Töö käik Tegin oma vedela invertaasi preparaadist 40 kordse lahjenduse. 10 ml lahuse kohta 0,25ml invertaasi. Kasutasin automaatpipetti 250 mõõduga, millega viisin mõõdetud invertaasi gradueeritud katseklaasi ja lisasin 10ml märgini puhverlahust. Loksutasin ühtlase konsentratsiooni saamiseks. Lisasin 50ml-sse katseklaasi 25 ml substraati, milleks on 7%-line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH väärtusega 4,8. Katseklaasile panin peale korgi ning asetasin vesitermostaati 30 juurde soojenema. Panin valmis kolm 250ml koonilist kolbi, igaühesse lisasin pipetiga 10 ml komplekslahust. Substraadi soojenemisel 30-ni lisasin sellele 1 ml uuritavat invertaasi töölahust. Lahuse loksutasin läbi ja pipeteerisin kiiresti 1ml lahust ühte kolbidest(0-proov). Substraadi panin tagasi vesitermostaati. 10 minutit hiljem peale ensüümireaktsiooni algust lisasin 1 ml lahust teise kolbi (I-proov).
pH=8,4) 6 ml. Paraku valasin seda graduleeritud katseklaasi liiga palju ning sain 10 ml lahust. Järjekordsel konsulteerimisel õppejõuga otsustasin jätkata väiksema kontsentratsiooniga lahusega. Kontsentratsioon pidi olema 2 mg/ml, minu katses oli 1,2 mg/ml. Edasi tehakse ettevalmistusi ensüümireaktsiooniks. 50 ml katseklaasi pipeteeritakse 25 ml 2%-list kaseiini lahust (substraat). Katseklaasile pannakse peale kork ning asetatakse see vesitermostaati 510 minutiks soojenema. Samal ajal võetakse 4 kuiva katseklaasi, nummerdatakse need ning pipeteeritakse igaühte 3 ml 5%-list TKÄ lahust. Kui kaseiini lahus on soojenenud, alustatakse ensüümireaktsiooni kaseiini hüdrolüüsi. Kaseiinile pipeteeritakse juurde 1 ml valmistatud alkalaasi töölahust. Reaktsioonisegu loksutatakse läbi. Fikseeritakse reaktsiooni alguse kellaaeg. Võimalikult kiirelt pipeteeritakse kuiva puhta pipetiga 3 ml reaktsioonisegu esimesse TKÄ-d
Katse käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine Valmistasin vajaliku koguse sobiva ensüümikontsentratsiooniga lahust. Selleks kaausin 0,0108g tahket ainet invertaase ja lisasin sellele 5 mL atsetaatpuhvrit, mille pH oli 4,8. Loksutasin katseklaasi. Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine Võtsin sobiva suurusega katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 mL 7%-list sahharoosi lahust atsetaatpuhvris pH-ga 4,8 (substraat). Sulgesin katseklaasi ning panin 10 minutiks vesitermostaati 30C juurde. Kolme 250 mL-sse koonilisse kolbi, pipeteerisin igasse ühesse 10 mL komplekslahust. Võtsin termostaadist 30C-ni soojendatud substraadi ning pipeteerisin sinna 1 mL valmistatud invertaasi töölahust. Loksutasin reaktsioonisegu, siis võtsin kohe 1 mL lahust sealt ning lisasin ühele komplekslahusele kolvis. See oli 0-proov ja iseloomustab olukorda hüdrolüüsi alghetkel. Reaktsioonisegu katseklaasiga panin kohe tagasi termostaati ning lasin sellel seal olla 10 minutit.
Paraku valasin seda graduleeritud katseklaasi liiga palju ning sain 10 ml lahust. Järjekordsel konsulteerimisel õppejõuga otsustasin jätkata väiksema kontsentratsiooniga lahusega. Kontsentratsioon pidi olema 2 mg/ml, minu katses oli 1,2 mg/ml. Edasi tehakse ettevalmistusi ensüümireaktsiooniks. 50 ml katseklaasi pipeteeritakse 25 ml 2%-list kaseiini lahust (substraat). Katseklaasile pannakse peale kork ning asetatakse see vesitermostaati 5-10 minutiks soojenema. Samal ajal võetakse 4 kuiva katseklaasi, nummerdatakse need ning pipeteeritakse igaühte 3 ml 5%-list TKÄ lahust. Kui kaseiini lahus on soojenenud, alustatakse ensüümireaktsiooni – kaseiini hüdrolüüsi. Kaseiinile pipeteeritakse juurde 1 ml valmistatud alkalaasi töölahust. Reaktsioonisegu loksutatakse läbi. Fikseeritakse reaktsiooni alguse kellaaeg. Võimalikult kiirelt pipeteeritakse kuiva puhta pipetiga 3 ml reaktsioonisegu
antud koguse ning tegin lahuse gradueeritud 5 milliliitrise mahuga katseklaasi. Esialgu lisasin väikese koguse puhverlahust ning segasin seda ~5 minutit kuni lahustumiseni, seejärel täitsin katseklaasi etteantud mahuni ning loksutasin, et ensüümi kontsentratsioon lahuses ühtlustuks. Ensüümreaktsiooni (kaseiini hüdrolüüsi) läbiviimine · pipeteerisin suurde 50 ml mahuga katseklaasi 25 ml 2%-list kaseiini lahust ning asetasin selle korgiga kaetuna vesitermostaati 5-10 minutiks seisma · võtsin 4 kuiva normaalmõõdus katseklaasi, nummerdasin need ning igaühte lisasin 3 ml 5%-list TKÄ lahust · kui kaseiini lahus oli piisavalt soojenenud, alustasin ensüümireaktsooni, selleks pipeteerisin kaseiinile juurde 1 ml valmistatud proteaasi töölahust, loksutasin läbi, käivitasin stopperi ja asetasin selle tagasi vesitermostaati · kohe peale ensüümi lisamist võtsin puhta ja kuiva pipetiga 3 ml reaktsioonisegu
Selleks mõõtsin kaliibritud katseklaasi pipetiga 0,5 mL vedelat ensüümipreparaati invertiin ning lisasin sellele 9,5 mL atsetaatpuhvrit, mille pH oli 4,8. See tähendab, et tegin 20 kordse lahjenduse. Loksutasin katseklaasi. Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine Võtsin sobiva suurusega katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 mL 7%-list sahharoosi lahust atsetaatpuhvris pH-ga 4,8 (substraat). Sulgesin katseklaasi ning panin 10 minutiks vesitermostaati 30C juurde. Kolme 250 mL-sse koonilisse kolbi, pipeteerisin igasse ühesse 10 mL komplekslahust. Võtsin termostaadist 30C-ni soojendatud substraadi ning pipeteerisin sinna 0,5 mL valmistatud invertaasi töölahust. Loksutasin reaktsioonisegu, siis võtsin kohe 1 mL lahust sealt ning lisasin ühele komplekslahusele kolvis. See oli 0-proov ja iseloomustab olukorda hüdrolüüsi alghetkel. Reaktsioonisegu katseklaasiga panin kohe tagasi termostaati ning lasin sellel seal olla 10
pH väärtusega puhvris lahus, milles ensüümi kontsentratsioon oli 1,5 mg/ml.Valmistasin 5 ml töölahust. Selleks kaalusin analüütilistel kaaludel 7,5 mg ehk 0, 0075 g alkanaasi ja lahustasin selle klaaspulga abil boraatpuhvris, mille pH=8,4. 1.4 Ensüümireaktsiooni (kaseiini hüdrolüüsi) läbiviimine 1) Võtsin 50 ml mahuga suure katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 ml 2%-list kaseiini lahust. Katsin klaasi korgiga ja asetasin vesitermostaati 30 ºC juurde 10 minutiks 2) Võtsin 4 kuiva katseklaasi normaalmõõdus ja nummereerisin need. Igaühte pipeteerisin 3 ml 5%-list TKÄ lahust. 3) Ensüümireaktsiooni ehk kaseiini hüdrolüüsi alustasin, kui kaseiini lahus oli 30 ºC-ni soojenenud. Selleks pipeteerisin kaseiinile juurde 1 ml valmistatud proteaasi töölahust, loksutasin läbi ja käivitasin stopperi.
katseandmete alusel ekvivalentjuhtivus lõpmatul lahjendusel. Töö käik Töös kasutatakse juhtivusnõusse valatud elektrolüüdilahuse takistuse mõõtmiseks vaheluvvoolusilda P-38. Juhtivusnõu loputada paar korda uuritava lahusega ning seejärel pipeteerida vastavalt nõu mahule selline hulk, et elektroodod oleksid 3-5 mm ulatuses lahusega kaetud. Kõikide mõõtmiste puhul peab vedeliku hulk olema ühesugune. Juhtivusnõu asetada vesitermostaati, mille temperatuuri hoida püsivana 25°C. Juhtivusnõud hoida 10-15 min termostaadis, seejärel ühedada elektroodid vahelduvvoolusillaga ja mõõta lahusekihi takistus. Samal viisil määrata ka lahjenduste takistused. Katsete lõpetamisel tuleb elektroodid jätta destilleeritud vette seisma. Valemid Nõu konstant: Elektrijuhtivus: Ekvivalentjuhtivus: Piiriline ekvivalentjuhtivus: Näiline dissotsiatsioonikonstant: Katsetulemused A. Elektroodide konstandi määramine:
kontsentratsiooni reaktsioonisegus. Kõigepealt valmistasin invertaasi lahuse, et hakata määrama seal oleva invertaasi aktiivsust. Selleks mõõtsin vajalikud kogused ja mahud ning et töö tulemus oleks täpne tegutsesin kvantitatiivselt. Seejärel segasin, et moodustuks ühtlane suspensioon. Vedela ensüümpreparaadi doseerisin sobiva pipeti abil. Seejärel valasin katseklaasi reaktsioonisegu ja panin ta vesitermostaati juurde soojenema reaktsiooni soodustamiseks ning 3 koonilisse kolbi komplekslahuse, et need kindlatel aegadel kokku viia. Kokkuviimise hetkel fikseerisin aja, et lahused reageeriksid kindla aja. Kohe pärast reaktsioonisegu läbiloksutamist võtsin sealt 0-proovi, mis iseloomustab sahharoosi hüdrolüüsi alghetkel. 10 minuti möödudes võtsin järgmise proovi, et teha kindlaks hüdrolüüs 10 min möödudes. 20 minuti möödudes võtsin viimase proovi, et teha kindlaks hüdrolüüsi
Katsetulemuste töötlus toimub kahes variandis. Tugeva elektrolüüdi lahuse puh elektrijuhtivus lahuse lõpmatul lahjendusel nn. piiriline molaarne elektrijuhtivu arvutatakse dissotsiatsiooniastmed ja dissotsiatsioonikonstant. Teooria. Töövahendid. juhtivusmõõtja MC226, vesitermostaat, 100- ml mahuga mõõtekolvid, pipetid. Töö käik. Valmistasin ette antud konsentratsiooniga lahused. Alustasin mõõtmist madala lahusest. Valasin lahuse nõusse, panin selle vesitermostaati ja panin sisse juht laarne elektrijuhtivus real kontsentratsioonidel, eva lahusekihi takistust või otse erijuhtivust. ektrolüüdi lahuse puhul leitakse katseandmete alusel laarne elektrijuhtivus λ0. Nõrga elektrolüüdi korral tant. mõõtekolvid, pipetid. sin mõõtmist madalaima konsentratsiooniga ti ja panin sisse juhtivusmõõtja. Elektrolüüt: CH3COOH Tabel 1 katseandmed lahuse molaarne
Töö käik: Valmistatakse uuritava proteaasi lahus ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris. Selleks kaalutakse analüütilisel kaalul 0,0051 g ensüümipreparaati, milleks oli alkalaas, ja seejärel viiakse kvantitatiivselt 5 ml mõõtekolbi. Lisatakse väike kogus boraatpuhvrit ja loksutatakse, kuni ensüüm on lahustunud. Seejärel täidetakse kolb puhverlahusega märgini. Võetakse 50 ml mahuga katseklaas, kuhu pipeteeritakse 25 ml sobiva pH väärtusega 2% kaseiini lahust ja asetatakse vesitermostaati 30 oC juures umbes 5-10 minutiks soojenema. Siis võetakse 4 kuiva katseklaasi pipeteeritakse igaühte 3 ml 5% TKÄ lahust. TKÄ-d kasutan, kuna see ühtlasi inaktiveerib ensüümi ja peatab hüdrolüüsireaktsiooni. Kui kaseiini lahus on 30 oC-ni soojenenud, alustatakse kaseiini hüdrolüüsi. Selleks pipeteeritakse kaseiinile juurde 1 ml alkalaasi lahust, loksustatakse ja fikseeritakse aeg kella järgi
reaktsioonisegust punase sademena ja lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B. Reaktsioonil vabanenud triloon B määratakse tiitrimisel 0,02M vasksulfaadi lahusega, kasutades indikaatorina mureksiidi vesilahust. Töö käik: 1. Sahharoosi hüdrolüüsi läbiviimiseks kasutasime suuremat katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 ml 7% sahharoosi lahust, mis oli substraadiks ja mille pH oli 4,8. Lahuse asetasin vesitermostaati 30 kraadi juurde soojenema. 2. Valmistasin ette kolvid taandavate suhkrute sisalduse määramiseks. Pipeteerisin kolme koonilisse kolbi 250 ml komplekslahust. 3. Tahket invertaasi kaalusin 24,5 mg ja lahustasin 0,5 ml atsetaat puhvris. 4. Kui sahharoosi lahus oli küllalt soojenenud lisasin termostateeritud sahharoosi lahusele 0,5ml uuritavat invertaasi lahust, loksutasin ja hakkasin aega mõõtma.
Cu(II) ioonidega triloon B kompleksi taastekke. Töö käik · Ensüümist valmistati 10ml 20x lahjendusega ensüümi lahust gradueeritud katseklaasi. (0,5ml ensüümi + 9,5ml atsetaat puhvrit). Katseklaasi sisu segati 5min vältel ettevaatlikult. · Võeti 50ml mahuga katseklaas, kuhu pipeteeriti 25ml substraati, milleks on 7% sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH = 4,8. Katseklaasile pannakse kork ning asteatakse 10 minutiks vesitermostaati 30±1C juurde. · Võeti kolm 250ml koonilist kolbi, kuhu pipeteeriti 10ml komplekslahust. · Kui substraat saavutas termostaadis õige temperatuuri lisatakse 0,5ml uuritavat töölahust, loksutatakse läbi ja pipeteeritakse kiiresti 0,5ml töölahust ühte komplekslahusega kolbi ning käivitatakse stopper. · 10 ja 20 minuti pärast pipeteeritakse ülejäänud kahte koonilisse kolbi 0,5ml töölahust.
produktid spektrofotomeetriga. Töö käik 1. Valmistasin uuritava proteaasi Savinase lahuse ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris. Kaalusin analüütilistel kaaludel ensüümi 0,006 g. Viisin selle kvantitatiivselt 10 ml mõõtekolbi. Lisasin väikse koguse puhvelahust ja loksutasin, kuni ensüüm lahustus. Seejärel lisasin puhverlahust juurde, nii, et seda oli kokku 5ml. 2. Võtsin 50ml mahuga suurema katseklaasi ja pipteerisin sinna 25ml 2%-list kaseiini lahust ja asetasin vesitermostaati 30 C ° juurde 10 minutiks seisma. 3. Võtsin neli katseklaasi ja nummerdasin need. Seejärel pipteerisin igaühte 3ml 5%-list TKÄ lahust. 4. Kui kaseiini lahus oli soojenenud, alustasin hüdrolüüsi. Pipteerisin kaseiinile juurde 1ml uuritava proteaasi lahust, loksutasin ja võtsin 3ml proovi. Esimese proovi võtmise hetkel vaatasin ka kella. Seejärel võtsin iga 5 minuti järel taas 3ml reaktsioonisegu kuni neid oli kokku neli. Reaktsioonisegu pipteerisin
määramise meetod. Töö käik · Invertaasi preparaat, mis kaalutakse analüütilisel kaalul, lahjendatakse atsetaatpuhvriga (pH 4,8) 1 : 50. (0,02 ml preparaati ja u 10 ml atsetaatpuhvrit). Loksutatakse hoolikalt ühtlase segu tekkimiseni. · 50 ml katseklaasi pipeteeritakse 25 ml substraati ( 7 % sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH 4,8) ja kaetakse korgiga. · Katseklaas asetatakse omakorda vesitermostaati 30 kraadi juurde u 5-10 minutiks. · Samal ajal pipeteeritakse kolme koonilisse 250 ml kolbi 10 ml komplekslahust. · Kui termostaadis olev lahus on saavtunad soovitava temperatuuri lisatakse substraadile 1 ml uuritavat invertaasi töölahust, loksutatakse ja fikseeritakse reaktsiooni algusaeg. · Kohe pipeteeritakse kuiva pipetiga 1 ml reaktsioonisegu ühte koonilisse kolbi. 10 ja 20 minuti möödudes korratakse tegevust.
See on ensüümi hulk, mis põhjustab 1 mikromooli peptiidsidemete hüdrolüüsi 1 sekundi vältel 30 °C juures. Töö käik Kõigepealt valmistasin 5 ml uuritavat proteaasi lahust. Selleks kaalusin 0,0049 grammi tahket ensüümipreparaati (Alcolase) ja lahustasin selle boraatpuhvris 5 ml-ni (pH=8,4). Järgnevalt pipeteerisin suurde katseklaasi 25 ml 2%-list kaseiini lahust ja asetasin lahuse kümneks minutiks vesitermostaati 30 °C juurde soojenema. Samal ajal kui lahus soojenes, pipeteerisin nelja kuiva katseklaasi, igaühte 3 ml 5%-list trikloroäädikhappe lahust. Kui kaseiini lahus oli 30 °C-ni soojenenud, lisasin sellele 1 ml uuritavat proteaasi lahust, loksutasin ning võtsin kohe kuiva pipetiga 3 ml seda hüdrolüüsisegu ja viisin esimesse katseklaasi, kus oli TKÄ lahus ja loksutasin hoolega. Kohe oli näha valkja sademe moodustumist.
gradueeritud katseklaasi. · Lisati väike kogus boraatpuhvrit (pH = 8,4) ja segati 5 min klaaspulgaga. Seejärel täideti katseklaas 5ml-se mahuni puhverlahusega ja loksutati läbi. · Võeti 50ml mahuga suur katseklaas ning pipeteeriti sinna 25ml 2% kaseiini lahust, mille pH oli regluleeritud ensüümile sobivale väärtusele. Katseklaas varustati korgiga ning asetati 10 minutiks vesitermostaati 30±1C juurde soojenema. · Võeti 4 kuiva katseklaasi ning nummerdati need. Igasse katseklaasi pipeteeriti 3ml 5% TKÄ lahust. · Kaseiini lahusele pipeteeriti juurde 1ml valmistatud alkalaasi töölahust ning loksutati kiiresti läbi. Pärast loksutamist võeti kuiva pipetiga 3ml reaktsioonisegu ning pipeteeriti TKÄ lahusesse. Käivitatati ka stopper.
Vahelduvvoolusild P-38, juhtivusnõu, vesitermostaat, 100-ml mahuga mõõtekolvid, pipetid. Töö käik Töös kasutatakse juhtivusnõusse valatud elektrolüüdilahuse takistuse mõõtmiseks vaheluvvoolusilda P-38. Juhtivusnõu loputada paar korda uuritava lahusega ning seejärel pipeteerida vastavalt nõu mahule selline hulk, et elektroodod oleksid 3-5 mm ulatuses lahusega kaetud. Kõikide mõõtmiste puhul peab vedeliku hulk olema ühesugune. Juhtivusnõu asetada vesitermostaati, mille temperatuuri hoida püsivana 25°C. Juhtivusnõud hoida 10-15 min termostaadis, seejärel ühedada elektroodid vahelduvvoolusillaga ja mõõta lahusekihi takistus. Kui nõu on puhas, siis määratakse nõu konstant kindla kontsentratsiooniga (tavaliselt kasutatakse 0,02n) KCl lahuse abil, mis on laboratooriumis valmistatud kahekordselt kristallitud ning temperatuuril 600 °C kuumutatud KCl-st ning juhtivusveest. Elektroode loputatakse paar korda KCl lahusega
ensüümilahuse kohta. Töö käik · Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine o invertiini lahust võetalse 0,4ml o invertiini lahjendatakse 25x (kokku lahust 10ml) o lahustiks kasutatakse atsetaatpuhvrit pH 4,8 · Ensüümireaktsiooni läbiviimine o 50ml katseklaasi pipeteeritakse 25ml substraati (7% sahharoos atsetaatpuhvris) o katseklaas varustatakse korgiga o katseklaas 10 minutiks vesitermostaati 30 kraadi juurde soojenema o võetakse 3 250ml koonilist kolbi, kuhu pipeteeritakse 10ml komplekslahust o 10min pärast lisatakse substraadile 0,5ml invertaasi töölahust, loksutatakse läbi ja asetatakse tagasi termostaati o kohe pärast segu läbiloksutamist võetakse sellest 1ml lahust ja viiakse ühte komplekslahuse kolbi (0-proov) o järgmised 2 proovi võetakse 10 ja 20 minuti möödudes invertaasi lisamisest
Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine · Uuritava proteaasi lahusena kasutatakse alkalaasi (leelisproteaas, pH 8,4) · Alkalaasi kaaluti analüütilisel kaalul 7,6 mg (soovitatav oli 7,5 mg) ja tehti sellest 5 ml lahust boraatpuhvris (pH 8,4) · Lahus tehakse 10 ml graduleeritud katseklaasi Ensüümireaktsiooni läbiviimine · Võetakse 50 ml katseklaas, kuhu pipeteeritakse 25 ml 2% kaseiini lahust pH 8,4 juures · Klaas kaetakse korgiga ja asetatakse vesitermostaati 30 kraadi juurde 10 minutiks · Võetakse 4 kuiva katseklaasi ja nummerdadakse · Igaühte pipeteeritakse 3 ml 5% TKÄ lahust · 10 min möödudes pipeteeritakse kaseiinile juurde 1 ml valmistatud proteaasi lahust, reaktsioonisegu loksutatakse ja asetatakse termostaati tagasi. Fikseeritakse reaktsiooni alguse aeg · Peale proteaasi lisamist võetakse kuiva pipetiga 3 ml reaktsioonisegu ning viiakse see esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi ja loksutatakse
määratakse tiitrimisega, kasutades 0,02M vasksulfaadi lahust ja indikaatorit mureksiidi. Tiitrimiseks kulunud vasksulfaadi lahuse hulga järgi leitakse taandavate suhkrute kontsentratsioon (kaliibrimissirgelt). Töö käik Kasutati tahket invertaasi, mida kaaluti 0,01g ja millele lisati 5ml atsetaatpuhvrit, mille pH=4,8. Seda segati klaaspulgaga 5 minutit. 50ml katseklaasi pipeteeriti 25ml 7%-list sahharoosilahust atsetaatpuhvris (pH=4,8) ja katseklaas asetati vesitermostaati 30-kraadi juurde 10ks minutiks. Samal ajal valmistati ette kolm 250ml koonilist kolbi, pipeteerides sinna 10ml komplekslahust. Kui substraat termostaadis 10 minutit oli olnud, võeti see välja, lisati sellele 1ml invertaasi töölahust, loksutati katseklaasi, fikseeriti ensüümireaktsiooni algusaeg, võeti sealt kuiva pipetiga 1ml lahust ja asetati katseklaasi tagasi termostaati. Pipett tühjendati esimesse komplekslahusega kolbi. See oli 0-proov.
kontsentratsiooni iseloomustatakse aromaatsete tuumade sisalduse järgi, mis on spektrofotomeetiliselt hõlpsasti detekteeritavad. Saadakse kätte türosiini sisaldus erinevatel aegadel võetud proovidest. Töö käik Alkalaasi preparaadist valmistati boraatpuhvris, mille pH=8,4, lahus, lisades 0,01g alkalaasile 5ml boraatpuhvrit. Lahust segati klaaspulgaga kuni alkalaas lahustus. 50ml katseklaasi pipeteeriti 25ml 2%-list kaseiini lahust ja asetati vesitermostaati 30-kraadi juurde 10 minutiks. Samal ajal valmistati ette 4 katseklaasi, pipeteerides igaühte 3ml TKÄ lahust (5%). Pärast kaseiini soojendamist pipeteeriti kaseiinile juurde 1ml valmistatud alkalaasi töölahust, segu loksutati kiiresti läbi, fikseeriti aeg, võeti kuiva pipetiga 3ml reaktsioonisegu ja asetati katseklaas tagasi termostaati. 3ml reaktsioonisegu pipetis viidi esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi, see oli 0-prooviks.
gradueeritud katseklaasi. · Lisati väike kogus boraatpuhvrit (pH = 8,4) ja segati 5 min klaaspulgaga. Seejärel täideti katseklaas 5ml-se mahuni boraatpuhvriga ja loksutati läbi. · Võeti 50ml mahuga katseklaas ning pipeteeriti sinna 25ml 2% kaseiini lahust, mille pH oli regluleeritud ensüümile sobivale väärtusele. Katseklaas kaetakse korgiga ning asetati 10 minutiks vesitermostaati 30±1C juurde soojenema. · Võeti 4 kuiva 20ml katseklaasi ning nummerdati need. Igasse katseklaasi pipeteeriti 3ml 5% TKÄ lahust. · Kui kaseiini lahus on 30-ni soojenenud, pipeteeritakse kaseiini lahusele juurde 1ml valmistatud alkalaasi töölahust ning loksutati kiiresti läbi. Pärast loksutamist võeti kuiva pipetiga 3ml reaktsioonisegu ning pipeteeriti TKÄ lahusesse. Käivitatati stopper.
vedelat preparaati pipetiga gradueeritud katseklaasi, millele lisasin atsetaatpuhvrit (pH=4,8) kuni lahuse maht oli 10 ml. Seega teostasin 40 x lahjenduse. Sulgesin katseklaasi korgiga ja loksutasin lahust kontsentratsiooni ühtlustamiseks. 2. Võtsin 50 ml mahuga katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 ml substraati, milleks oli 7% sahharoosi lahus atsetaatpuhvris(pH=4,8). Katseklaasile panin korgi peale ning asetasin 10 minutiks vesitermostaati 30±1C° juurde. 3. Võtsin kolm 250 ml koonilist kolbi, kuhu pipeteerisin 10 ml komplekslahust, milleks oli Cu(II)-triloon B kompleks. 4. Kui substraat saavutas termostaadis vastava temperatuuri, lisasin 1 ml uuritavat töölahust, loksutasin läbi ja võtsin lahusest 0-proovi ehk pipeteerisin samast lahusest koonilisse kolbi 1 ml töölahust ja käivitasin stopperi. 5. 10 ja 20 minuti pärast pipeteeritakse ülejäänud kahte kolbi samuti 1 ml töölahust.
C2 taandavate suhkrute sialduse 0 proovis, mg V1 hüdrolüüsisegu üldmaht, ml 1000 tegur üleminekuks mikrogrammidele T hüdrolüüsi kestus, s 180 glükoosi moolmass V2 proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, ml V3 uurimiseks võetud invertaais lahuse maht, ml. Töö käik. 1. 100 ml koonilisse kolbi pipeteeritakse 25 ml 7%- list sahharoosi lahust, mille ph on 4,8 (reguleeritud atsetaatpuhvri abil). Lahus asetatakse vesitermostaati 30ºC juurde soojenema (5- 10 min). Tehakse ka uuritav invertaasi lahus. selleks kaalutakse 0,0208 g tahket invertaasi ja lahustatakse seda atsetaatpuhvris 5 ml-ni (pH = 4,8). 2. Kolme koonilisse kolbi mahuga 250-300 ml pipeteeritakse 10 ml komplekslahust. 3. 5-10 min. pärast sahharoosi lahusele lisatakse 0,5 ml uuritavat invertaasilahust., loksutatakse ja käivitatakse stokker või fikseeritakse ensüümireaktsiooni alguse aeg kella järgi. 4
Vabanenud triloon B kogus määratakse 0,02 M vasksulfaadi lahusega tiitrides, indikaatoriks mureksiid. 1 kat on ensüümi hulk, mis produtserib 1 s jooksul 30C juures 1 mol taandavat suhkrut (kutsub esile 1 mol sahharoosi hüdrolüüsi). Töö käik: Sahharoosi hüdrolüüsi läbiviimine: pipeteerisin 100 ml katseklaasi 25 ml 7 %-list sahharoosi lahust (substraat, mille pH on atsetaatpuhvriga reguleeritud väärtusele 4,8) ja asetasin selle vesitermostaati 30C juurde soojenema (10 minutit). Valmistasin uuritava invertaasi lahuse: kasutasin tahket invertaasi (Invertaas, 3.2.1.26), valmistasin 5 ml lahust kontsentratsiooniga 2-3 mg/ml selleks võtsin 0,0140 g invertaasi ja lahustasin selle puhvris. Valmistasin ette kolvid taandavate suhkrute määramiseks: pipeteerisin kolme 250 ml koonilisse kolbi 10 ml komplekslahust. Soojenenud sahharoosi lahusele lisasin 1 ml uuritavat lahust, loksutasin ja käivitasin stopperi.
spektrofotomeetriliselt (väljendatakse türosiini kontsentratsioonina mg/ml või µmol/ml) Töö käik Uuritavaks proteaasiks oli esperaas. Sellest valmistati töölahus kontsentratsiooniga 3-4 mg/ml. Analüütilistel kaaludel kaaluti 0,0203 g tahket ensüümpreparaati, viidi see gradueeritud katseklaasi, lisati puhverlahus (5 ml) ning segati klaaspulgaga, kuni ensüüm oli lahustunud. 50 ml katseklaasi pipeteeriti 25 ml 2% kaseiini lahust, katseklaas suleti korgiga ning asetati vesitermostaati 30 °C juurde 5-10 minutiks. 1 4 kuiva 20 ml katseklaasi pipeteeriti 3 ml 5% trikloroäädikhappe lahust. Kui kaseiini lahus oli termostaadis soojenenud, pipeteeriti sellele 1 ml proteaasi töölahust, segu loksutati. Kohe võeti sellest 3 ml reaktsioonisegu ning viidi esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi (0-proov). Reaktsiooniseguga katseklaas pandi tagasi termostaati.
Selleks kaaluti analüütilistel kaaludel 0,0049 g ensüümipreparaati ja viidi kvantitatiivselt 5 ml gradueeritud katseklaasi. Lisati väike kogus puhverlahust ja loksutati, kuni ensüüm lahustunud on. Seejärel täideti kolb puhverlahusega 5 ml märgini. 2 Võeti 50 ml mahuga suurem katseklaas, kuhu pieteeriti 25 ml 2% kaseiini lahust ja asetati vesitermostaati 30 oC juures umbes 10 minutiks soojenema. Võeti 4 kuiva katseklaasi, need nummerdati ja igaühte pipeteeriti 3 ml 5% trikloroäädikhappe lahust. Kui kaseiin oli 30 kraadini soojenenud, alustati kaseiini hüdrolüüsi. Kaseiinile pipeteeriti juurde 1 ml savinaasi lahust, loksutati ja fikseeriti aeg. Pärast ensüümi lisamist võeti kiiresti 3 ml reaktsioonisegu ning viidi esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi (0-proov). Loksutati hoolega
reaktsioonisegus. Invertaasi aktiivus avaldatakse tahke preparaadi korral mikrokatalites 1 g kohta (µkat/g). Töö käik Tahkest ensüümipreparaadist valmistati kontsentratsiooniga 4-5 mg/ml töölahus. Selleks võeti 0,0245 g tahket invertaasi preparaati, mis lahustati 5 ml atsetaatpuhvris, mille ph oli 4,8. 50 ml katseklaasi pipeteeriti 25 ml 7% sahharoosi lahust atsetaatpuhvris (ph 4,8). Katseklaas suleti korgiga ning asetati vesitermostaati 30°C juurde umbes 10 minutiks. Kolme 250 ml koonilisse kolbi pipeteeriti 10 ml komplekslahust (ekvimolaarsetes hulkades CuSO4 ja triloon B, kõrge kontsentratsioon Na2CO3 lahuses) ~10 minuti pärast lisati termostaadis soojendatud substraadile 1 ml invertaasi töölahust, loksutati nind asetati tagasi termostaati. Fikseeriti reaktsiooni alguse aeg. Pärast reaktsioonisegu läbiloksutamist võeti sellest 1 ml lahust ning viidi ühte komplekslahust sisaldavasse kolbi
reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine • Uuritava proteaasi lahusena kasutatakse alkalaasi. • Alkalaasi kaaluti analüütilisel kaalul 17,9 mg ja tehti sellest 5 ml lahust boraatpuhvris (pH 8,4) gradueeritud katseklaasi Ensüümireaktsiooni läbiviimine • Võetakse 50 ml katseklaas, kuhu pipeteeritakse 25 ml 2% kaseiini lahust pH 8,4 juures • Klaas kaetakse korgiga ja asetatakse vesitermostaati 30 kraadi juurde 10 minutiks • Võetakse 4 kuiva 20 ml katseklaasi ja nummerdadakse • Igaühte pipeteeritakse 3 ml 5% TKÄ lahust • 10 min möödudes pipeteeritakse kaseiinile juurde 1 ml valmistatud proteaasi lahust, reaktsioonisegu loksutatakse ja asetatakse termostaati tagasi. Fikseeritakse reaktsiooni alguse aeg • Peale proteaasi lisamist võetakse kuiva pipetiga 3 ml reaktsioonisegu ning viiakse see esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi ja loksutatakse
värske sade. Juhtivusnõu tuleb käsitseda erilise hoolikusega - elektroode ei tohi puudutada, samuti ei tohi neid katse vältel teineteise suhtes nihutada. Juhtivusnõu loputatakse paar korda uuritava lahusega ja seejärel pipeteeritakse vastavalt nõu mahule selline lahuse hulk, et elektroodid oleksid 3 - 5 mm ulatuses kaetud. Nõu täitmise pipetiga tingib nõue, et kõikide määramiste puhul oleks vedeliku hulk ühesugune. Pärast gaasimullide eraldumist asetatakse juhtivusnõu vesitermostaati, mille temperatuuri hoitakse püsivana 25,0±0,1 °C juures, erijuhtudel ka mõnel teisel juhendaja poolt määratud temperatuuril. Kui lahus juhtivusnõus on saavutanud termostaadi temperatuuri (mitte varem kui 10 - 15 minuti pärast), ühendatakse elektroodid vahelduvvoolusillaga ja mõõdetakse lahusekihi takistus. Lahusekihi takistuse mõõtmine vahelduvvoolusillaga P-38 toimub järgmiselt: 1) sild ühendatakse vooluvõrku;
toimel ja järgneval trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. 1. Uuritavaks proteaasiks on alkalaas, millest ma valmistasin 5ml lahust kontsentratsiooniga 1,5 mg/ml. 2. Võtsin 25 ml mahuga suure katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 ml 2%-list kaseiinilahust, mille pH on reguleeritud ensüümile sobivale väärtusele. Klaasi katsin korgiga ja asetasin vesitermostaati 30 °C juurde umbes 510 minutiks 3. Võtsin 4 kuiva normaalmõõdus (20 ml) katseklaasi ja nummerdasin. Igaühte pipeteerisin 3 ml 5%-list TKÄ lahust 4. Termostaadis olevevale kaseiinilahusele lisasin ensüümi ning märkisin reaktsiooni alguse aja üles. 5. Peale ensüümi lisamist võtsin puhta kuiva pipetiga võimalikult kiiresti 3 ml reaktsioonisegu ning viisin TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi (0-proov) ja loksutasin.
hulkades (1:1) CuSO4 ja etüleendiamiintetraäädikhappe dinaatriumi soola. Tiitrimisel toimuv reaktsioon on järgmine: Töö käik Valmistasin töölahust, selleks kaalusin 0,0151 g tahket invertaasi preparaati ja segasin 5 ml atsetaatpuhvriga, mille pH oli 4,8. 15 ml tuubi pipeteerisin 10 ml 7% sahharoosi lahust atsetaatpuhvris (pH 4,8) . Tuub suleti korgiga ning asetati vesitermostaati 30 oC juurde umbes 10 minutiks. Võetsin kolm koonilist kolbi mahuga 250 ml, kuhu pipeteerisin igasse 10 ml komplekslahust. Kolbidesse viiakse reaktsioonisegust (=hüdrolüüsisegust) kindlatel aegadel võetud proovid, et neis määrata taandavate suhkrute sisaldust. Kui substraat on termostaadis saavutanud temperatuuri 30ºC, lisasin sellele 0,4 ml invertaasi töölahust ja loksutasin. Kohe peale reaktsioonisegu läbiloksutamist võetakse sellest
Triloon B tiitritakse 0,02M vasksulfaadi lahusega (indikaatorina mureksiidi vesilahus). Invertaasi aktiivsus määratakse mikrokatalites 1 ml ensüümilahuse kohta. Antud katses kasutatakse invertaasi asemel vedelat invertiini. Töö käik: Suurde katseklaasi (50 ml katseklaas) pipteerisin sahharoosi hüdrolüüsiks 25 ml 7%-list sahharoosi lahust, mille pH on atsetaatpuhvi abil reguleeritud väärtusele 4,8. Lahus asetasin vesitermostaati 30°C juurde soojenema umbes 5 10 minutiks. Kolme 250 ml koonilisse kolbi pipeteerisin 10 ml komplekslahust. Invertaasi asemel kasutasin vedelat invertiini. Valmistasin invertiini 20 kordse lahjenduse. Selleks pipeteerisin katseklaasi 0,5 ml invertiini ja pipeteerisin juurde 9,5 ml atsetaatpuhvrit. Umbes 10 minuti pärast lisasin temperatuurile 30 C termostateeritud sahharoosi lahusele 0,5ml invertiini lahuse lahjendust. Loksutasin ja fikseerisin ensüümreaktsiooni alguse kellaaja.
Ensüümi kaalun analüütlilisel kaalul, viin kvantitatiivselt gradueeritud katseklaasi, lisan vajaliku puhvri koguse ning segan umbes 5 minutit klaaspulgaga ühtlase lahuse tekkimiseni. II. Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine o Võtan 50ml katseklaasi, kuhu pipeteerin 25ml 7%-list sahharoosi lahust atsetaatpuhvris pH väärtusega 4,8. Sulgen katseklaasi korgiga ja panen katseklaasi 5-10 minutiks vesitermostaati umbes 30 0C juurde soojenema. o Pipeteerin kolme 250ml koonilisse kolbi 10 ml komplekslahust. o Kui substraat on teermostaadis saavutanud temperatuuri 30 0C, lisan sellele 1ml uuritavat invertaasi töölahust ja loksutan. o 42 sekundit pärast reaktsioonisegu loksutamist võtan sellest kuiva pipetiga 1ml lahust ja viin ühte komplekslahusega kolbi, see on 0-proov
värske sade. Juhtivusnõu tuleb käsitseda erilise hoolikusega - elektroode ei tohi puudutada, samuti ei tohi neid katse vältel teineteise suhtes nihutada. Juhtivusnõu loputatakse paar korda uuritava lahusega ja seejärel pipeteeritakse vastavalt nõu mahule selline lahuse hulk, et elektroodid oleksid 3 - 5 mm ulatuses kaetud. Nõu täitmise pipetiga tingib nõue, et kõikide määramiste puhul oleks vedeliku hulk ühesugune. Pärast gaasimullide eraldumist asetatakse juhtivusnõu vesitermostaati, mille temperatuuri hoitakse püsivana 25,0±0,1 °C juures, erijuhtudel ka mõnel teisel juhendaja poolt määratud temperatuuril. Kui lahus juhtivusnõus on saavutanud termostaadi temperatuuri (mitte varem kui 10 - 15 minuti pärast), ühendatakse elektroodid vahelduvvoolusillaga ja mõõdetakse lahusekihi takistus. Lahusekihi takistuse mõõtmine vahelduvvoolusillaga P-38 toimub järgmiselt: 1) sild ühendatakse vooluvõrku;
Mõõdan automaatpipetiga 1 ml vedelat ensüümpreparaati ning viin selle gradueeritud katseklaasi. Lisan 9 ml atsetaatpuhvrit. Alglahus: 0,2 ml, 50 x lahjendus kokku 10 ml Sulen katseklaasi korgiga, lahust loksutan kontsentratsiooni ühtlustamiseks. Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüs) läbiviimine Pipeteerisin 50 ml mahuga katseklaasi 25 ml 7%-list sahharoosi lahust atsetaatpuhvris pH-ga 4,8 (substraat). Sulgesin katseklaasi korgiga ning asetasin vesitermostaati 30°C juurde soojenema 10 minutiks. Pipeteerisin kolme 250 ml-sse koonilisse kolbi 10 ml komplekslahust. Kui substraat oli saavutanud termostaadis temperatuuri 30°C, lisasin sinna 1 ml invertaasi töölahust, loksutasin ning võtsin sellest reaktsioonisegust 1 ml lahust ja viisin ühte komplekslahusega kolbi (0-proov). Seejärel asetasin katseklaasi tagasi termostaati. 10 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võtsin reaktsioonisegust 1 ml lahust ning viisin teise komplekslahusega kolbi
Tuleb valmistada vajalik kogus sobiva ensüümikontsentratsiooniga lahust. Lahustina kasutan atsetaatpuhvrit, mille pH=4,8. Mõõdan pipetiga 0,5 ml vedelat ensüümpreparaati ning viin selle gradueeritud katseklaasi. Lisan 9,5 ml atsetaatpuhvrit. 2. Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine Pipeteerisin 50 ml mahuga katseklaasi 25 ml 7%-list sahharoosi lahust atsetaatpuhvris pH-ga 4,8 (substraat). Sulgesin katseklaasi parafilmiga ning asteasin vesitermostaati 30°C juurde soojenema. Pipeteerisin kolme 250 ml koonilisse kolbi 10 ml komplekslahust. Kui substraat oli saavutanud termostaadis temperatuuri 30°C, lisasin sinna 0,5 ml invertaasi töölahust, loksutasin ning võtsin sellest reaktsioonisegust 1 ml lahust ja viisin ühte komplekslahusega kolbi (0-proov). Seejärel asetasin katseklaasi tagasi termostaati. 10 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võtsin reaktsioonisegust 1 ml lahust ning viisin teise komplekslahusega kolbi.
reaktsioonisegus. Invertaasi aktiivus avaldatakse vedela preparaadi korral mikrokatalites 1 ml kohta (kat/ml). Töö käik Lahustina kasutatati atsetaatpuhvrit pH väärtusega 4,8. Invertaasi preparaati lahjendatati puhvriga 20 korda. Arvutati välja vedela preparaadi vajalik maht (0,5 ml ensüümilahust, 9,5 ml tsetaatpuhvrit). 50 ml katseklaasi pipeteeriti 25 ml 7% sahharoosi lahust atsetaatpuhvris. Katseklaas suleti korgiga ning asetati vesitermostaati 30°C juurde umbes 10 minutiks. Kolme 250 ml koonilisse kolbi pipeteeriti 10 ml komplekslahust . 5 minuti pärast lisati termostaadis soojendatud substraadile 1 ml invertaasi töölahust, loksutati. Kiiresti võeti 1 ml lahust ja pandi komplekslahusega kolbi (see oli 0-proov, selles määratav taandavate suhkrute sisaldus näitab hüdrolüüsi alghetke olukorda) ning töölahus asetati tagasi termostaati. Fikseeriti reaktsiooni alguse aeg.
mg/ml. Analüütilistel kaaludel kaalun 25 mg ensüümi. Minu kaalutis on 0,0258 g. Viin kadudeta ensüümi gradueeritud katseklaasi ja lisan 5 ml atsetaatpuhvrit pH väärtusefa 4,8. Segan klaaspulgaga u 5 min kuni ensüüm on lahustunud. Ensüümreaktsiooni läbiviimine Võtan 50 ml mahuga katseklaas, kuhu pipeteerin 25 ml substraati, milleks on 7%-line sahharoosi lahus atsetaaspuhvris (pH = 4,8). Katseklaas varustan korgiga ja asetan 10 minutiks vesitermostaati 30±1°C juurde soojenema. Võtan kolm koonilist kolbi mahuga 250 ml, kuhu pipeteerin 10 ml komplekslahust. Nummerdan neid. Kui substraat on soojenenud, lisan sellele 1 ml uuritavat invertaasi töölahust. Lahust loksutan läbi ja fikseerin ensüümireaktsiooni alguse aeg. Võtan kuiva pipetiga 1 ml lahust ja viin esimesse kolbi, kus on komplekslahus (0-proov). Kohe asetan katseklaas termostaati tagasi.
· Hiljem viisin katseklaasis oleva lahuse sobiva mahuni, milleks oli 5 mL ja lisasin katseklaasile korgi ja loksutasin seda, et ensüümi kontsentratsioon lahuses ühtlustuks. Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine · Võtsin 50 mL lahuga katseklaasi, kuhu pipeteerisin pipetiga 25 ml 2%-list kaseiini lahust, mille pH oli reguleeritud ensüümile sobivale väärtusele. Asetasin katseklaasile korgi ja asetasin eelnevalt soojendama pandud vesitermostaati 30°C juurde 10ks minutiks soojenema. · Järgnevalt nummerdasin 4 kuiva katseklaasi ja pipeteerisin igaühte 3 ml 5%-list trikloroäädikhappe lahust. · Pärast kaseiini soojendamist võtsin ta termostaadist välja ja alustasin kaseiini hüdrolüüsi. Alguses pipeteerisin kaseiinile juurde 1 ml valmistatud proteaasi töölahust. Loksutasin reaktsioonisegu kiiresti ja viisin 3 ml reaktsioonisegu esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi ja loksutasin seda
on elektrolüüt. Dissotsiatsioonikonstant sõltub ratsioonist. MC226, vesitermostaat, 100- ml mahuga amiseks juhtivusnõud MC226 või juhtivusnõusse voolusilda P-38. ahused valmistatakse 100-ml mõõtekolbidesse el ja järkjärgulisel lahjendamisel juhtivusveega katseviga suureks. a uuritava lahusega ja seejärel pipeteeritakse elektroodi ava oleks 3 - 5 mm ulatuses kaetud. tsiooniga lahusest. miste puhul oleks vedeliku hulk ühesugune. Pärast eelektroodiga vesitermostaati, mille temperatuuri el teisel juhendaja poolt määratud temperatuuril. Kui em kui 10 - 15 minuti pärast), alustatakse mõõtmist. Off″ abil.Mõõtmiseks tuleb vajuta klahvile ″Read″, ks tuleb vajutada uuesti klahvile ″Read″ või ootata seklaas kaks korda loputada selle uue lahusega ks tuleb vajutada uuesti klahvile ″Read″ või ootata seklaas kaks korda loputada selle uue lahusega Elektrolüüt: CH3COOH
Siis sobiv ensüümi kontsentratsioon 1-5 mg/ml.(me võtame aga 3 mg/ml) . Siis 5 ml lahuse valmistamiseks on vaja 15 mg ensüümi). Paneme gradueeritud katseklaasi 15mg enne kaalutatud preparaadi ja lisame puhverlahust 5ml kriipsuni.Segame 5 minuti. Ensüümi reaktsiooni läbiviimine: · Võtme suur 50 ml katseklaas kuhu pipeteerimie 25 ml substraati(7%line saharoosatsetaatpuhvris pH=4.8). Katseklaas asetataske 5-10 minutiks vesitermostaati 30C juurde. · Võtame 3 koonilist 250 ml kolbi, kuhu pipiteerimime 10 ml komplekslahust.Pärast kolbidesse viiakse reaktsioonisegust võetud proovid. · Võtame termostaadist 50 ml katseklaas substraadiga ja lisame 1ml ensüümilahust. Loksutame. Kohe võetme reaktsioonisegust 1ml lahust ja lisame esimesse 250 ml kolbi. (See on null proov). Fikseerime aega ja paneme reakstioonisegu tagasi termostaati.
mg/ml. Ensüümina kasutan savinaasi. Analüütilistel kaaludel kaalun 7,5 mg ensüümi. Minu kaalutis on 0,0081 g. Viin kadudeta ensüümi gradueeritud katseklaasi ja lisan väike kogus puhverlahust. Segan klaaspulgaga u 5 min kuni ensüüm on lahustunud. Seejärel lisan puhverlahust 5 ml-ni ja loksutan läbi. Ensüümreaktsiooni läbiviimine Võtam 50ml-line katseklaas, kuhu pipeteerin 25 ml 2%-list kaseiini lahust, Klaas katan korgiga ja asetan vesitermostaati 30°C juures umbes 5-10 minutiks soojenema. Võtan 4 kuiva katseklaasi ja nummerdan neid. Igaühte pipeteerin 3 ml 5%-list TKÄ lahust. Kui kaseiini lahus on soojenenud, pipeteerin temale juurde 1 ml savinaasi töölahust, kiiresti loksutan reaktsioonisegu läbi ja fikseerin reaktsiooni alguse aeg. Võimalikult kiiresti võtan puhta kuiva pipetiga 3 ml reaktsioonisegu, viin esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi (0- proov) ja loksutan hoolega.
neid katse vältel teineteise suhtes nihutada. Joon. Näited juhtivusnõudest Juhtivusnõu loputatakse paar korda uuritava lahusega ja seejärel pipeteeritakse vastavalt nõu mahule selline lahuse hulk, et elektroodid oleksid 3 - 5 mm ulatuses kaetud. Nõu täitmise pipetiga tingib nõue, et kõikide määramiste puhul oleks vedeliku hulk ühesugune. Pärast gaasimullide eraldumist asetatakse juhtivusnõu vesitermostaati, mille temperatuuri hoitakse püsivana 25,0±0,1 °C juures, erijuhtudel ka mõnel teisel juhendaja poolt määratud temperatuuril. Kui lahus juhtivusnõus on saavutanud termostaadi temperatuuri (mitte varem kui 10 - 15 minuti pärast), ühendatakse elektroodid vahelduvvoolusillaga ja mõõdetakse lahusekihi takistus. Lahusekihi takistuse mõõtmine vahelduvvoolusillaga P-38 toimub järgmiselt: 1) sild ühendatakse vooluvõrku;
Selleks kaalusin analüütilistel kaaludel 0,0080 g ehk 8 mg savinaasi, panin selle gradueeritud katseklaasi ning lisasin puhverlaust. Segasin lahust senikaua, kuni ensüüm oli täielikult lahustunud. Ensüümireaktsiooni (kaseiini hüdrolüüsi) läbiviimine Võtsin 50 mL mahuga suure katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 mL 2%-list kaseiini lahust, mille pH oli eelnevalt reguleeritud ensüümile sobivale väärtusele. Sulgesin katseklaasi korgiga ja panin vesitermostaati 30 C juurde u 10 minutiks soojenema. Võtsin 4 kuiva katseklaasi ja nummerdasin need. Seejärel pipeteerisin igasse katseklaasi 3 mL 5%-list TKÄ lahust. Pärast kaseiinilahuse soojenemist, alustasin ensüümireaktsiooni. Selleks pipeteerisin kaseiinile juurde 1 mL valmistatud proteaasi töölahust, loksutasin ning võtsin puhta kuiva pipetiga kiiresti 3 mL reaktsioonisegu, mille viisin esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi, loksutasin. See oli 0-proov.
ensüümi kontsentratsioon 2,94 mg/ml. Ensüümipreparaadi kaalumine toimus analüütilisel kaalul, lisasin vajaliku puhvri koguse ning segasin klaasi sisu 5 minuti vältel ettevaatlikult, kuni moodustus ühtlane suspensioon. Ensüümireaktsiooni läbiviimine · 50 ml katseklaasi pipeteerida 25 ml substraati (7%-line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris), katseklaas varustada korgiga, asetada 5-10 minutiks vesitermostaati 30C juurde soojenema. · Kolme koonilisse kolbi pipeteerida 10 ml komplekslahust. · Kui substraat on termostaadis saavutanud vajaliku temperatuuri (30C), lisada sellele 1 ml uuritavat invertaasi töölahust, loksutada ning asetada tagasi termostaati. Fikseerida ensüümireaktsiooni aeg! · Kohe pärast läbiloksutamist võtta reaktsioonisegust kuiva pipetiga 1 ml lahust ja viia ühte kolbidest, kus on komplekslahus. See on 0-proov ning proovi võtmine peab
lahjendus. Automaatpipeti abil võtsin 100l invertiini ning lisasin 5-ml kriipsuni atsetaatpuhvrit. Sulgesin katseklaasi korgiga ning loksutasin, et kontsentratsioon ühtlustuks Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine · Võetakse 50 ml mahuga katseklaas, kuhu pipeteeritakse 25 ml substraati (7%-line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris), katseklaas suletakse korgiga ja jäetakse vesitermostaati ~30 juurde soojenema. · Võetakse kolm 250 ml mahuga koonilist kolbi, kuhu pipeteeritakse 10 ml komplekslahust. Kolbidesse viiakse reaktsioonisegust erinevatel aegadel proove, et neis määrata taandavate suhkrute sisaldus. · Kui substraat on termostaadis saavutanud ~30, lisatakse sellele 1 ml uuritavat invertaasi töölahust, loksutatakse ja võetakse võimalikult kiiresti 1 ml uuritavat lahust, katseklaas asetatakse võimalikult kiiresti termostaati
· Valada ensüüm gradueeritud katseklaasi ja lisada vajalik atsetaatpuhvri kogus. · Segada klaasi sisu umbes 5 min. Klaaspulgaga,kuni ühtlase suspensiooni moodustumiseni. Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine 1) Võtan 50 ml mahuga katseklaas,kuhu pipeteerin 25ml substraati,milleks on 7%-line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH väärtusega 4,8. Katseklaas varustan fooliumiga ja asetan umbes 10 minutiks vesitermostaati 30 ºC juurde soojenema. 2) Võtan kolm koonilist kolbi mahuga 250 ml,kuhu pipeteerin 10 ml komplekslahust. 3) Kui substraat on termostaadis saavutanud temperatuuri 30 ºC lisan sellele 0,5ml uuritavat invertaasi töölahust,lahus loksutan kiiresti. Asetan katseklaas termostaati tagasi. 4) Kohe peale reaktsiooni segu läbiloksutamist võtan sellest kuiva pipetiga 1 ml lahust ja lisan ühte kolbidest,kus on kompleks lahus. See on 0-proov.
KATB47 alentjuhtivus erinevatel kontsentratsioonidel. Mõõdetakse juhtivusnõus elektroodide vahel paikneva lahusekihi takistus. Mõõ kistuse mõõtmiseks vahelduvvoolusilda P-38. na omadustest sõltub mõõtmise täpsus. Täpsete tulemuste saamiseks peavad elektroodid olema kaetud elektrolüütiliselt sad da, samuti ei tohi akse vastavalt nõu ku hulk ühesugune. Pärast gaasimullide eraldumist asetatakse juhtivusnõu vesitermostaati, mille temperatuuri hoitakse püs oolusillaga ja mõõdetakse lahusekihi takistus. Lahusekihi takistuse mõõtmine vahelduvvoolusillaga P-38 toimub järgmiselt: õrdlusõla ning reohordi abil. atakse uuesti; sendisse "K3". va kahekordselt destilleeritud veega (erijuhtivus alla 5·10-4 S·m-1). Elektroodide puhtust saab kõige paremini kontrollida juh (tavaliselt kasutatakse 0,02n) KCl lahuse abil, mis on laboratooriumis valmistatud kahekordselt kristallitud ning temperatuu
annaabi.ee 
