaberitega katseklaasi.

Filtrisime lahused ära ja saadud läbipaistvatel filtraatidel mõõtsime optilise tiheduse fotospektromeetril laine pikusel 280,0 nm.
4. Arvud ja arvutused:
Leiame optiliste tiheduste abil kaliibrimis graafikult türosiini kontsentratsioonid. Siis tehakse graafiku Türosiini konts. – aeg. Ja veel lisaks arvutatakse kontsentratsiooni vastavalt valemile:
A = delta C x 103 x V1 x 2 x V2 / delta T x 181 x V3 x g
deltaC - türosiini kontsentratsiooni muutus mg/ml
delta T - hüdrolüüsi kestus s
V1 - hüdrolüüsisegu üldmaht ml
2 - TKÄ lahusest tingitud lahjendus
V2 - ensüümilahuse üldmaht ml
V3 - ensüümi maht hüdrolüüsisegus ml
g - proteaasi kaalutis g
181 - türosiini molekulmass
A = (0,023 x 103 x 26 x 2 x 5) / (600 x 181 x 1 x 0,0055) = 10,01 m. kat / ml
Vastavalt definitsioonile, 1 ml ensüümi lahust vastava lahjendusega katalüüsib 1 sekundiga 30 kraadi juures 10,01 mikromooli aine teket.
5. Kokkuvõte:
Läbiviidud tööga peaks ensüümi aktiivsuse mõiste selgeks saama. Töö oli viidud lõpuni ja piisava täpsusega, arvutused tehtud ja kõik.
3