Kaisa Rahuoja 093421 KATB-41 Tallinna tehnikaülikool Matemaatika-loodusteaduskond Keemiainstituut 3.2. Proteolüütiliste ensüümide aktiivsuse määramine Kaisa Rahuoja 093421 KATB- 41 3.2. Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Kaisa Rahuoja 093421 KATB-41 3.2. Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Teooria Proteolüütilised ensüümid e. proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides Proteaase leidub kõikides organismides, kuna nad osalevad väga paljude füsioloogiliste funktsioonide täitmises, alustades toiduvalkude seedimisest ja lõpetades väga
TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL KEEMIAINSTITUUT Bioorgaanilise keemia õppetool YKL3312 Biokeemia praktikum Laboratoorne töö 3. Biokatalüüs 3.4 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Tallinn 2010 3.BIOKATALÜÜS 3.4 PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE TÖÖ TEOREETILISED ALUSED Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on arvukas rühm ensüüme, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi valkudes ja peptiidides. Reaktsiooni tulemuseks on erineva molekulmassiga peptiidid ja vabad aminohapped.
Laboratroorne töö V Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Töö eesmärk: Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine. Meetod põhineb kaseiini hürdolüüsil uuritava proteaasi toimel ja sellele järgneval hüdrolüüsiproduktide sisaldus spektofotomeetrilisel määramisel. Töövahendid: Analüütiline kaal, 5 ml mõõtekolb, 50 ml katseklaas, 4 kuiva katseklaasi, kell, pipetid, lehtrid, paberfiltrid, spektromeeter, vesitermostaat, kvartskvürett. Töö käik: Valmistatakse uuritava proteaasi lahus ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris. Selleks
Tallinna Tehnikaülikool 3.4 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Üliõpilane: Juhendaja: Tallinn 2010 Töö teoreetilised alused Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on rühm ensüüme, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi valkudes ja peptiidides
1 PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE (3.4.) Teooria Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on rühm ensüüme, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi valkudes ja peptiidides. Reaktsiooniproduktideks on erineva molekulaarmassiga peptiidid ja vabad aminohapped. Valkude hüdrolüüsiks nim proteolüüsi. Proteolüütilise aktiivuse ühikuks 1 µkat loetakse sellist ensüümi hulka, mis põhjustab 1 µmooli peptiidsidemete hüdrolüüsi 1 s vältel 30 oC juures. Kuna hüdrolüüsunud peptiidsidemete hulk ei ole otseselt mõõdetav, siis on üldlevinud proteolüütiliste ensüümide aktiivsuse avaldamine valgu hüdrolüüsi produktide hulga kaudu. Sõltuvalt uuritava proteaasi substraadispetsiifilisusest ja aktiivsuse pH-optimumist kasutatakse aktiivsuse määramisel erinevaid substraate
Laboratoorne töö IV Üliõpilane: Meelika Lukner (155308) Kuupäev: 08.04.2016 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Proteolüütilised ensüümid (ka proteaasid, proteinaasid või peptidaasid) on ensüümid, mis katalüüsivad proteolüüsi. Proteolüüs on peptiidsidemete hüdrolüüs valkudes ja peptiidides, mille tulemuseks on madalama molekulmassiga peptiidid ja aminohapped. Kuna proteaas täidab väga paljusid füsioloogilisi funktsioone, leidub seda kõikides organismides. Mõned protelüütilised ensüümid lõhustavad spetsiifilisi peptiidsidemeid (piiratud
Tallinna Tehnikaülikool TTÜ keemiainstituut Bioorgaanilise keemia õppetool Laboratoorne töö 3.2 PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE Õppejõud: Priit Eek, Kaia Kukk Tallinn 2013 Sissejuhatus Laboratoorse töö 3.2 teemaks oli proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine. Töö käigus valmistati töölahus, viidi läbi kaseiini hüdrolüüs (vajasime hüdrolüüsi produkte) ja mõõdeti seejärel reaktsiooniproduktide sisaldust spektrofotomeetril. Katses oli ensüümina kasutusel alkalaas. Teoreetiline osa Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid
Biokeeemia laboratoorne töö No 7 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine. Õpperühm: YAGB21 Töö teostaja: Alexander Kirichuk 123695 Õppejõud: Tiina Randla Õppejõu märkused: Proteaasi aktiivsus: taas kus on järeldused ja kokkuvõte? Mida uurisite, millise tulemuse saite? Kas see on ootuspärane? Antud juhul ei saa väga võrrelda teooria ja praktika kooskõla, aga oma töökultuurile saab hinnangu anda ikka. Konkreetsemalt otseselt töö sisusse puutuvalt: antud töös ei pea arvutama n aktiivsust
................................................................................... 4 Katse andmed..................................................................................................... 5 Arvutused............................................................................................................ 6 Järeldus............................................................................................................... 7 Sissejuhatus Laboratoorse töö 3.2 teemaks oli proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine. Töö käigus valmistati töölahus, viidi läbi kaseiini hüdrolüüs (vajasime hüdrolüüsi produkte) ja mõõdeti seejärel reaktsiooniproduktide sisaldust spektrofotomeetril. Katses oli ensüümina kasutusel alkalaas. Teoreetiline osa Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid
TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL Keemia instituut Bioorgaanilise keemia õppetool Biokeemia praktikumi laboratoorne töö 3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Üliõpilane: Liis Hendrikson Matrikli nr: 104191 Õpperühm: KATB 41 Juhendaja: Tiina Randla 3.2 PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE Töö teoreetilised alused: Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid (ka proteinaasid või peptidaasid) on ensüümis, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid
Mõned lõhustavad eelistatult vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (piiratud proteolüüs), teised aga toimivad kõikidele peptiidsidemetele (piiramatu proteolüüs). Vastavalt sellele, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele, eristatakse endo-ja eksopeptidaase. Optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi, milles ensüüm toimib, eristatakse hapusid (pH 2,5), neutraalseid (pH 7,2) ja leelisproteaase (pH 9,0) Proteolüütilise aktiivuse ühikuks 1 kat loetakse sellist ensüümi hulka, mis põhjustab 1 mooli peptiidsidemete hüdrolüüsi 1 s vältel 30 °C juures. Kuna hüdrolüüsunud peptiidsidemete hulk ei ole otseselt mõõdetav, siis on üldlevinud proteolüütiliste ensüümide aktiivsuse avaldamine valgu hüdrolüüsi produktide hulga kaudu. Käesolevas töös kasutati substraadina kaseiini see on piima põhivalk, koostiselt fosfoproteiin.
Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (pH 2,5), neutraalseid (pH 7,2) ja leelisproteaase (pH 9,0). Oluliseks proteaaside klassifikatsiooni aspektiks on aktiivtsentri ehitus (millised aminohapped sellesse kuuluvad) ja sellest tulenev ensüümi toimemehhanism. Siinkohal piirdume vaid nelja peamise rühma nimetamisega, süüvimata nende toimemehhanismide erinevustesse: seriin-, tiool-, aspartaat- ja metalloproteinaasid. Ensüümi proteolüütilise aktiivsuse ühikuks 1 kat loetakse sellist ensüümi hulka, mis põhjustab 1 mooli peptiidsidemete hüdrolüüsi või 1 mooli aminohapete vabanemise1 s vältel 30°C juures. Kuna hüdrolüüsunud peptiidsidemete hulk ei ole otseselt mõõdetav, siis ongi üldlevinud, et proteaaside aktiivsus avaldatakse valgu hüdrolüüsil vabanevate produktide, st aminohapete ja peptiidide hulga kaudu. Töö käik: Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi
C [Tyr] 0,054 0,0595 0,0765 0,0949 ARVUTUSED: kus türosiini kontsentratsiooni muutus valitud ajavaheikus (mg/ml) hüdrolüüsi kestus st valitud ajavahemik (s) reaktsioonisegu (substraat+ensüüm) üldmaht (ml) valmistatud alkalaasilahuse üldmaht (ml) 2 TKÄ lahusest tingitud proovi lahjendus (3 ml 6 ml, seega L=2) alkalaasi maht hüdrolüüsisegus (ml) g alkalaasi graanulite kaalutis (g) 181 türosiini molekulmass Leian alkalaasi proteolüütilise aktiivsuse A (kat/g): 3.2.3 Kokkuvõte ja järeldused Uuritavaks proteaasiks oli alkalaas, mille aktiivsuseks 30°C ja 8,4 pH väärtuse juures oli 3,12 . Kuna proovid on reaktsioonisegust võetud kaseiini hüdrolüüsi protsessi algfaasis, mil produktide kontsentratsiooni ja aja vahel valitseb lineaarne sõltuvus, siis peavad kõik neli punkti katse korrektse läbiviimise puhul langema sirgel. Sirge ei läbi koordinaatide
TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL Õppeaine YKL0063 Biokeemia PRAKTIKUM: Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Üliõpilane: Juhendaja: Kood: Esitatud: Sooritatud: 3.2 PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIVSUSE MÄÄRAMINE Teooria Proteolüütilised ensüümid e. proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides Proteaase leidub kõikides organismides, kuna nad
Sõltuvalt sellest, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele, eristatakse endo- ja eksopeptidaase. Kõik ülalnimetatud proteaasid kuuluvad endopeptidaaside rühma. Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (pH 2,5), neutraalseid (pH 7,2) ja leelisproteaase (pH 9,0). Olulisekd proteaaside klassifikatsiooni aspektiks on aktiivtsentri ehitus ja sellest tulenev ensüümi toimemehhanism. Ensüümi proteolüütilise aktiivsuse ühikuks 1 kat loetakse sellist ensüümi hulka, mis põhjustab 1 mooli peptiidsidemete hüdrolüüsi või 1 mooli aminohapete vabanemise 1 s vältel 30°C juures. Neutraalsete ja aluseliste proteaaside aktiivsuse määramisel kasutatakse substraadina reeglina kaseiini. Kaseiin on piima põhivalk, mis koostiselt on fosfoproteiin. Tänu kaseiini molekulide kõrgele hüdrofoobsusele esineb ta piimas mitsellidena.
kvartsküvette. Leidsin kaliibrimisgraafikult vastavalt proovide optilise tiheduse väärtustele D280 neis sisalduva türosiini kontsentratsiooni ning saadud katseandmete põhjal koostasin graafiku, mis väljendab türosiini kontsentratsiooni ja reaktsiooni kestvuse vahelist sõltuvust CTyr = f(t). Tabel . Katsetulemused Joonis . Türosiini kontsentratsiooni ja reaktsiooni kiiruse vaheline sõltuvus, CTyr = f(t) Arvutasin ensüümipreparaadi proteolüütilise aktiivsuse A (kat/g) vastavalt valemile: kus: C(Tyr) türosiini kontsentratsiooni muutus valitud ajavahemikus, mg/ml t hüdrolüüsi kestus st valitud ajavahemik, s V - reaktsioonisegu (substraat+ensüüm) üldmaht, ml V - valmistatud ensüümilahuse üldmaht, ml 2 TKÄ lahusest tingitud proovi lahjendus V - ensüümi maht hüdrolüüsisegus, ml g proteaasi preparaadi kaalutis, g 181 türosiini molekulmass Järeldus
Tallinna Tehnikaülikool Biokeemia Laboratoorne töö 3.2 Teostaja: 2016 3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid, on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaase leidub kõikides organismides, nad seedivad näiteks toiduvalke. Erinevad proteaasid omavad ka erinevat toimespetsiifikat. Mõned proteolüütilised ensüümid
Biokeemia praktikum Laboratoorne töö nr.3.2 Anna Logunova YAGB-22 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Teooria Proteolüütilised ensüümid ehk on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides ,produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteolüütiliste ensüümide arvukad esindajad omavad erinevat toimespetsiifikat. Mõned lõhustavad eelistatult spetsiifilisi, vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid
PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE 1. Töö teoreetilised alused 1.1 Töö eesmärk Töö eesmärk oli määrata proteolüütilise ensüümi aktiivsus, kasutades substraadina kaseiini ja proteaasi preparaadina alkanaasi. Kasutasin meetodit, kus toimus tänu proteaasile peptiidsideme hüdrolüüsi reaktsioon. Et sadestada põhja kõrgmolekulaarsed ühendid kasutasin trikloroäädikhapet ning mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määrasin spektrofotomeetrilisel meetodil. 1.2 Teooria Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad
Tallinna Tehnikaülikool YKL0060 Biokeemia Töö nr 3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Yasb 21 Juhendaja Tiina Randla 20.04.2012 Teooria Proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaase leidub kõikides organismides, sest nende ülesanded ulatuvad alates toiduvalkude seedimisest kuni väga kõrgreguleeritud ensüümireaktsioonide kaskaadideni nt vere hüübimise kaskaad.
Laboratoorne Töö pealkiri: töö nr: 2 Biokatalüüs, proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Õpperühm: Üliõpilane: YASB21 C Ilona Juhanson, 123964YASB Juhendaja: Tiina Randla Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsideme hüdrolüüsi, mille tagajärjel saadakse madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaase leidub kõigis organismides ning nad osalevad paljude füsioloogiliste funktsioonide täitmises, alates seedimisest ning lõpetades kõrgreguleeritud
Laboratoorne Töö pealkiri: töö nr: 2 Biokatalüüs, proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Õpperühm: Üliõpilane: YASB21 C Ilona Juhanson, 123964YASB Juhendaja: Tiina Randla Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsideme hüdrolüüsi, mille tagajärjel saadakse madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaase leidub kõigis organismides ning nad osalevad paljude füsioloogiliste funktsioonide täitmises, alates seedimisest ning lõpetades kõrgreguleeritud
Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Teooria Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Protreolüütiliste ensüümide esindajad omavad erinevat toimespetsiifikat. Mõned lõhustavad eelistatult spetsiifilisi, vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid, teised toimivad kõikidele peptiidsidemetele. Samas paljud bakteriaalsed proteaasid omavad väga nõrka spetsiifikat ja lagundavad valkudes praktiliselt kõiki peptiidsidemeid produtseerides vabu aminohappeid. Sõltuvalt sellest, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele sidemetele eristatakse endo- ja eksopeptidaase. Lisaks eristatakse proteaase veel optimaalse keskkonna pH järgi, kas hapudeks-, neutraalseteks- või leelisproteaasideks. Oluliseks proteaaside klassifikatsiooni aspektiks on...
TÖÖ 3.2 PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE Juhendajad: Kaia Kukk Priit Eek Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaase leidub kõikides organismides, nad seedivad näiteks toiduvalke. Mõned proteolüütilised ensüümid lõhustavad eelistatult spetsiifilisi, vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (piiratud proteolüüs), teised toimivad kõikidele peptiidsidemetele (piiramatu proteolüüs). Piiratud proteolüüsi viivad läbi näiteks trüpsiin, kümotrüpsiin, pepsiin, mis produtseerivad enamasti peptiide. Subtilisiin, savinaas ja alkalaas on bakteriaalsed proteaasid, mis lagundavad praktiliselt kõiki peptiidsidemeid, produtseerides v...
Tallinna Tehnikaülikool Keemia instituut Bioorgaanilise keemia õppetool Laboratoorne töö nr 3.2 PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE Tallinn 2013 Teooria Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Protreolüütiliste ensüümide esindajad omavad erinevat toimespetsiifikat. Mõned lõhustavad eelistatult spetsiifilisi, vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid, teised toimivad kõikidele peptiidsidemetele. Samas paljud bakteriaalsed proteaasid omavad väga nõrka spetsiifikat ja lagundavad valkudes praktiliselt kõiki peptiidsidemeid produtseerides vabu aminohappeid. Sõltuvalt sellest, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele sidemetele eristatakse endo- ja eksopeptidaase. Lisaks eristatakse proteaase...
fosfoleeritakse, selle tulemusel ensüüm kas inaktiveeritakse või aktiveeritakse. (Vaata loeng 9 slaid 6 joonist) Defosforüleerimine fosforhappe jäägi eemaldamine ensüümilt. Temagi roll on ensüüm kas aktiveerida või inaktiverida. Seega fosforüleerimise vastand reaktsioon. 3) Proensüümid (sümogeenid) ja isoensüümid (isosüümid) mõisted, nende roll katalüüsi regulatsioonis. Proensüümid e sümogeenid valkude inaktiivsed prekursorid, mille proteolüütilise lõikamise tulemusel saadakse aktiivne valk. Aktiveerivad järgmisi valke. Näiteks vere hüübimine. Isosüümid e isoensüümid ensüümi vormid, mis katalüüsivad sama reaktsioone, kuid erinevaid üksteisest nii struktuuri kui katalüütiliste parameetrite poolest. 4) Allosteerilised ensüümid - mõiste, bioloogiline roll. Regulatoorse tsentri mõiste molekulaarne sisu. Allosteerilise regulatsiooni mudelid; aktiveerimine ja inhibeerimine
Arvutus: A = CTyr · 103 · V1 · V2 · 2 / t · 181 · V3 · g A1 = (0,069-0,022)*1000 * 26 * 5 * 2/ 916 * 181 * 1 *0,02 = 3,68 kat/g A2 =3,56 kat/g A3 = 3,44 kat/g Katseandmed tulid sarnased, katse võib lugeda õnnestunuks. Kokkuvõte ja järeldused Teoreetiliselt peaksid katses saadud türosiini kontsentratsioonid graafikul kanduma ühele sirgele. Käesoleva katse empiirilised andmed erinevad veidi . Selle põhjuseks võivade eelkõige olla: · proteolüütilise ensüümi tahke preparaadi vähene lahustumine puhvris · Mitte piisavalt kiire tegutsemine proteaasi lisamisel kaseiinile ning sealt proovi eraldamine · Ebatäpsus proovide võtmise ajastamisel. · Ebapiisav proovide segamine pärast reaktsioonisegu lisamist, mistõttu moodustunud sade klimbistus ning nii selle sadestamine kui filtrimine oli raskendatud. · Ebatäpsused filtrimisel- eelmistes etappides tehtud eksimuste tõttu oli mõnel katsel filtraati liiga
Tallinna Tehnikaülikool 3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Liina Reimann 134537KATB Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaase leidub kõikides organismides, nad seedivad näiteks toiduvalke. Mõned proteolüütilised ensüümid lõhustavad eelistatult spetsiifilisi, vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (piiratud proteolüüs), teised toimivad kõikidele peptiidsidemetele (piiramatu proteolüüs). Piiratud proteolüüsi viivad läbi näiteks trüpsiin, kümotrüpsiin, pepsiin, mis produtseerivad enamasti peptiide. Subtilisiin, savinaas ja alkalaas on bakteriaalsed proteaasid, mis lagundavad praktiliselt kõiki peptiidsidemeid, produtseerides vabu am...
ensüümireaktsiooni. Hüdrolüüsisegust võetud, taandavaid suhkruid sisaldava proovi keetmisel komplekslahusega taandub kompleksis sisalduv Cu (II) Cu(I) ks , mood CU2O, mis eraldub reaktioonisegust punase sademena ja lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B.Reaktsioonil vabanenud triloon B määratakse tiitrimisel 0,02 M vasksulfaadi lahusega, kasutades inikaatorina mureksiidi vesilahust. Invertaasi aktiivsus avaldatakse mikrokatalites 1 ml ensüümilahuse kohta (µkat/ml) Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Proteaasid on arvukas rühm ensüüme , mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi valkudes ja peptiidides. Reaktsiooniproduktideks on erineva molekulmassiga peptiidid ja vabad aminohapped. Valkudes hüdrolüüs kannab proteolüüsi nimetust. Proteolüütilise aktiivsuse ühikuks 1 µkat loetakse sellist ensüümi hulka, mis põhjustab 1 µmooli peptiidsidemete hüdrolüüsi 1 s vältel 30 C juures.Kuna hüdrolüüsunud peptiidsidemeye
Tallinna Tehnikaülikool Keemiainstituut Bioorgaanilise keemia instituut BIOKATALÜÜS 3.2 PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE Juhendaja: Tiina Randla Töö teoreetilised alused Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidide, produtseerides madala molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaasi leidub kõigis organismides, kuna nad osalevad erinevate funktsioonide täitmises. Näiteks toiduvalkude seedimises ja kõrgreguleeritud ensüümireaktsioonide kaskaadides. Sõltuvalt sellest, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele, eristatakse endo- ja eksopeptidaase: · Eksopeptidaasi esindajateks on karboksüpeptidaasid ja aminopeptidaasid- need lühendavad peptiide, vabastades ühekaupa C- ...
Töö nr 3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Koostas: Juhendaja: Mart Reimund Teoreetilised alused Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaasid on laialt levinud organismides, sest nad osalevad mitmete füsioloogiliste rollide täitmisel. Eristatakse proteolüütilisi ensüüme, mis toimivad kõikidele peptiidsidemetele ja on ka spetsiifilisi, mis lõhustavad vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (nn piiratud proteolüüs, nt trüpsiin, kümotrüpsiin ja pepsiin). Eristatakse ka endo- ja eksopeptidaase, vastavalt sellele, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele. Optimaalse pH väärtuse järgi eris...
osa eemaldamist Seedeensüümid: trüpsiin, kümotrüpsiin, elastaas ja karboksüpeptidaas Sünteesitakse pankreases inaktiivsete eellasmolekulidena zümogeenid Kaksteistsõrmikus esinev proteaas enteropeptidaas aktiveerib proteolüütiliselt trüpsinogeeni Aktiivne trüpsiin aktiveerib juba kõik ülejäänud zümogeenid Trüpsiin on võimeline aktiveerima ka iseenda eellast trüpsinogeeni Pankreas on proteolüütilise lagundamise eest kaitstud trüpsiini inhibiitori ppoolt Kontroll ensüümi hulga kaudu V = kcat[E]t[S]/(KM + [S]) Konkreetsel substraadi kontsentratsioonil on kiirus proportsionaalne ensüümi kontsentratsiooniga: V ~ [E]t Ensüüm Süntees Degradatsioon transkriptsioon kontrollitud proteolüüs translatsioon Ensüümide
keskkonnas vanemas juustus. Piima natiivne proteinaas töötab samuti nõrgalt leeliselises keskkonnas, lagundades - Kaseiini. Pinnamikrofloora AH katabolismist maitseühendid: NH3, 3-metüül-1-butanool, Fenüületanool, fenool- pinnaküpsemisega juustudele tüüpilised ühendid Aroomibuketis lenduvad väävliühendid H2S, dimetüülsulfiid (DMS), metaantiool (Metaantiool on eellaseks metüültiometaanile). Toodetakse ka tioestreid Proteolüütilise funktsiooni toimel 90% lämmastikühenditest muudetakse veeslahustuvaks Vabu ah kuni 1% Lipolüütiline aktiivsus · Lipolüüs triglütseriididest saadakse rasvhapped. Juustu küpsemise eelduseks, kuigi piimas starterite lipolüütiline aktiivsus suhteliselt madal. · Rasvhapete vabanemine eriti tähtis kõvades Itaalia juustudes, sinihallitusjuustudes 1. Starterkultuuride ekstratsellulaarsed lipaasid -> rasvhapped -> metüülketoonid.
sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. 6. Skitseerige graafilised sõltuvused a) ensüümi aktiivsus-temperatuur; 25 b) ensüümi aktiivsus-keskkonna pH. 7. Millisel temperatuuril toimus proteaasi aktiivsuse määramine? Kuidas mõjutanuks tulemust temperatuuri tõus termostaadis 25 Co võrra? Ensüümi proteolüütilise aktiivsuse ühikuks 1 kat loetakse sellist ensüümi hulka, mis põhjustab 1 mooli peptiidsidemete hüdrolüüsi või 1 mooli aminohapete vabanemise1 s vältel 30°C juures. 8. Millise reaktsiooniprodukti kontsentratsiooni suurenemise järgi arvutasite proteaasi aktiivsuse? Kirjutage selle aine struktuurivalem aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse järgi aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide
tsükliinid, mis seostuvad CDK-dega G1-faasis ja on vajalikud S-faasi käivitamiseks. Mitootilise tsükliini kontsentratsioon tõuseb järk-järgult ning seostub CDK-ga, moodustades kompleksi, mida nimetatakse ka MPF (M-phase promoting factor). Teatud kriitilise MPF-i kontsentratsiooni juures käivituvad sündmused, mis on vajalikud mitoosi alustamiseks (kromatiin kondenseerub, tuumaümbris laguneb). MPF ise aga laguneb metafaasi- anafaasi jooksul. MPF laguneb seetõttu, et ta käivitab proteolüütilise aktiivsuse, mis teda ennast lagundab. MPF-i lagunemine on vajalik, et rakk saaks mitoosist väljuda. MPF-i toimet saab demonstreerida katse abil, kus M-faasis oleva raku ekstrakti süstida ükskõik millises faasis olevasse rakku. See käivitab antud rakus mitoosile iseloomulikud sündmused (kromatiini kondensatsioon, tuumaümbrise lagunemine). MPF on evolutsiooniliselt konserveerunud - näit. kannuskonna (Xenopus laevis) MPF toimib ka imetajate rakkudele. MPF kirjeldati esimesena
See on iseloomulik eelkõige varajase-algusega Alzheimeri tõvele. Autosomaalselt dominantselt päranduva Alzheimeri tõve vormi korral eristatakse kolme eritüüpi vastavalt sellele, mis geen on põhjuslik faktor ja kus antud geen asub. Alzheimeri tõve põhjustavateks geenideks võivad olla APP (AD1 lookuses) , presenilin 1 (AD3 lookuses) või presenilin 2 (AD4 lookuses). Preseniliinid, mida kodeerivad vastavat presenilin-1 ja presenilin-2, kuuluvad proteolüütilise kompleksi koosseisu. Enamus mutatsioone suurendavad A42 hulka või muudavad A40 ja A42 vahelist kontsentratsioonide suhte. See tähendab, et haigus võib tekkida ka siis, kui A üldhulk väheneb. Samuti on jõutud järeldusele, et hilise algusega pärilik Alzheimeri tõvi on kompleksne häire ning hõlmab mitmeid tundlikke geene. Rohkem kui 400 geeni on testitud seoses hilise algusega sporaadilise Alzheimeri tõvega, kuid enamus tulemuseta
complexus juxtaglomerularis Kitsenemised - Epitelioidrakud - algusosas + ristumiskohal niudeveresoontega + lõpposas (kusepõie muundunud silelihasrakud seinas) paiknevad arteriola afferens’i seinas SEINA EHITUS sisaldavad proteolüütilise ensüümi, reniini terakesi Tunica mucosa - Macula densa – tihketähn - ülemineku ehk siirdeepiteel päsmakese soontepooluse lähedal arteriola afferensi ja efferensi vahel - lamina propria koosneb tubulus distalise epiteelirakkudest - tela submucosa
isosüümide, modulaatorvalkude abil. Kovalentne modifitseerimine. Ensüüme, mida reguleeritakse kovalentse modifitseerimise teel, nim interkonverteeritavateks ensüümideks. Ensüüme, mis katalüüsivad interkonverteeritavate ensüümide kahe vormi vahelist konversiooni, ni konverterensüümideks (ntks proteiinkineaas ja proteiinfosfataas). Joonis loeng9/slaid7! 3. Sümogeenid e proensüümid on valkude inaktiivsed prekursorid, mille proteolüütilise lõikamise tulemusel saadakse aktiivne valk. Isosüümid on ensüümi vormid, mis katalüüsivad samu reaktsioone, kui erinevad üksteisest nii struktuuri kui katalüütiliste parameetrite poolest. 4. Allosteerilisteks nii ensüüme, mida reguleeritakse regulatoorsete molekulide, nn allosteeriliste efektorite, pöörduva mittekovalentse sidumise kaudu. Allosteerilised efektorid sünteesitakse sama metaboolse raja
¾ ensüümi vajadust kofaktori (metalli ioonid või koensüüm) järele, ¾ analüütilist protseduuri, millega detekteerida produktide sisalduse suurenemist või substraadi kontsentratsiooni vähenemist keskkonnas ensüümireaktsiooni vältel. Biokeemia praktikumis tutvutakse kolme ensüümiga, mis omavad olulist füsioloogilist rolli, kuid mis leiavad rakendamist ka tehnoloogilistes protsessides ja/või analüütikas. Invertaasi ja proteaasi (= proteolüütilise ensüümi) puhul on eesmärgiks omandada nende ensüümipreparaatide aktiivsuse määramise meetodid. Glükoosi oksüdaasi aga 72 kasutatakse analüüsi eesmärgil, et sobivas bioloogilises objektis glükoosisisaldust määrata. Aktiivsuse määramise meetodite omandamiseks kasutatakse tehnilisi ensüümipreparaate, millistes ensüümivalgu sisaldus pole määratud. Seetõttu iseloomustatakse preparaadi
· Insuliin ( INS) Toime. INS põhiroll on vere glükoositaseme langetamine. Selleks INS kontrollib glükoosi trasnporti lihaskoe ja rasvkoe rakkudesse, intensiivistab glükoosi oksüdatsiooni e glükolüüsi ja stimuleerib glükogeeni sünteesi. INS stimuleerib ka lipiidide, kolesterooli ja valkude sünteesi maksas. Sekretsioon. Sünteesitakse preproinsuliinina pankrease Langerhansi saarekeste B-rakkudes. Signaalpeptiidi eraldumisega tekib proinsuliin, mille proteolüütilise lõhustamise produktid INS ja C-peptiid sekreteeruvad verre. Sekretsiooni põhiregulaator on vere glükoosisisaldus. INS sekretsiooni stimuleerivad kortisool, östrogeenid, STH ja vereplasma aminohapete taseme tõus. Sekretsiooni inhibeerivad adrenaliin, pankrease somatostatiin ja galaniin. 4.2 Veres glükoosi sisalduse tõstmine · Glükagoon Toime. Põhiroll vere glükoositaseme tõstmine, ta on INS antagonist. Selleks intensiivistab glükagoon maksas
Ensüüme, mida reguleeritakse kovalentse modifitseerimise teel, nimetatakse interkonverteeritavateks ensüümideks. Ensüüme, mis katalüüsivad interkonverteeritavate ensüümide kahe vormi vahelist konversiooni, nimetatakse konverterensüümideks (proteiinkinaas ja proteiinfosfataas antud näite korral). 3. Proensüümid (sümogeenid) ja isoensüümid (isosüümid) mõisted, nende roll katalüüsi regulatsioonis. Proensüümid on valkude inaktiivsed prekursorid, mille proteolüütilise lõikamise tulemusel saadakse aktiivne valk. Kümotrüpsiogeeni aktiveerimine LIISI KINK 36 BIOKEEMIA test I Isosüümid on ensüümi vormid, mis katalüüsivad samu reaktsioone, kuid erinevad üksteisest nii struktuuri kui katalüütiliste parameetrite poolest. 4
Mis on MPF (maturation promoting factor, sün mitose promoting factor), kuidas tekib, millest koosneb, kuidas laguneb. Heterodimeerne proteiiin tsükliin B ja CDK1. kuidas tekib? Mitootilise tsükliini kontsentratsioon tõuseb järk-järgult ning seostub CDK-ga, moodustab MPF kompleksi Millest koosneb? mitootilisest tsükliinist ja CDK-st (tsükliin-sõltuvad kinaasid) Kuidas laguneb? MPF ise aga laguneb metafaasi- anafaasi jooksul. MPF laguneb seetõttu, et ta käivitab proteolüütilise aktiivsuse, mis teda ennast lagundab. MPF-i lagunemine on vajalik, et rakk saaks mitoosist väljuda. 81. Milline on valk p53 osa rakutsükli kontrollis, kuidas see realiseerub? *tumor repressor e märgistab vigase DNA (võib tekitada kasvajaid), tingides apoptoosi või rakutsükli peatamise ning vigase DNA parandamise. Aktiveerib CDK inhibiitorvalgu p21 82. APC (anaphase promoting complex) roll metafaasist anafaasi üleminekul (M pärssimine).
vaja kehast eemaldada - komplement) Opsoniinid - märgistamises osalevad komplemendi valgud Põletik reaktsiooni aktivatsioon - anafülotoksiinid, liiga tugev vastus Immuunkomplekside kõrvaldamine ringest - ? Humoraalse immuunvastuse toetamine - B rakkude mõjutamine germinaaltsentrites, mõningad signaalid lähevad B rakkudele, toetavad nende küpsemist lümfotsüütides Zümogeenid – valgud, mis muutuvad proteaasideks spetsiifilise proteolüütilise toime järel. N'äiteks komplemendi kolmas valk C3, millel ei ole ensümaatilist aktiivsust enne kui proteaas teda pole püganud veits, siis C3 pügab järgmist jne – kaskaad. Järjestikuline zümogeenne kaskaad (võrreldav hüübimis ja kiniinse kaskaadiga). Komplemendi süsteemi valgud (nomenklatuur) C1(qrs), C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9 faktorid B, D, H ja I, properdiin (P) mannosi siduv lektiin (MBL), MBL seotud seriin proteaas (MASP-1 MASP-2)
47 – Tarbitud ained: rasv, šokolaad, piparmünt, alkohol, nikotiin – Hormonaalsed: nt progesteroon Maonääre 100 näärmekrüpti mm2 limaskestapinna kohta, kokku ca 3.5 miljonit Erinevad rakutüübid: – Mukotsüüdid produtseerivad lima (erinev epiteelirakkude limast) – Pearakud sekreteerivad pepsinogeeni (proteolüütilise ensüümi pepsiini inaktiivne vorm) – Parietaalrakud sekreteerivad soolhapet (HCl) ja seesmist faktorit – G-rakud sekreteerivad gastriini (stimuleerib parietaalrakke, mao limaskesta kasvu, pankreast CCK-B retseptorite kaudu) Maonõre Koostis: – Soolad – Vesi – Soolhape – Pepsinogeen – Seesmine factor pH väga madal (>0.8):
sisaldav kompleks, mis põhjustab raku sisenemise M faasi. Mitootilise tsükliini kontsentratsioon tõuseb järk-järgult ning seostub CDK-ga, moodustades kompleksi, mida nimetatakse ka MPF (M-phase promoting factor). Teatud kriitilise MPF-i kontsentratsiooni juures käivituvad sündmused, mis on vajalikud mitoosi alustamiseks (kromatiin kondenseerub, tuumaümbris laguneb). MPF ise aga laguneb metafaasi- anafaasi jooksul. MPF laguneb seetõttu, et ta käivitab proteolüütilise aktiivsuse, mis teda ennast lagundab. MPF-i lagunemine on vajalik, et rakk saaks mitoosist väljuda. 6.)Milline on valk p53 osa rakutsükli kontrollis, kuidas see realiseerub? Kui DNA on kahjustatud, kuhjub p53 (tuumor supressor protein) transkriptsioonifaktor, aktiveerib BH3 kodeerivad geenid Puma ja rakk siseneb apoptoosi. Teine sarnane kontrollsüsteem toimib imetajate rakkudes, mis peatab kahjustatud DNA-ga rakkudel rakutsükli G1 faasis. See
Viiruste isoleerimine ja kultiveerimine Viiruste isoleerimine ja identifitseerimine toimub enamasti rakukultuurides. Kasutatakse ühekihilisi (monolayer) rakukultuure, harvem kasutatakse kanaembrüosid või katseloomi. Teatud viirused ei kasva rakukultuurides (näiteks rotaviirused, hepatiidi, papilloomi, HIV, Epstein-Barri ja mõned arboviirused). Eristatakse : • Primaarsed rakukultuurid. Koetükike peenestatakse kääridega steriilsetes tingimustes, töödeldakse proteolüütilise ensüümi (tavaliselt trüpsiini) lahusega ja saadud rakkude suspensioon külvatakse klaasile erilistes lamedates kolbides – madratsites. Külvatud rakud moodustavad madratsi pinnal kasvu, mis diploidsete kromosoomidega rakkude puhul on kontakt-inhibeerimisfenomeni tõttu ühekihiline. Tuntumateks primaarkultuurideks on reesusahvide neerukultuur (pRMK) ja inimese loote neerukultuur (pHEK). • Diploidsed rakukultuurid ehk rakutüved
○ Sünteesitakse rasvhapeteks ja salvestatakse rasvkoes Valkude ainevahetus Seedimine: Proteolüütilised ensüümid jagunevad: jagunevad: ○ Proteaasideks (valk→peptiid) ○ Peptidaasideks (peptiid→aminohape) ● Endopeptidaasid (lõikavad peptiidi keskelt) ● Eksopeptidaasid (“hammustavad” peptiidi otsast üksikuid aminohappeid) ● Ensüüme säilitatakse enterotsüütides inaktiivsel kujul (sümogeeni graanulites), aktiveeritakse alles soolevalendikus mõne teise proteolüütilise ensüümi poolt ● Proteolüüs algab maos proteaas pepsiini abil. Happeline keskkond aitab kaasa valkude denatureerimisele (ahelad keerduvad lahti ja pepsiin pääseb ligi enamatele peptiidsidemetele) ● Peensooles jätkavad valkude seedimist pankreasenõre proteaasid ja enterotsüütide hariäärise proteaasid ja peptidaasid Imendumine: ● Peptiididena ○ Pinotsütoosi teel (suuremad) ○ H + ‐sõltuva sümporteri abil (väiksemad) ○ Osa enterotsüüti
Seondunud sigma faktor on inaktiivne. Teatud signaali korral sigma faktor vabaneb antisigmafaktori küljest ning initsieerib spetsiifilise stressivastuse. Tuntuim E. coli E-RseA sigma-antisigmafaktori süsteem, mis tunnetab madala ja kõrge temperatuuri sokki, etanooli, lipopolüsahhariidide defekte ning biofilmi moodustumise represseeritust. Teisisõnu tunnetab E-RseA süsteem ekstratsütoplasmaatilist stressi, mis päädib antisigmafaktori lagundamisega nii periplasmast kui ka tsütoplasmast. Proteolüütilise vabastamise järel sigmaE aktiveerib stressivastusgeenid, millest paljud on periplasmaatilised saperonid, lipiidA biosünteesigeenid jne. Nt Pseudomonas aeruginosas aktiveerib E alginaadi sünteesi. E. coli konserveerunud DNA järjestused, mida tunnevad ära erinevad sigma faktorid. 71 SigmaD (-35 element, vaheala, -10 element) TTGACA N17(1) TATAAT N5-7 G/A
annaabi.ee 
