AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL (0)

AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL
Teooria
Geelkromatograafia põhimõtteks on lahuses sisalduvate ainete lahutamine nende erinevate molekulmasside järgi. Lahuses sisalduvad ained liiguvad läbi geeli erineva kiirusega. Geelkromatograafiat kasutatakse makromolekulide lahutamiseks, lisandite eemaldamiseks, soolade eraldamiseks või puhvri vahetamiseks. Proov viiakse läbi kolonni vesilahuse abil.
Geelkromatograafia protsess toimub kolonnis , mis on täidetud pundunud geeligraanulitega, mille pooride mõõtmed on samas suurusjärgus lahuses sisalduvate makromolekulidega. Geelkromatograafias kasutatavad geelid koosnevad kas dekstraanist, agaroosist vōi polüakrüülamiidist.
Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud:

• kolonni vaba maht ehk graanulitevahelise vedeliku maht (Vv),
  
• graanulitesisese vedeliku maht (Vs),
  
• geelimaterjali ehk maatriksi maht (Vg),
  
• täidise kogumaht ehk üldmaht (Vt).
  

Seega: Vt = Vv + Vs + Vg
Selleks, et uuritavat ainete segu läbi kolonni transportida ja et erineva molekulmassiga ained saaksid üksteisest eralduda, voolutatakse kolonni sobiva vesilahusega. Kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Molekulid, mis ei mahu geeli pooridesse väjuvad kõige esimesena, st minimaalse elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdne kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv Ained, mis mahuvad geeli pooridesse, liigavad kõige aeglasemalt ja väjuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, milline on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule.
Et täidis väja ei voolaks, on kolonni alumine ots täidetud klaasvillaga. Eluendi lisamine kolonni ja eluaadi fraktsioonide kogumine toimub käsitsi. Ainehulkade kindlakstegemiseks kogutud fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrit.
Töö käik
Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine

Kontrollitakse, et kolonn oleks vertikaalne.

Märgitakse üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex’i mark ja seda iseloomustav tegur k.

Mõõdetakse geelisamba kõrgus L ja ja diameeter d.

Arvutatakse täidise kogumaht Vt

Arvutatakse geelimaatriksi maht Vg = k • Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav

maksimaalne elueerimismaht Vxmax=Vt - Vg

Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega

n = Vxmax / 2.

Statiivi pannakse vajalik kogus kalibreeritud ja nummerdatud katseklaase.

Märgitakse üles voolutuslahus ja varustatakse end sobiva pipetiga, millega saab lahust kolonni lisada.

Varutakse väike keeduklaas, kuhu lastakse alguses täidise pinnal olev eluent .
Segu komponentide lahutamine.

Avatakse kolonni väljavooluava ja kogutakse voolutuslahust kuni see jõuab täidise pinnani. Samal ajal reguleeritakse vooluiirus.

Kui vedeliku tase kolonnis langeb täidise pinnani, suletakse kolonni väljavooluava ja kolonn on valmis proovi sisetamiseks.
Proovi sisestamine

Uuritav segu viiakse ettevaatlikult kolonni lastes sel tasapisi täidisele tilkuda.

Kui proov on sisestatud, avatakse väljavool ja lisatakse kiiresti pipeti abil väike kogus eluenti. Seda tegevust korratakse kuni proov on täidisesse imbunud. Seejärel võib lisada suurema koguse voolutuslahust.

Kui esimene värviline riba hakkab lähenema kolonni alumisele osale hakatakse eluaati koguma valmispandud katseklaasidesse.

Elueerimise võib lõpetada, kui väljuv eluaat on värvitu.
Fraktsioonide analüüsimine

Antud töös väljendatakse aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel.

Täiesti värvusetute fraktsioonide absorptsiooni väärtused võrduvad 0-ga ja neid fraktsioone pole vaja mõõta.

Koostatakse 3-veeruline katseandmete tabel, mis on aluseks kromatogrammi koostamisele ja töö tulemuste väljatoomisele.
Kolonni täidiseks oleva Sephadex’i mark – G-75, seda iseloomustav tegur k=0,1
Geelisamba kõrgus L=30,9 cm
Diameeter d=1,6 (raadius r=0,8)
Vt=πr2L=π*0,82*30,9=62,10 cm3
Geelimaatriksi maht Vg=k*Vt=0,1*62,10=6,21 cm3
Maksimalne elueerimismaht Vxmax=Vt-Vg=62,10- 6,21=55,89 cm3
Fraktsioonide üldarv n=Vxmax/2= 55,89/2≈27,945
Voolutuslahus 20mM Tris 0,15M NaCl pH=7,5
Fraktsiooni number
Elueerimismaht V (ml)
Optiline tihedus (A)
Mõõdetud lainepikkusel (nm)
Ühendatud fraktsioon
18
0
670
1
20
0,02
670
2
22
0,111
670
3
24
0,972
670
4
26
0,808
670
4
28
0,204
670
5
30
0,042
670
6
32
0
410
7
34
2,039
410
8
36
3,436
410
9
38
3,436
410
10
40
3,215
410
11
42
2,011
410
12
44
0,880
410
13
46
0,276
410
14
48
0,054
410
15
50
0
360
16
52
Jäi vahele
360
17
54
Jäi vahele
360
18
56
Jäi vahele
360
19
58
Jäi vahele
360
20
60
Jäi vahele
360
21
62
Jäi vahele
360
22
66
Jäi vahele
360
23
68
0,572
360
24
70
1,571
360
25
72
2,709
360
26
74
3,135
360
27
76
2,422
360
28
78
1,168
360
29
80
0,414
360
30
82
0,119
360
31
84
0,027
360
32
86
0
360
x- teljel elueerimimaht V (ml), y-teljel optiline tihedus A, maksimumpunktid A=0,972 (24 ml), A=3,436 (36 ml) ja A=3,135 (74 ml).
0-18 ml on ühendatud fraktsioon.
Vxmin = 24 ml
Vx = 36 ml
Vxmax = 74 ml
Rf väärtus: Rf = Vx - Vxmin / Vxmax - Vxmin = 36-24 / 74-24 = 0,24
Arvutatud maksimaalne elueerimismaht Vmax=55,89 cm3 ≈56 cm3, määratud Vmax=74 cm3
Arvutatud ja määratud maksimaalsed elueerimismahud ei klapi.
Järeldus:
Dekstraansinine väljus esimesena, kuna tema molekulmass on neist suurim ja ta ei mahtunud geeli pooridesse. DNS- aspartaat , kui väikseima molekulaarmassiga, difundeerus täielikult pooridesse ja läbis seetõttu kolonni kõige aeglasemalt.
Arvutsulik ja reaalne elueerimismaht erinesid üksteisest, kuigi ei tohiks. Mõõtmisvead võisid tulla kolonni mahu mõõtmisel või fraktsioonide mõõtmisel.
Ideaalis ei tohi teoreetiline ja reaalne maksimaalne elueerimismaht üksteisest erineda. Erinevus saab tekkida üksnes mahtude mõõtmisel nagu kolonni ruumala arvutustes või ebatäpses fraktsioonide kogumises.