Biokeemia - Geelkromatograafia (0)

TTÜ keemiainstituut
Bioorgaanilise keemia õppetool
Biokeemia
Laboratoorne töö nr: 5
Töö pealkiri:
AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL
Õpperühm:
Töö teostaja:
Õppejõud:
Terje Robal
Töö teostatud:
03.04.2012
Protokoll esitatud:
16.04.2012
Protokoll arvestatud:
AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL
Teooria
Geelkromatograafia põhimõtteks on lahuses sisalduvate ainete lahutamine nende erinevate molekulmasside järgi. Lahuses sisalduvad ained liiguvad läbi geeli erineva kiirusega. Geelkromatograafiat kasutatakse makromolekulide lahutamiseks, lisandite eemaldamiseks, soolade eraldamiseks või puhvri vahetamiseks. Proov viiakse läbi kolonni vesilahuse abil. Geelkromatograafia protsess toimub kolonnis , mis on täidetud pundunud geeligraanulitega, mille pooride mõõtmed on samas suurusjärgus lahuses sisalduvate makromolekulidega. Geelkromatograafias kasutatavad geelid koosnevad kas dekstraanist, agaroosist vōi polüakrüülamiidist.
Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud:
kolonni vaba maht ehk graanulitevahelise vedeliku maht (Vv),
graanulitesisese vedeliku maht (Vs),
geelimaterjali ehk maatriksi maht (Vg),
täidise kogumaht ehk üldmaht (Vt).
Seega: Vt = Vv + Vs + Vg
Selleks, et uuritavat ainete segu läbi kolonni transportida ja et erineva molekulmassiga ained saaksid üksteisest eralduda, voolutatakse kolonni sobiva vesilahusega. Kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Molekulid, mis ei mahu geeli pooridesse väjuvad kõige esimesena, st minimaalse elueerimismahuga Vxmin , mis on võrdne kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv Ained, mis mahuvad geeli pooridesse, liigavad kõige aeglasemalt ja väjuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, milline on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule. Et täidis väja ei voolaks, on kolonni alumine ots täidetud klaasvillaga. Eluendi lisamine kolonni ja eluaadi fraktsioonide kogumine toimub käsitsi. Ainehulkade kindlakstegemiseks kogutud fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrit.
Töö käik
Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine
• Kontrollitakse, et kolonn oleks vertikaalne.
• Märgitakse üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex’i mark ja seda iseloomustav tegur k.
• Mõõdetakse geelisamba kõrgus L ja ja diameeter d.
• Arvutatakse täidise kogumaht Vt
• Arvutatakse geelimaatriksi maht Vg = k • Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav
maksimaalne elueerimismaht Vxmax=Vt - Vg
• Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega
n = Vxmax / 2.
• Statiivi pannakse vajalik kogus kalibreeritud ja nummerdatud katseklaase.
• Märgitakse üles voolutuslahus ja varustatakse end sobiva pipetiga, millega saab lahust kolonni lisada.
• Varutakse väike keeduklaas , kuhu lastakse alguses täidise pinnal olev eluent.
Segu komponentide lahutamine.

• Avatakse kolonni väljavooluava ja kogutakse voolutuslahust kuni see jõuab täidise pinnani. Samal ajal reguleeritakse vooluiirus.
  
• Kui vedeliku tase kolonnis langeb täidise pinnani, suletakse kolonni väljavooluava ja kolonn on valmis proovi sisetamiseks.
  

Proovi sisestamine

• Uuritav segu viiakse ettevaatlikult kolonni lastes sel tasapisi täidisele tilkuda.
  
• Kui proov on sisestatud, avatakse väljavool ja lisatakse kiiresti pipeti abil väike kogus eluenti. Seda tegevust korratakse kuni proov on täidisesse imbunud. Seejärel võib lisada suurema koguse voolutuslahust.
  
• Kui esimene värviline riba hakkab lähenema kolonni alumisele osale hakatakse eluaati koguma valmispandud katseklasidesse.
  
• Elueerimise võib lõpetada, kui väljuv eluaat on värvitu.
  

Fraktsioonide analüüsimine

• Antud töös väljendatakse aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel.
  
• Täiesti värvusetute fraktsioonide absorptsiooni väärtused võrduvad 0-ga ja neid fraktsioone pole vaja mõõta.
  
• Koostatakse 3-veeruline katseandmete tabel, mis on aluseks kromatogrammi koostamisele ja töö tulemuste väljatoomisele.
  

Kolonni täidiseks oleva Sephadex’i mark – G-75, seda iseloomustav tegur k=0,1
Geelisamba kõrgus L=32,7 cm
Diameeter d=1,6 (raadius r=0,8)
Vt=πr2L=π*0,82*32,7=65,75 cm3
Geelimaatriksi maht Vg=k*Vt=0,1*65,75=6,575 cm3
Maksimalne elueerimismaht Vxmax=Vt-Vg=65,75-7,575=59,175 cm3
Fraktsioonide üldarv n=Vxmax/2=59,175/2≈30
Voolutuslahus 20mM Tris 0,15M NaCl pH=7,5
Fraktsiooni number
Elueerimismaht V (ml)
Optiline tihedus (A)
Mõõdetud lainepikkusel (nm)
Ühendatud fraktsioon
18
0
670
1
20
0,02
670
2
22
0,175
670
3
24
0,165
670
4
26
0,028
670
4
28
0,101
410
5
30
0,476
410
6
32
0,748
410
7
34
0,588
410
8
36
0,299
410
9
38
0,116
410
10
40
0,042
410
11
42ml Jäi vahele
12
44ml Jäi vahele
13
46ml Jäi vahele
14
48ml Jäi vahele
15
50ml Jäi vahele
16
52
0,013
360
17
54
0,053
360
18
56
0,270
360
19
58
0,618
360
20
60
0,710
360
21
62
0,508
360
22
64
0,225
360
23
66
0,074
360
24
68
0,017
360
x- teljel elueerimimaht V (ml), y-teljel optiline tihedus A, maksimumpunktid A=0,175 (22 ml), A=0.748 (32 ml) ja A=0,710 (60 ml).
0-18 ml on ühendatud fraktsioon.
Vxmin = 22 ml
Vx = 32 ml
Vxmax = 60 ml Arvutan välja valgule Rf väärtuse: Rf = Vx - Vxmin / Vxmax - Vxmin = 32-22 / 60-22 = 0,26
Arvutatud maksimaalne elueerimismaht Vmax=59,175 cm3 ≈60 cm3, määratud Vmax=60 cm3
Arvutatud ja määratud maksimaalsed elueerimismahud klapivad.