Invertaasi aktiivsuse määramine (0)

Invertaasi aktiivsuse määramine

Teooria

Invertaas süstemaatilise nimetusega β-D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas on ensüüm, mis kuulub glükosiidsidemete hüdrolaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni.
Oligo - või polüsahhariid + vesi –(glükosidaas)-> Monosahhariid + lühem oligo- või polüsahhariid
Invertaas katalüüsib β-D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades fruktoosi molekule:
β-D- fruktofuranosiid + H2O –(invertaas)-> β, D- fruktoos + mono - või oligosahhariid
Sahharoos on looduses kõige levinum β-D-fruktofuranosiid ja tema hüdrolüüsi produktideks on β-D-fruktoos ja α-D-glükoos. Sellepärast kasutataksegi invertaasi aktiivsuse määramisel tavaliselt substraadina sahharoosi. Tekkinud produktide kindlakstegemiseks kasutame kompleksomeetrilist meetodit, kus põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. Mis tänu tugevalt aluselisele reaktsioonile toimid ta invertaasile mille pH = 4,8 inaktiveerivalt ja lõpetab reaktsiooni ning tagab vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)-triloon B kompleksi. Keetmisel taandub kompleksist Cu(II) suhkrute toimel
Cu(I)-ks ja moodustub Cu2O, mis eraldub punase sademena. Lahusesse jääb vaba triloon B, mis keetmise toimel moodustab kompleksi naatriumiga ja tiitrimisel 0,02M vasksulfaadi lahusega jällegi laguneb ning võimaldab Cu(II) ioonidega triloon B kompleksi taastekke.

Töö käik

• Ensüümist valmistati 10ml 20x lahjendusega ensüümi lahust gradueeritud katseklaasi. (0,5ml ensüümi + 9,5ml atsetaat puhvrit). Katseklaasi sisu segati 5min vältel ettevaatlikult.
  
• Võeti 50ml mahuga katseklaas , kuhu pipeteeriti 25ml substraati, milleks on 7% sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH = 4,8. Katseklaasile pannakse kork ning asteatakse 10 minutiks vesitermostaati 30±1C juurde.
  
• Võeti kolm 250ml koonilist kolbi, kuhu pipeteeriti 10ml komplekslahust.
  
• Kui substraat saavutas termostaadis õige temperatuuri lisatakse 0,5ml uuritavat töölahust, loksutatakse läbi ja pipeteeritakse kiiresti 0,5ml töölahust ühte komplekslahusega kolbi ning käivitatakse stopper .
  
• 10 ja 20 minuti pärast pipeteeritakse ülejäänud kahte koonilisse kolbi 0,5ml töölahust.
  
• Koonilsi kolbe keeta elektripliidil püstjahutiga 10min alates keema mineku hetkest ning lõpetada keetmine lisades 150ml destileeritud vett.
  
• Kõikidesse kolbidesse lisada indikaatorina kolm tilka mureksiidi vesilahust, mis annab kolvis olevale lahusele violetse tooni.
  
• Viiakse läbi lahuste tiitrimine 0.02M CuSO4-ga kolbi vaikselt loksutades.
  

Tiitrimise tulemused

• Null lahus – 2ml 0,02M CuSO4 – 1,8mg/ml
  
• 10 min lahus – 6,9ml 0,02M CuSO4 – 6,1mg/ml
  
• 20 min lahus – 9,8ml 0,02M CuSO4 – 9,8mg/ml
  

Graafiku abilga leidsin neile mahutdele vastavad konsentratsioonid
Invertaasi aktiivsuse arvutamine A=[(C2 – C1) · V1 · 103 · L] / [T · 180 · V3 · V4]
A10=[(6,1 - 1,8) · 25,5 · 103 · 20] / [600 · 180 · 0,5 · 0,5] = 81,22
A20=[(9,8 - 1,8) · 25,5 · 103 · 20] / [1200 · 180 · 0,5 · 0,5] = 75,55

• Arvutan erinevuse:
  

(81,22 / 75,55) – 1 · 100% = 7,5%

Analüüs

7,5%-line erinevus tuli tõenäoliselt sisse tiitrimisel, sest aega mõõtsin praktiliselt sekundi-.kahe täpsusega, kui töölahust komplekslahusesse pipeteerisin ja sama lugu keetmisel. Tiitrimisel oli 20 minuti lahusega väga raske aru saada, millal see värv omastas roheka tooni ja tõenäoliselt läks tiitrimilahust sinna liiga palju.