Ainete segu lahutamine geelkromotograafia meetodil (0)

Ainete segu lahutamine
geelkromotograafia meetodil
Teooria
Geelkromotograafia e geelfiltratsioonkromotograafia on üks kromotokraafia meetotitest, mille mõhimõtteks on lahuses sisalduvate ainete lahutamine nende molekulmassi suuruste järgi. Geelkromotograafiat kasutatakse makromolekulide lahutamiseks, lisandite eemaldamiseks, soolade eraldamiseks või puhvri vahetamiseks, proov transporditakse läbi kolonni vesilahuse abil.
Geelkromotograafias viiakse protsess läbi kinnistes süsteemis – kolonnis . Kolonn on täidetud pundunud geeligraanulitega. Kolonni poorid on samas suurjusjärgus sisuldavate makromolekulide dimensioonidega.
Geelkromotograafias kasutavad geelid koosnevad kas dekstraanist, agaroosist või polüakrüülamiidist.
Geelkromotograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud:

• Kolonni vaba maht ehk graanulitevahelise vedeliku maht ( Vv)
  
• Graanulise vedeliku maht ( Vs )
  
• Geelimaterjali e. maatriksi maht (Vg)
  
• Täidise kogumaht ehk üldmaht ( Vt)
  

Seega: Vt = Vv+Vs+Vg
Erineva molekulmassiga ainete segu läbib geelkromotograafia kolonni erineva kiirusega, molekulid lahutuvad üksteisest vastavalt suurusele ehk vastavalt molekulide võimele difendeeruda geeli pooridesse. Selleks, et uuritavat ainete segu läbi kolonni transportida ja erineva molekulmassiga ained saaksid üksteisest eralduda, voolitatakse ehk elueeritakse kolonni sobiva vesilahusega. Kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa.
Igat ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimis-ehk väljumismaht Vx , millearvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Erineva molekulmassiga ainete väljumismahte tähistatakse Vx1,Vx2 jne.
Vx- eluendi maht, mille juures väljuv fraktsioon on maximaalne.
Liiga suured molekulid, mis ei mahu geeli pooridesse, väljuvad kolonnist kõige kiiremini, st et neil on minimaalne elueerimismaht Vx min , see on võrdne vaba vedeliku mahuga.
Vx min= Vv
Need ained, mis on liiga väikse molekulmassiga, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aegaselt ja väljuvad kõige hiljem, need väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, milline on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule Vt.
Seega Vx=Vt
Juhul kui Vg on teada saab leida Vxmax –i
Vxmax= Vt-Vg
Rf = (Vx-Vx min)/(Vxmax –Vx min)
kus Rf on liikuvustegur, mille väärtused jäävad vahemikku 0-1
Eluaadi frkatsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nimetatakse kromatograammiks. Antud ttöös koosasin käsitsi.
Tüüpiline kromatografeerimissüsteem koosneb kolonnist, eluendi reservuaarist ja automaatsest franktsioonikogust ehk kollektorist.
Ainete kontsentratsioonide kindlakstegemiseks eluaadi fraktsioonides kasutataksse käesolevas töös spektromeetrilist meetodit.
Töö käik
Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine.
Kolonni täidiseks oli SephadexG75 ning seda iseloomustav tegur k, mis sõltub kasutatava geeli pundumisastmest, oli 0,1.
Geelisamga kõrgus L oli 22,2 ja diameeter d oli 1,8
Täidise kogumaht Vt= πr2 * L = π*( 1,8/2)2 * 22,2= 56,46
Geelmaatriksi maht Vg= k*Vt= 0,1 * 56,46= 5,6
Maksimaalne elueerimismaht Vxmax= Vt-Vg = 56,46 – 5,6=50,86
Fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni maht on 2ml, seega n=Vxmax/2 =50,86/2=25,2
Katseklaasistatiivi asetasin 25 nummerdatud klaasi, kus olid eelnevalt tehtud 2ml piirid.
Voolutuslahuseks ehk eluendiks oli 0,15M NaCl, eluendi kolonni viimiseks kasutasin 10ml pipetti.
50ml keeduklaasi kogusin kolonni täidise pinnal oleva eluendi.
Segu komponentideks lahutamine
Avasin ettevaatlikult kolonni väljavooluava ja täidise kohal olev voolutuslahus hakkas aeglaselt anumasse tilkuma. Samal ajal reguleerisin kolonni voolukiiruse nii, et 2ml täituks 2-3 minutiga. Vedeliku tase kolonnis langes täidise pinnani, sulgesin kolonni väljavooluava ja sisestasin uuritava proovi.
NB! Mingil juhul ei tohi lasta kolonni kuivaks joosta , st. tuleb vältida, et vedeliku nivoo ei langeks geelpinnast allapoole ja õhk ei tungiks geelkihti!
Proovi sisestamine.
Uuritava segu doseerimiseks ja kolonni sisestamiseks kasutasin sobiva mahuga mõõtpipetti , võtsin 0,5 ml uuritavat proovi ja viisin kolonni, juhtides pipeti otsa vatu kolonni seina ja jättes u 5m mm kaugusele geeli pinnast. Proovi jaotasin ühtlaselt geeli pinnale. Kolonni väljavooluava oli suletud.
PUUDU?
Katseandmete tabel
Elueerimismaht oli fraktsiooni nr. 1-20 konstantselt 2 ml
Fraktsiooni nr.
Elueerimismaht V, ml
Optiline tihedus, A
ühinenud fraktsioon
14,5
0
1
2
0,049
2
2
0,806
3
2
0,433
4
2
1.362
5
2
2,552
6
2
1,984
7
2
0,872
8
2
0
9
2
0
10
2
0
11
2
0
12
2
0
13
2
0
14
2
0,383
15
2
0,379
16
2
0,378
17
2
0,378
18
2
0,380
19
2
0,383
Fraktsioonid nr. 1-3 mõõtsin lainepikkusel 679nm, 4-7 mõõtsin lainepikkusel 410 nm, 8-13 ei mõõtnud, kuna olid värvuseta, 14-20 lainepikkusel 360nm.
Tulemused ja nende intepreteerimine
A.
Täidis SpatelG75
Pundumis tegur 0,1
Täidise kõrgus 22,2 ja sisediameeter 1,8
Arvutatud täidise kogumaht 56,46
Arvutatud maksimaalne elueerimismaht 50,89
Arvutuslik fraktsioonide üldarv 25
B.
C.
Graafikult on näha kolme tõusu ja langust, mis näitavad, et aine konts. kolonnist
väljumisel tõuseb, saavutab haripunkti ja langeb, kuni lõpuks on kogu aine kolonnist
väljunud. Ained jagunesid geelis vastavalt molaarmassile. Dekstraansinine , mille
molaarmass on tunduvalt suurem, kui müoglobiinil ja DNP-Aspartaadil, väljus
kolonnist esimesena. Kolmandana elueerus DNA- Aspartaat , mille molekulid on
piisavalt väikesed, et täielikult geeli pooridesse siseneda ning on seetõttu maksimaalse
elueerimismahuga.
D.
E.Rf= Vx- Vxmin /Vxmax-Vxmin=