Lahutusmeetodid (0)

Kordamisküsimused “Lahutusmeetodite” kursusest sügis 2014.
Kromatograafilise lahutuvuse põhiidee ja taldrikute mudel
Ainete lahutamine nende erinevate omaduste põhjal ( polaarsus , afiinsus)
Teoreetilised taldrikud – Igal tasemel saabub uuritava aine tasakaal mobiilse ja stats .faasi vahel. Mobiilne faas kandub edasi järgmisele teoreetilisele taldrikule.
Selektiivsus - parameeter , mis on seda suurem, mida erinevamad on kahe aine retentsiooniajad ja kitsamad nende piigid .
Efektiivsus - kolonni iseloomustav suurus, mis sõltub piigi retentsiooniajast (aeg, mis kulub ainel kolonni läbimiseks (sissesüstimise hetkest detektorini jõudmiseks)) ja laiusest;
Kuidas avaldub seos elueeruva aine retensiooniruumala tema jaotuskoefitsiendi
(mobiilses ja statsionaarses faasis) kaudu
Retensiooniruumala – mobiilse faasi ruumala, mis on vajalik ½ aine koguse elueerimiseks (väljaviimiseks) kolonnist;
Cs – konts statsionaarses faasis; Cm – mobiilses faasis
Vr – retensiooniruumala; Vm – mobiilse faasi ruumala; Vs – stats.faasi ruumala
K – koefitsient.
Aine tsooni laiust määravad faktorid kapillaar ja pakitud kolonnides
Pakitud kolonnides - molekulide erinevad teepikkused , kuna kolonni täidise mõõtmed pole ühtlased, difusioon e tsooni laienemine.
Massivahetus mobiilse ja stats.faasi vahel; difusioon mobiilsest statsionaarsesse st täidise pooridesse; difusioon statsionaarsest tagasi mobiilsesse.
Kapillaarkolonnis - mobiilse faasi kiiruse paraboolne jaotus eluendi laminaarsel voolamisel. Kandilisem.
GC - Erinvad teepikkused täidiskolonnidest, sõltudes pakkimisest ja osakeste läbimõõtudest. Difusioon mõjutab nii täidis kui kapillaarkolonne, sõltudes difusiooniko-efist ja analüüsiajast. Massivahetus liikuva ja liikumatu faasi vahel mõjutab mõlema kolonni puhul, sõltudes analüüsiajast.
Selgitage mõisteid selektiivsus ja efektiivsus ja lahutuvus; kuidas neid arvutatakse’
Selektiivsus – parameeter, mis on seda suurem, mida erinevamad on kahe aine retensiooniajad ning mida kitsamad nende piigid;
Selektiivsus määratakse lahutuskoefitsiendi R kaudu, kus ühesuguse retensiooniajaga ühendite lahutuskoefitsient võib olla eri kolonnidel erinev.
Efektiivsus - kolonni iseloomustav suurus, mis sõltub piigi retensiooniajast ja laiusest; Sõltub vedelfaasist. Väljendab teoreetiliste taldrikute arv;
Teoreetiliste taldrikute arv N - arvutatakse piigi retensioonija ja poollaiuse w(1/2) (piigi laius poolel kõrgusel) kaudu. N määratakse kolonni optimaalsetel tingimustel standardaine suhtes
N=5.54x(tRi/w1/2)2
Ainete lahutuvust, efektiivsust , selektiivsust ja mahtuvusfaktorit siduv valem.
Van Deemteri võrrandi eri liikmete tähendus (A, B, C avaldisi pole peast vaja teada).
Van Deemteri võrrand seob efektiivsuse ja eluendi kiiruse:
H - teoreetilise taldriku kõrgus; DM - analüüdi difusioonikonstant eluendis
dP - täidise osakese läbimõõt; u - eluendi lineaarkiirus
A, B, C – konstandid
HPLC aparatuur
Vajab mikromeetrise diameetriga osakesi ning suuri rõhke (Mpa, 8000 psi). Voo kiirused 0.2-10 ml/min.
Kolonnid : standard-, kapillaar -, monoliit- ja eelkolonnid (lühikesed, 1-3 cm, sama stats.faasiga eesmärgiga kaitsta peakolonni).
Milliseid mobiilseid ja statsionaarseid faase kasutatakse HPLCs?
Mobiilne faas - vedelik; parameetrid : viskoossus (mida väiksem viskoossus, seda madalamat rõhku saab kasutada), sobivus detektoriga (madal UV neelduvus UV detektori puhul, lendus MS-is), mürgisus.
N: heksaan , kloroform, diklorometaan, atseetonitriil, metanool , vesi.
Statsionaarne faas - osakeste suurus 3-20 μm. Mida väiksem osake, seda suurem on efektiivsus, rõhk kolonnis ja lahutuvus, kusjuures osakeste suurused ei tohiks erineda üle 25%, olles sfäärilise või ebakorrapärase kujuga (efektiivsus sellest ei muutu, kuid rõhk sõltub). Osakesed on kas läbinisti või kaetud pooridega, läbimõõduga 60-500 A0. Kolonni mahtuvus on suurem läbinisti poorsete osakeste puhul. Sellegipoolest on efektiivsus kõrgem pindmiselt poorsete osakeste puhul.
N: silikageel, monoliitkolonn ( poorse silikaskeletiga)
Millised HPLC variandid sobivad vastavalt mittepolaarsete, polaarsete , ioonsete ja kõrgmolekulaarsete ühendite analüüsiks
Polaarsetele – aatomiti erinev elektronegatiivsus molekulis ning struktuuri asümmeetrilisus. Polaarsed molekulid on nt soolad, happed , alkoholid, ketoonid , eetrid, mis väljuvad kiiresti vett ja alkoholi sisaldavate eluentide puhul. Polaarne stats.faas on nt silikageel. Normaalfaasikolonn, kasutatakse polaarset silikageeli ning apolaarseid orgaanilisi eluente. Sobib HILIC – hydrophilic interaction liquid chromatography, kus stats.faasi pinnal on õhuke vee kiht. Stats.faas on siin puhul polaarne, tsüano, või silikageel.
Mittepolaarsetele – aromaatsed, halogeene või fluoori sisaldavad molekulid, alifaatsed molekulid. Mittepolaarsed eluendid on atseetonitriil, THF, heksaan ning stats. faasid C8, ja n-oktadetsüülsilüül. Pööratud faasi kolonn ?
Ioonsetele – Ioonvahetus . Laengutevahelised vastasmõjud analüüdi ja ioonide vahel, mis on seotud statsionaarsele faasile . Anioonkromatograafias on stats.faasil "+" laenguga amiinid, katioonkromatograasias "-" laenguga sulfoonhappe ja karboksüülhappe rühmad. Lahutamine pH muutmisega.
Kõrgmolekulaarsetele – size -exclusion chromatography. Poori suurusest väiksemad molekulid elueeruvad hiljem, kuna liiguvad esmalt pooride sisse ja siis välja - pikem teekond- ning suuremad varem, kuna ei saa suuruse tõttu pooridesse siseneda.
Detektorid HPLCs (nimetage vähemalt kolm, koos tööpõhimõtte ideega)
Elektriline signaal proportsionaalselt proovi kontsentratsiooniga . Detekteerimispiiriks konts, mis annab mürast 3x suurema signaali. Liiga kõrgete kontside puhul muutub sõltuvus kontsi ja detektori signaali vahel mittelineaarseks ning detektori ulatus on min ja maks detekteeritava kontsentratsiooni vahe.
UV-VIS fotomeetrid
mõõdetakse neelduvust UV-VIS piirkonnas, mõõdetakse liikumist põhiolekust ergastatud olekusse; mõõdetakse kui suur osa proovile antud kiirgusest neeldub, kasutades Lambert - Beeri seadust. Lahuse neelduvus on proportsionaalne neelava proovi kontsentratsiooni ja teepikkusega. Koostatakse kalibratsioonikõver.
Fluorestsents
Fluorestsents spektroskoopia puhul mõõdetakse erinevalt UV-VIS spektroskoopiast energia kiirgumist, mispuhul liigub molekul ergastatud olekust põhiolekusse. UV-kiirgusega ergastatakse molekuli elektronid, mille tagajärjel kiiratakse osa energiast tagasi.
Massispektromeetriline
Ainete lahutamine massi/laengu suhte järgi ioonidena gaasifaasis. Uuritav proov (gaasiline, vedel või tahke) ioniseeritakse nt elektronidega pommitades, mistõttu lagunevad proovi molekulid laenguga fragmentideks. Fragmendid aga lahutatakse vastavalt massi/laengu suhtele, neid kiirendades ja viies elektri- või magnetvälja. Fragmente detekteerib nt elektronkordisti vastavalt fragmendirohkusele.
Keemiliselt seotud statsionaarsete faaside süntees.
C18 või C8 on kovalentselt seotud silikageelile; kovalentne side räniga.
Ioonkromatograafia olemus
Laengutevaheline vastasmõju analüüdi ja stats.faasile immobiliseeritud ioonide vahel.
Anioonkromatograafia - kvaternaarsed aminorühmad, DEAE (dietüülaminoetaan); positiivse laenguga ioonid seovad anioone .
Katioonkromatograafia - sulfoonhappe rühmad, karboksüülrühmad; negatiivse laenguga ioonid seovad katioone.
pH muutmisega: nõrkade hapete lahutamine tugeval anioonvahetajal
tugevate hapete lahutamine nõrgal anioonvahetajal
Eksklusioonkromatograafia
Poori mõõtmetest väiksemad molekulid liiguvad pooride sisse, mistõttu läheb neil kauem aega, et kolonnist välja elueeruda. Poori mõõtmetest suuremad osakesed aga liiguvad kiiresti kolonnist välja, kuna ei saa pooridesse siseneda. Konstrueeritakse seos molekulmassi ja retensiooniruumala vahel, elueerides mõned tuntud molekulmassiga ühendid. Tundmatu ühendi molekulaarmass määratakse saadud kõvera abil.
Normaal- ja pööratud faasi kromatograafia olemus.
Normaalfaasi kromatograafia puhul elueeruvad apolaarsed molekulid esmalt, samal ajal interakteeruvad polaarsed molekulid silikageeli hüdroksüülrühmadega; eluendina kasutatakse apolaarseid solvente (heksaan, petrooleeter), suurendades polaarsust (lisades polaarset solventi või suurendades selle osakaalu ) elueeruvad ka polaarsed molekulid.
Pööratud faasi puhul on silikageelile kovalentselt seotud C8 või C18 rühmad, mistüttu interakteeruvad nende apolaarsed molekulid ning polaarsed elueeruvad esimesena, kasutades polaarset eluenti (vesi, metanool). Lisades või suurendades apolaarse solvendi osakaalu (heksaan, atseetonitriil) elueeruvad ka apolaarsed molekulid.
Valkude kromatograafia pööratud faasi kolonnis
Üle 5A pikkused valgud ja peptiidid on liiga suured, et neid statsionaarsel faasil lahutada. Suurendades orgaanilise solvendi osakaalu gradiendiga; teatud orgaanika kontsentratsiooni puhul valg desorbeerub stats.faasilt ning liigub ilma edasise interakteerumiseta kolonnist välja. Enne desorbeerumist seisab kogu proov eelkolonnis või kolonni pealmises osas.
Üldjuhul kasutatakse C4, kus suuremad valgud annavad rohkem hüdrofoobseid interaktsioone, mistõttu ongi eelistatud lühema ahelaga stats.faasid.
C18 kasutatakse lühemate/väiksemate peptiidide ja molekulide jaoks. Väiksemad peptiidid vajavad hüdrofoobsemaid, pikemaid ahelaid.
GC aparatuur
1 - kandegaasi balloon , 2 - proovi sisestusseade, 3 - kolonn termostaadis, 4 - detektor , 5 - andmete registreerija (arvuti, intergraator, isekirjutaga)
Liikuv faas - gaas; liikumatu faas - tahke aine, vedelik
Lahutatavad ained jaotuvad kandegaasi ja stats.faasi vahel, kusjuures jaotumine on määratud ainete jaotuskonstandi K-ga.
Gaasilised ained - mehhaaniline dosaator
Tahked ained - termiline impulss aine lõhkumiseks, 700°C, pürolüüsikromatograafia
Vedelad ained - org. lahustis , süstitakse süstla või dosaatoriga. Täidiskolonni puhul termostateeritud sisestusseadmesse, kus proov aurustatakse ja kolonni kantakse; kapillaarkolonni puhul tuleb arvestada ka proovi ruumalaga.
Milliseid mobiilseid ja statsionaarseid faase kasutatakse gaasikromatograafias?
Gaasid peavad olema keemiliselt intertsed (no reaction w/ either analyte or stats.phase), kõrge puhtusastmega (no water, no O2), detektoriga ühilduvad (MS-i puhul peab gaasiks olema He), ökonoomne, ohutu, efektiivne (ajaliselt).
H2, N2, He
Ei vaja pumpasid, kuna ballooni rõhust piisab .
Võib-olla voo regulaator
Voolukiiruse mõõtmiseks kasutatakse kolonni alguses rotameetrit või seebimulliga voolumeetrit kolonni lõpus.
Täidiskolonnid - 2-4 mm siseläbimõõt, reeglina 1-2 m pikkused. Täidiseks poorne materjal. Gaas-adsorptsioonikromatograafia (täidis on stats.faas), gaas-vedelikkromatograafia (täidis on kandja stats.faasile).
Kapillaarkolonnid - 0,1-0,5 mm siseläbimõõt, piikkuseks 5-100 m. Materjaliks polüimiidiga kaetud kvartskapillaarid. Vedelikukile on stats.faasiks, mis kantakse 0,1 - 5 μm paksuselt kapillaari siseseinale.
GC stats.faas peab olema termiliselt stabiilne ja hea eristusvõimega. Siloksaanid on head. CH3-rühmaga modimine vähendab polaarsust, tsüaanopropüülrühmad aga just suurendavad polaarsust. Polüetüleenglükooli kasutatakse ka laialt polaarse stats.faasiga.
Retensiooniindeksi kontseptsioon ja tema kasutamine.
Homoloogilise rea liikmete parandatud retensiooniajad, t' sõltuvad logaritmiliselt või lineaarselt C aatomite arvust.
n - enne uuritavat ainet elueeruva normaalalkaani C arv
n+1 - pärast uuritavat ainet elueeruva normaalalkaani C arv
n-aalalkaani ret.indeks on tema 100x C aatomite arv.
RI=100(((logt-log t n)/(log t+n - log n))+n)
RI=100(((t - t n)/(t n+1 - t n))+n)
Ei sõltu mob.faasi kiirusest, kolonni pikkusest ega stats.faasi kogusest, vaid stats.faasi tüübist ja kolonni temperatuurist.
Detektorid GCs (nimetage vähemalt kolm, koos tööpõhimõtte ideega)
Soojusjuhtusdetektor (TCD) - kandegaaside soojusjuhtivus exp ajal, analüüdi juuresolekul see langeb, kuna gaaside soojusjuhtivus on 6-10x parem org. ainete omadest.
Soojusjuhtivusdetektorid on mittespetsiifilised, saab kasutada ka anorgaaniliste ainete kontside mõõtmiseks.
EI LAGUNDA AINEID
Kõrge detekteerimispiir; 10-8 g/ml (FID-il 10-13 g/ml) ja kitsas lineaarne mõõtmispiirkond.
Leekionisatsioonidetektor (FID) - sagedamini kasutatav, H- leegi elektrijuhtivus muutub elektriväljas kui läbi leegi kantakse orgaanilisi aineid. Need lagundatakse ja ioniseeritakse leegis: CH* + O -> CHO+ e
Ioonide voog regatakse pingelangusena vastuvõtval elektroodil
Väga madal detekteerimispiir (pg) ning lai lineaarne mõõtmispiirkond, 106
Puudused: ained lagundatakse detekoris, sobimatu anorgaaniliste st mittepõlevate ainete analüüsiks.
Massispektromeeter (MS) - GC-st väljuv voog skaneeritakse lühikeste intervallide tagant, analüüsi lõppedes on olemas igale ainele vastavad massispektris, mida võrreldakse kataloogis olevatega.
Puudus: kõrge hind MS-le, kataloogide ebatäielikkus.
Kahemõõtmeline (2D) kromatograafia
Täielik GC (2D comprehensive GC), esimesest kolonnist väljuv effluent suunatakse perioodiliselt teise kolonni, mis on ühendatud läbi modulaatori (mehhaanilised klapid , sorptsioon/ desorptsioon via temperatuur).
Saadakse pikk ühemõõtmeline kromatogramm, organiseeritakse 2D pildiks.
Kasutatakse keeruliste seguse analüüsiks.
Esimese kolonni aeglahutus võrdub teise kolonni lahutusajaga.
Rõhu ühikud Briti ja meetrilistes süsteemides
1 atm 760 mm Hg
1 at - 1 kg/cm^2
Pa=N/m^2
1 bar=0,987 atm=1,02 at=10^5 Pa=14,5 psi
1 pound=0,453 kg
1000 psi = 70 bar, 100 bar= 1450 psi
atm=psi/14,5
Elektroforeesi nähtus ja kapillaarelektroforees
Laetud osakeste liikumine elektrivälja mõjul. Lahutumine põhineb erinevast massist ja laengust tingitud erinva kiirusega liikumisel, samuti ka rakendatavast pingest .
Gaasides - ioonmobiilsus
Ioone sisaldavale lahusele pinget rakendades hakkavad ioonid liikuma, katioonid (+) katoodile (-), anioonid (-) anoodile (+).
Kapillaarelektroforeesil toimub ainete elektroforeetiline lahutamine kapillaarkolonnis.
Elektroosmoosse voo tekkimine elektroforeesis
Electro -osmotic flow (EOF) - pingestatud kapillaartorus hakkavad lisaks ioonidele liikuma ka puhver . Seda seetõttu, et räni pind kvartstorus on kaetud -OH rühmadega, mis sobiva pH korral deprotoneeruvad ja kapillaari sisepind omandab "-" laengu. Prootonid liiguvad katoodile, olles solvateeritud (ümbritsetud vee kihiga ) ja tümbavad kaasa kogu puhvri, mis samuti katoodi suunas liigub. See ongi elektroendoosmoos.
Iooni liikuvuse valemi tuletuskäik
Liikuvus on laenguga osakese omadus, mis iseloomustab seda, kui kiiresti ioon puhvri ja elektrivälja kindla tugevuse juures liigub.
Oleneb tõmbe- ja takistusjõust.
Takistusjõud FT=6πηrν, (katoodi suunas)
ν - iooni liikumiskiirus ; η - puhvri viskoossus, r - iooni raadius;
Tõmbejõud FL=qE; (anoodi suunas)
q - iooni laeng, E - elektrivälja tugevus E=U/l; U - pinge, l - kaugus elektroodide vahel.
Tasakaaluolekus on mõlemad jõud võrdsed ja tingimusest FT=FL saab leida, et ioon hakkab liikuma kiirusega
v=(q/6πηr)E
Iooni liikuvus on seega μ=6πηr
Affiinsuselekroforees
Põhineb valdavalt makromolekulide biotseptsiifilistel interaktsioonidel ja komplekside moodustumisel, muutes molekuli elektroforeesseid omadusi.
CE variandid: CZE, geelelektroforees ja isoelektriline fokuseerimine.
Pinge 30 kV ja voolu 200 yA.
Otsad sisend- ja väljundpuhvrite anumates
Kapillaarisisene detekteerimine UV-detektoritega (ka MS, LIF, juhtivusdetektor).
Lihtsaim KE vorm. Kapillaarile rakendatakse ühtlast pinget/voolu, ning selle pinge tulemusena lahutub sisestatud proov tsoonideks, lahutudes massi-laengu suhte alusel.
KGE, kapillaar geelelektroforees - molekulaarsõela loomine, kasutades polümeerilahuseid. Võimaldab muidu massi-laengu suhte alusel lahutuse asendada lihtsalt massi alusel lahutuvusega. Kasutusel valkude ja DNA puhul.
Kapillaar isoelektriline fokuseerimine ( CIEF ) - kasutab pH gradienti katoodi ja anoodi vahel, amfoteersed molekulid a la valgud migreeruvad kohta, kus nende laeng on null, selles punktis liikumine lõpeb ja analüüt fokuseerub kintsasse tsooni oma isoelektrilises punktis. Kasutatakse valkude kirjeldamises.
Proteiinide kahemõõtmeline elektroforees ja SDS-PAGE olemus.
SDS; elektroforeesi läbiviimine sõltub pH-st, valgu aminohappelisest koostisest, st laengust. Valgud lõhutakse merkaptoetanooliga, lõhutakse SDS-ga (dodetsüülsulfaat) nii, et laeng muutub võrdeliseks molekulkaaluga (1 SDS 2 AH kohta), misläbi valk muutub vardakujuliseks, liikudes aeglasemalt geelil oma pikkuse tõttu.
Kahemõõtmelisus
1. IEF - lahutamine laengu järgi
2. SDS-PAGE - proovi lahutamine suuruse järgi
SDS-PAGE eesmärk on lahutada valke suuruse alusel.
SDS - naatrium dodetsüülsulfaat, denatureerib valku peptiidahelaks, primaarstruktuuriks.
PAGE - polüakrüülamiid geelelektroforees; kui denatureeritud valgud elektrivälja panna, hakkavad nad liikuma "+" laengu suunas ühe kiirusega. Lahutamiseks tuleb lisada keskkonda geel, polüakrüülamiid , misläbi toimub lahutumine suuruse alusel, kus väiksemad liiguvad läbi esmalt, seejärel suuremad valgud.
Voogsisestusanalüüsi põhiidee ja aparatuurne realisatsioon
Diskreetse e Batch analüüsi puhul on erinevad proovid erinevates anumates läbi kõigi analüüsitsüklite; Suurema läbilaskevõimega, proovidel ei teki üksteisega saastumist, kuna on eri anumates.
Pideva analüüsi puhul muutub proov segmendiks n-ö kandva keskkonna voolus. Kasutatakse kui proov vajab eeltöötlust (filtreerimine, destilleerimine , dialüüs). Lihtsam ja odavam aparatuur.
VSA e Flow Injection Analysis , põhineb vedela proovi sisestamisel sobiva vedeliku pidevasse voolu. Proov moodustab tsooni, mis viiakse detektorisse, registreerides neelduvust, elektroodi potentsiaali või mõnda muud füüsikalist parameetrit, mis proovi läbi detektori liikudes pidevalt muutub. St analüüs on võimalik mitte-tasakaalu-olekus.’
Sisestatakse kindel ruumala proovi, täpne ajastus, kontrollitud dispersioon. 100-300 proovi tunnis, üksik analüüs kestab mõni minut. Sarnane HPLC-le, ilma kolonnita, kuid VSA on mõeldud ühe analüüdiga opereerimiseks, HPLC aga segude lahutamiseks.
Reaktoriks poolile mässitud plastiktoru, mis vähendab tsooni laienemist , võimaldades saada kitsamaid piike. Detektoris mõõdetakse ka pidevalt kandelahuse signaali. Detektorid: UV-SFM, ISE, AAS.
ISE - ion selective electrode, põhiiooni määramist võib segada interferent. Põhineb iseloomulikel reaktsioonidel.
AAS – atomic absorption spectroscopy, optilise kiirguse neelamisel vabade aatomite poolt gaasilises olekus, kasutades Lambert-Beeri seadust. Elemendispetsiifiline ergastatus , mis energia tagasi kiirgumisel registreeritakse.
Dispersioon - tsooni laienemine, mis on tingitud molekulaarsest difusioonist ja konvektsioonist (toru keskel liigub voog kiiremini kui servades).
Väli-voog fraktsioneerimise aparatuur ja lahutusprotsessi läbiviimine
Field-flow fractionation, FFF - sarnane HPLC-le, kasutatakse suurte objektide lahutamiseks nagu kolloidid, savid , setted, bakterid , viirused.
Kolonn on lame kanal , 30 cm x 1 cm x 50-500 mm. Osakesed viiakse tsoonina voos kolonni, mis kohe peatatakse. Mingit jõudu rakendatakse kanalile, mis surub proovi vastu kanali põhja õhukeseks kihiks. Difusioon töötab jõule vastu ning suurem dispersiooniga ained liiguvad tagasi kanali keskele .
Lahutus põhineb seega difundeeruvusel, kus rohkem difundeeruvad osakesed liiguvad kolonni keskele, liikuded edasi kiiremini, ning vähem difundeeruvad osakesed jäävad vastu seina, kus voolu kiirus on väiksem. Seega saab samade mõõtmetega aineid lahutada difundeeruvuse (tiheduse) alusel, kusjuures suuremate mõõtmetega molekulid tõenäoliselt difundeeruvad halvemini ja liiguvad aeglasemalt.
Jõud: Raskusjõud - gravitatsioon, tsentrifugaaljõud, sedimentatsioon
Väli-voog fraktsioneerimises relaksatsiooni tekitamiseks kasutatavad füüsikalised protsessid
Temperatuurigradient, ristsuunaline voog, elektri- või magnetväli .
Orgaanilise elementanalüüsi eesmärgid ja klassikalised meetodid
Orgaaniliste ainete elementsisalduse määramine, peamiselt CHNOPS jaoks. Võimalik kasutada: massispektromeetria, klassikaline elementanalüüs ( Kjeldahl , Dumas ), elementanalüüs kitsamalt.
Dumas N2-le:
Proov segatakse Cu(II)O pulbriga, kuumutatakse. Eralduvad N-gaasid, mis puhutakse Cu padrunisse, kus N- oksiidid elemendiliseks lämmastikuks taandatakse. Seejärel juhitakse gaasid kontsentreeritud KOH büretti, kus kõik gaasid peale N2 adsorbeeruvad. Ruumala määratakse otse.
Kjeldahl N2-le (1883):
Proovile lisatakse kuuma konts. väävelhapet, kõik lämmastiku vormid proovis viiakse ammooniumiooni kujule . Lahus muudetakse aluseliseks ning vabanev ammoniaak destilleeritakse ja kogutakse happelisse lahusesse. Ammoonium määratakse tiitrimise teel. Puuduseks see, et kõik N vormid ei muutu ammooniumiks ning vahest tuleb lisada ka teisi redutseerivaid agente.
Kitsam elementanalüüs:
Etteantud aine totaalne lagundamine hapnikjoas kõrgetel temperatuuidel (1000-1800 °C), reaktsooniproduktide lahutamist ja detekteerimist. Reaktsiooni tulemusel sadakse CO2, H2O, N2, NO2.
Hapnik määratakse eraldi, He keskkonnas.
CH analüsaator (1923)
Kuumutamine hapniku joas oksüdeerijate juuresolekul, aine oli Pt ampullis (katalüsaator). CO2 ja H2O seoti selektiivselt asbestile kantud NaOH või Mg(ClO4)2 torudes, kogus määrati torude kaalu kasvu järgi. Lämmastikuühendeid ei registreeritud.
Simon’i CHN analüsaatori tööpõhimõte
Pt tiiglis segatuna hõbedasoolaga (V, W), kusjuures tekkib NOx taandatakse Dumas meetodil N2-ks koos hapnikuga CuO-ks. H2O ja CO2 adsorbeeritakse nagu CH analüsaatoris, kaalumise asemel mõõdeti soojusjuhtivust. VÕimalik määrata ka N2.
CHNS+O analüsaatori ehituspõhimõte
C, H, N, S määramine, O eraldi.
Tinakapslis põletuskambrisse proov, 1800 °C temperatuur tänu tugevatele eksotermilistele effektidele. NOx taandatakse N2-ks Cu kolonnis. Gaasid lahutatakse GC-l järgnevalt: N2, CO2, H2O, SO2.
Kvantitatiivselt määratakse soojusjuhtivusdetektoris, 1 mg proovi 10 min jooksul.
O määramine: püroluus 1120 °C juures, suunatuna läbi Ni/C kolonni, kus gaasid redutseeritakse. Gaasisegu (CO, N2, H2, CH4) lahutatakse molekulaarsõeltel, detekteeritakse TCD-ga. 5 min.
Antikehade ja antigeenide definitsioon ja nende analüütilise kasutamise põhiidee
Antikehad - valgud, mida toodetakse loomades reaktsioonina võõrkehade tungimisele kudedesse. Toodetakse luuüdist pärit B-lümfotsüüdid. Tunnevad ära teatud osa antigeenist ning seonduvad selle alusel. Väga spetsiifilised . Leides antigeeni, jaguneb B- rakk kiirelt ning eritab antikehi, kadudes valdavalt koos antigeeniga , mille hävitab. Osa jääb alles nn mälurakkudeks.
Antigeenid - võõrkehad, mis tungivad looma kudedesse.
Immunotest
Märgistatud antikehade kasutamine vastavate antigeenide olemasolu testimiseks (fluorestents-, ensüüm -, radioaktiivse markeriga märgistatud).
Western blotting
Antigeenide segu elektroforeetiline lahutamine enne testimist, tekkinud ribad transormeeritakse elektroforeetiliselt nitrotselluloosi membraanile kahe elektroodi vahele ja rakendatakse kindlat antikehade lahust vastavate antigeenide olemasolu määramiseks .
Antikeha struktuur ja tema reaktsioon antigeeniga
Antikeha e immunoglobuliin (IgG). Vere glükoproteiin, koosnedes kahest lühikesest 23 kD ja kahest pikast 50-75 kD peptiidahelast, mis on seotud omavahel disulfiidsidemetega. Eksisteerivad di- või pentameeridena (IgA või IgM).
Antikeha seob antigeeni elektrilise või hüdrofoobse interaktsiooniga, mis on nõrk ning oleneb antikeha ja -geenige kujudest, olles tasakaaluline. Segades sobivas suhtes antigeeni ja antikeha, tekib võreline struktuur, mis sadeneb ja on detekteeritav.
Polü- ja monoklonaalsete antikehade valmistamine
Polüklonaalne antikeha - pole spetsiifiline
Monoklonaalne antikeha - üheainsa lümfotsüüdi toodetud
Valmistamine:
Loomale süstitakse puhast antigeeni, antigeeni tootev loom peab erinema võimalikult palju antikeha tootvast loomast. Loom hakkab tootma polüklonaalseid antikehi ning monoklonaalne antikeha saadakse, kui katselooma põrnast võetakse üks lümfotsüüt ja seda paljundatakse.
Koduse rasedusetesti tööpõhimõte
Rasedate uriinis sisaldub hCG hormoon , ning analüüs baseerub sandwich tüüpi analüüsil, (seotud antikehale seondub antigeen , mis omakorda seob ensüümiga seotud antikeha, tuleb substraat ning tekib värvusreaktsioon.
Uriin hCG hormooniga liitub sidumata tracer Ab1 (värvainega märgitud), kompleks liigub edasi seotud Ab2-te, kus tekib sandwich kompleks, riba värvub. Reageerimata Ab1 liigub kolmandale (kontrollribale) ja reageerib Ab3-ga, käivitades värvusreaktsiooni. Kui toimub vaid viimane, ei ole rase .
Mehel kas sisaldub seda hormooni veres või mõni muu hormoon, mis võib antikehaga seonduda?
Kui liiga vara testi teha, siis ei pruugi anda õiget tulemust, kuna hormooni pole veel tootma hakatud piisavas koguses?
Tahke faasi ekstraktsiooni protseduur (38)
Padrun ekstraktoriks, väike kromatograafiline kolonn (100-1000 mg materjali). Automatiseerimine , mitmete proovide paralleelne töötlemine.
1. Padruni puhstamine eluendiga
2. Proovi voolutamine analüüt-maatriksi seguga (proovi rakendamine)
3. Elueerimine; padrunist desorbeeritakse analüüt, voolutades seda eluendiga.