Lipiidide reaktsioonid ning karotenoidide identifitseerimine ja sisalduse määramine (0)

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL
Keemiainstituut
Bioorgaanilise keemia õppetool
Biokeemia praktikumi laboratoorne töö
1.3 Lipiidide reaktsioonid
2.2 Karotenoidide identifitseerimine ja sisalduse määramine
Üliõpilane: Liis Hendrikson
Matrikli nr: 104191
Õpperühm: KATB 41
Juhedaja: Tiina Randla
1.3 LIPIIDIDE REAKTSIOONID
Töö teoreetilised alused
Lipiidid on heterogeenne ühendite rühm, mille molekulide keemilise ehituse iseloomulikuks tunnuseks on estersidemete esinemine. Lipiidid ei lahustu vees ega vesilahtustes, sest sisaldavad hüdrofoobseid aatomirühmi ja pikki süsivesinikradikaale. Lipiidid lahustuvad hästi apolaarsetes orgaanilistes solventides ja vähemal määral ka polaarsetes orgaanilistes solventides. Lipiide esineb kõikides organismides rakumembraani põhilise koostisainena, loomsetes organismides ja taimsetes kudedes energeetilise varuainena. Lipiididel on ka kaitse- ja regulatoorsed ülesanded, nad on signaalimolekulid ning on olulised hormonaalses tasakaalus.
Vastavalt molekuli ehitusele ja omadustele klassifitseeritakse lipiidid järgnevalt: rasvhapped , rasvad , glütserofosfolipiidid, sfingolipiidid, vahad, steroidid ja terpenoidid . Molekuli struktuuri järgi jaotatakse lipiidid ka liht-, liit- ja tsüklilisteks lipiidideks.
Rasvad on ehituselt rasvhapete glütserüülestrid. Nad on hüdrofoobsed rasvamolekulid, mis sobivad hästi toiduenergia säilitamiseks. Glütserofosfolipiidid on kõikide rakumembraanide peamine koostisosa ning nad on amfifiilsed molekulid, sest sisaldavad lisaks kahele rasvhappe radikaalile veel ka fosforhappe jääki, mille kaudu seonduvad erinevad aminoalkoholid ja moodustub polaarne tsenter. Amfifiilsuse tõttu saavad glütserofosfolipiidid moodustada vesikeskkonnas struktuure. Steroolide ehituslik alus on steraanituum ja nad on võimelised moodustama rasvhapetega estreid. Enam levinud loomne sterool on kolesterool , mida leidub paljudes loomsetes rakumembraanides ja mis tagab membraanide läbitavuse. Kolesteroolist toodetakse ka steroidhormoone, sapphappeid ja D-vitamiini.
1.3.1 Rasvapleki proov
Kõike lipiide iseloomustab see, et nad on lahustuvad orgaanilistes lahustites . Lipiidi sisaldava lahuse tilga kandmisel paberile ja lahusti ausutumisel moodustub lipiide sisaldava proovi korral paberile rasvaplekk , millest paberi läbipaistvus suureneb. Rasvaplekk on vastu valgust vaadates muust paberist heledam ja pimeda poole vaadates muust paberist tumedam .
Töö käik

• Võtsin 2 kuiva katseklaasi, millesse panin ~ 1 g (kummassegi erinevat) tahket ainet.
  
• Mõlemasse katseklaasi lisan mitte rohkem kui 0,5 ml orgaanilist lahustit.
  

Mõlemasse katseklaasi lisasin atsetooni.

• Loksutasin hoolikalt mõlemat katseklaasi.
  
• Lasin tahke aine settimiseks mõlemal katseklaasil ~ 5 minutit seista.
  

Sademe kohale tekkis mõlemas katseklaasis selge lahuse kiht.

• Kandsin mõlemast katseklaasist pipetiga tilga lahust filterpaberile.
  
• Lasin kuivada.
  
• Parema tulemuse saamiseks lisasin mõlemale paberile samadesse punktidesse lahuseid veel paari tilga jagu ning lasin paberitel kuivada.
  
• Kuivi pabereid vaatasin nii vastu valgust kui ka varju suunas.
  

Lahus 2. katseklaasist jättis paberile rasvapleki.
Järeldus
Rasvapleki jättis paberile lahus teisest katseklaasist, seega 2. analüüsitud tahke aine sisaldas lipiide.
1.3.2 Emulsioonitest
Emulsioonid on üks liik kahe- või enamafaasilistest süsteemidest, mida nimetatakse kolloidideks. Kolloidid koosnevad kahest mittesegunevast vedelikust, millest üks on jaotunud mikroskoopiliste tilgakestena teises vedelikus . Emulsioonid hajutavad läbivat valgust, seega emulsiooni moodustumisest annab informatsiooni selge lahuse muutumine häguseks.
Rasvade iseloomulikuks tunnuseks on hüdrofoobsus ja lahustumatus vees ja vesilahustes. Küll aga lahustuvad nad orgaanilistes solventides. Kui taolises solvendis valmistatud rasvalahus viia hüdrofiilsesse keskkonda ja seda intensiivselt segada või loksutada , siis moodustub õli-vees tüüpi emulsioon . Emulsioonid on üldlevinud toiduainete valdkonnas, värvitööstuses ja paljudel muudel elualadel. Reeglina on tegu rohkem kui kahekomponentsete süsteemidega, mis emulsiooni stabiilsuse eesmärgil sisaldavad ka stabiliseerivaid lisandeid.
Töö käik

• Kahte kuiva katseklaasi valasin 1 ml kahte erinevat uuritavat lahust, millest üks sisaldas lipiide, teine mitte.
  
• Katseklaase loksutasin.
  
• Lisasin mõlemasse katseklaasi 4 ml destilleeritud vett.
  
• Loksutasin katseklaase intensiivselt.
  

Esimese uuritava lahuse korral muutus lahus häguseks.
Järeldus
Eelnevalt orgaanilises solvendis olevad orgaanilised lahused viisin vesikeskkonda ning segasin intensiivselt, mille tulemusena muutus 1. katseklaasis olnud uuritav lahus häguseks. See annab tunnistust sellest, et katseklaasi tekkis õli-vees tüüpi emulsioon ning seega võib järeldada, et 1. uuritav lahus sisaldas lipiide.
1.3.3 Akroleiiniproov
Glütserooli kuumutamisel (eriti vett siduvate ainete juuresolekul) tekib terava lõhnaga küllastamata aldehüüd propenaal ehk akroleiin . Reaktsioon toimib samuti rasvade ja glütserofosfolipiididega, kui ei toimu glütserooli mittesisaldavate lipiidide korral. Akroleiini moodustumine võimaldab otsustada, kas uuritav lipiid sisaldab glütserooli või mitte.
Töö käik

• Kahte kuiva katseklaasi kandsin ~ 1 g .
  
• Lisasin mõne tilga kahest erinevast uuritavast materjalist (akroleiinitesti proovid 1 ja 2).
  
• Katseklaase kuumutasin tõmbekapis gaasipõleti kohal kuni soola sulamiseni ja proovi tumenemiseni.
  
• Nuusutasin ettevaatlikult katseklaasidest eralduvat lõhna.
  

Tundsin 2. proovist eralduvat vängemalt lõhna.
Järeldus
Gaasipõleti kohal katseklaase kuumutades, eraldus teisest katseklaasist märgatavalt intensiivsemalt ebameeldivat lõhna. Seega 2. katseklaas sisaldas proovi, mis on glütserooli sisaldav lipiid.
1.3.4 Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiidides
Küllastumata rasvhapete esinemise kindlakstegemiseks lipiidides kasutatakse reaktsiooni halogeenidega. Küllastunud rasvhappeid sisaldava proovi reaktsioonil broomiga sellele iseloomulik pruun värvus ei kao, kuid küllastumata rasvhapete sisalduse puhul muutub lahus liitumisreaktsiooni tõttu momentaalselt värvituks.
Töö käik

• Kolme puhtasse ja kuiva katseklaasi valasin igasse 2 ml erineva lipiidi lahust orgaanilises lahustis .
  

Esimesse katseklaasi valasin palmitiinhappe, teise katseklaasi valasin oliivõli ning kolmandasse katseklaasi valasin searasva lahuseid.

• Kõikidesse katseklaasidesse lisasin tilkhaaval võrdse koguse (~ 5 tilka) broomi lahust kloroformis (triklorometaanis)
  
• Loksutan katseklaase.
  

Vaid esimeses katseklaasis ei kadunud broomile iseloomulik pruun värvus, kui teistes katseklaasides kadus .
Järeldus
Katseklaasis, kus oli palmitiinhape, ei kadunud broomile iseloomulik pruun värvus ära, mis tõendab, et lahus katseklaasis sisaldas küllastunud rasvhappeid. Katseklaasides, kus olid oliivõli ja searasva lahused, muutusid lahused värvituks, mis tõendab, et antud lahused sisaldasid küllastumata rasvhappeid.
1.3.5 Liebermann -Burchard’i kolesterooli määramise test
Kolesterooli reageerimisel äädikhappe anhüdriidiga väävelhappe keskkonnas moodustub tume sinakas -rohelise värvusega reaktsioonisegu. See on mitmeastmeline reaktsioon ja lõpliku värvuse kujunemist saab märgata üle punase ja sinise vaheühendi. Reaktsioonideahela lõpuks tekib kolesterooli polüeensete sulfoonhappe derivaatide segu.
Töö käik

• Kolme puhtasse ja kuiva katseklaasi valasin igasse 2 ml erineva lipiidi lahust metüleenkloriidis.
  

Esimesse katseklaasi lisasin puhast kolesterooli lahust, teise katseklaasi oliivõli ja kolmandasse katseklaasi searasva lahust.

• Igasse katseklaasi lisasin 6-7 tilka värsket äädikhappe anhüdriidi ja 4-5 tilka kontsentreeritud väävelhapet.
  
• Loksutasin hoolikalt.
  

Katseklaasis, kuhu olin algselt lisanud kolesterooli, oli värvusetu hägune lahus, milles oli valge hägu. Aja möödudes võis näha õrna sinaka kuma tekkimist lahusesse. Katseklaasis, kus oli oliivõli lahus, tekkis rohekas-pruunikas lahus. Katseklaasis, kus oli searasva lahus, tekkis õrnalt rohkeas-kollakas lahus.
Järeldus
Kolesterooli sisaldav lahus pidi muutuma tumedaks sinakas-roheliseks. Katse puhta koresterooliga seda aga ei juhtunud, kuigi oleks pidanud. Viga võis sisse tulla kas väävelhappe või äädikhappe vales koguses lisamises. Oliivõli lahus muutus reaktsiooni tulemusena tumedaks rohekas-pruunikaks lahuseks, mis võib viidata positiivsele kolesterooli määramise reaktsioonile, kuid oliivõlis ei tohiks sisalduda kolesterooli. Searasva lahus muutus õrnalt rohkekas-kollakaks, mis annab tunnistust kolesterooli sisaldusele searasvas, kuigi lahus muutis värvi vaevumärgatavalt. Lahus muutus küll rohekamaks, kuid õrnalt – ei tekkinud tumedat lahust, nagu oleks pidanud. Searasv siiski sisaldab kolesterooli. Kõikides katsetes sisse tulnud viga oli ilmselt põhjustatud minu enda hooletuses äädikhappe anhüdriidi või äädikhappe lisamisel.
2.2 KAROTENOIDIDE IDENTIFITSEERIMINE
JA SISALDUSE MÄÄRAMINE
Töö teoreetilised alused
Karotenoidid on fotosünteesi abipigmendid, mis sisalduvad taimerakkude kloroplastides ja kromoplastides, kuid ka mõnedes teistes fotosünteesivates organismides. Karotenoidid absorbeerivad valgust klorofüllist erinevatel lainepikkustel ja on seega täiendavateks kiirguse retseptoriteks.
Karotenoidid on arvukas ühendite rühm, mida keemilise ehituse poolest klassifitseeritakse kui tetraterpenoide. Nad on polüeensed ahelad, mille ühes või mõlemas otsas on reeglina 6-liikmelised ionoontsüklid. Kõige pikema ahelaga karotenoid on lükopeen, mis on tähtis ka paljude teiste karotenoidide sünteesis. Karotenoidide kaks põhigruppi on karoteenid (hapnikku mittesisaldavad molekulid) ja ksantofüllid (hapnikku sisaldavad molekulid).
Taimedes täidavad karotenoidid valguse absorbeerimise ja klorofüllile edastamise rolli, aga ka kaitsevad neelates liigset valguseenergiat ning kaitsevad nii rakke rotokahjustuste ja vabade hapnikuradikaalide eest.
Loomsed organismid ei sünteesi ise karotenoide, seega tuleb neil neid omastada taimse toiduga. Karotenoidide imendumiseks peavad nad vabanema taimerakkudest ning konjugeeruma sapphapetega. Kõik karotenoidid on värvilised. Nende värvus varieerub kollasest oranži ja isegi tumepunaseni. Mida rohkem karotenoid neelab valgust spektri nähtava osa lühematel lainepikkustel ja peegeldab pikematel lainepikkustel, seda intensiivsem on tema punane värvus. Karotenoididel on võime neelata valguskiirgust spektri nähtavas osas. See tuleneb nende molekuli ehitusest, mida iseloomustab polüeensus (molekul koosneb pikast konjugeeritud kaksiksidemeid sisaldavast süsivesinikahelast).
Uuritava materjali karotenoidset koostist ja sisaldust saab objektiivselt iseloomustada lahuse neeldumisspektri järgi. Neeldumisspekter on absorptsiooni ehk optilise tiheduse sõltuvus uuritavat lahust läbiva valguse lainepikkusest.
Antud laboratoorse töö eesmärgiks oli karotenoidide eraldamine taimsetest materjalidest, saadud karotenoidide segu neeldumisspektri määramine spektrofotomeetril ja selle alusel määrata kindlaks uuritavas lahuses sisalduv põhiline karotenoid ning selle sisalduse määramine taimses materjalis .
Töö käik
Proovi eelpeenestamine:

• Proovi eelpeenestamise viisin läbi noa ja riivi abil.
  

Minu prooviks oli toores porgand. Lõikasin sellest pisikese tükikese ja riivisin piisava koguse porgandit katse taimseks materjaliks .
Karotenoidide isoleerimine taimsest materjalist:

• Eelpeenestatud taimse materjali kaalusin tehnilistel kaaludel.
  

Kaalusin 0,73 g riivitud porgandit analüütilistel kaaludel.

• Viisin väljakaalutud proovi kaaluklaasist ilma kadudeta uhmrisse.
  
• Lisasin väikese koguse pestud liiva.
  
• Hõõrusin uhmri nuiaga kuni ühtlase massi saavutamiseni.
  
• Lisasin sinnasamasse väikeste portsjonitena veevaba , et taimses materjalis sisalduvat vett siduda.
  
• Jätkasin samal ajal massi hõõrumist.
  
• Lõpetasin soola lisamise, kui moodustus kuiv, pulbriline mass.
  
• Valisin sobiva suurusega kuiva anuma ekstrakti kogumiseks.
  

Valisin selleks anumaks 25 ml mõõtesilindri.

• Varustasin mõõtesilindri sobiva suurusega lehtriga ning asetasin sellele kuiva paberfiltri.
  
• Alustasin karotenoidide ekstraktsiooni proovist sobiva orgaanilise lahustiga. Selleks lisasin uhmris olevale peenestatud massile väikese koguse ekstrahenti.
  

Lisasin esimesel korral ~ 10 ml oktaani . Edaspidi lisasin väiksemate koguste kaupa (~ 5-10 ml), kuid piisavalt, et sademe kohalt oleks võimalik teelusikaga ekstrakti eraldada.

• Materjali segasin lusikaga.
  
• Lasin sademel põhja settida ja selle kohal oleva ekstrakti kandsin teelusika abil filtrile.
  

Ekstrakt sademe kohal oli kollane.

• Kordasin eelpool kirjeldatud operatsiooni kuni sademe kohal olev ekstrakt muutus värvusetuks.
  
• Määrasin kindlaks ekstrakti kogumahu.
  

Ekstraheerimisel sain ekstraksi 3 ml.
Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs:

• Täitsin klaasküveti poolenisti ekstraktiga.
  
• Järgnes neeldumisspektri võtmine spektrofotomeetriga.
  
• Spektrofotomeetri ekraaline joonistus uuritava lahuse neeldumisspekter, millel märkisin ära need lainepikkused, kus paiknesid iseloomulikud neeldumismaksimumid ja maksimumidele vastavad absorptsiooni ehk optilise tiheduse täpsed väärtused.
  
• Trükkisin neeldumisspektri välja.
  

Spektrofotomeetri andmed:
Ekstrakti optiline tihedus, ABS
Neeldumismaksimumid, nm
0,309
504,0
0,5435
472,0
0,5117
450,0
Enda katses saadud tulemusi laborimaterjalidega võrreldes, sain tulemuseks, et minu proov sisaldas enim lükopeeni.
Karotenoidi sisalduse arvutamine ( kvantitatiivne analüüs):
Laborimaterjalidest leidsin, et lükopeeni ekstinktsioonikoefitsient on .
Karotenoidi sisaldus
uuritavas proovis arvutatakse vastavalt järgmisele valemile:
Kus:
absorptsiooni väärtus, mis vastab arvutuse aluseks valitud neeldumismaksimumile
(kõrgemaile „tipule“ vastav A väärtus)
vaadeldava karotenoidi ekstinktsioonikoefitsient (1%-lise karotenoidi lahuse absorptsioon) sama
juures
ekstrakti kogumaht ,
kasutatud ekstrahendi tihedus,
uurimiseks võetud taimse materjali mass,
tegur milligrammidele üleminekuks
0,309 ABS
3450 ABS
3 ml
0,703
0,73 g
103 (tegur ülemikekuks grammidele)
Järeldus:
Porgandis sisaldub põhilise karotenoidina lükopeen. Selle sisaldus minu katses selgus, et oli .
Kirjanduse allikail esineb lükopeeni peamiselt punastes köögi- ja puuviljades, nagu tomat , arbuus ja punane paprika. Porgandis kui oranži värvusega köögivili, sisaldub enim
ja karoteen ning krüptoksantiin.1
Seega minu katse ei käi täielikult kooskõlas teooriaga. Antud katse oli mitmeetapiline, mis võis sisse tuua ka vea katsesse ning samuti oli see minu esimene kokkupuude spektrofotomeetriaga.
1 Fütotoitainete leidumine taimede värvuse järgi, Toitumine.ee ( http://www.toitumine.ee/public/Document2.pdf )