Segu komponentideks lahutamine pöördfaasikromatograafia abil ning detekteerimine UV-detektoriga (0)

TTÜ keemiainstituut
Analüütilise keemia õppetool
YKA0040 Lahutusmeetodid keemias
Laboratoorne töö:
HPLC
Segu komponentideks lahutamine pöördfaasikromatograafia abil ning detekteerimine UV-detektoriga
Õpperühm: YASM11
Teostaja: Ilona Juhanson
Õppejõud: Heidi Lees
Teostati: 23.10.15
Teooria:
Kõrgefektiivne vedelikkromatograafia (HPLC) on füüsikaline lahutusmeetod, kus analüüsitava proovi lahutamine koostisosadeks põhineb komponentide jaotumisel statsionaarse ja mobiilse faasi vahel, lubades erinevate ainete kvalitatiivset ja kvantitatiivset analüüsi. Statsionaarne faas on paigaldatud kolonni sisse ning mobiilne faas voolab läbi kolonni kandes endaga kaasa analüüsitavat proovi. Mobiilse faasina kasutatakse polaarseid (nt vesi) või mittepolaarseid orgaanilisi solvente (nt heksaan ) ja statsionaarse faasina silikageeli.
Pöördfaaskromatograafia korral on mobiilne faas suhteliselt polaarne (vesi, metanool , atsetonitriil) ning statsionaarne faas mittepolaarne, tüüpiliselt silikageel, mille pinnale on seotud pikad süsivesinikahelad (C8-C18). Pöördfaaskromatograafias toimub lahutamine analüüdi molekulide polaarsuste alusel (komponendid elueeruvad polaarsuse kahanemise järjekorras).
Olenevalt sellest, kuidas mobiilse faasi koostis mõjutab analüüsitavate ühendite lahutust kasutatakse vedelikkromatograafias kas isokraatilist või gradientelueerimist. Isokraatilise elueerimise puhul on mobiilse faasi koostis kogu analüüsi ajal konstantne . Isokraatilise elueerimise kasutamine on võimalik, kui piisavalt lühikese ajaga saavutatakse proovi komponentide aktsepteeritav lahutus. Gradientelueerimist kasutatakse segu analüüsimisel, mille komponentide polaarsus varieerub suurtes piirides. Gradientelueerimise korral muudetakse mobiilse faasi koostist ajas, kusjuures mobiilse faasi elueeriv jõud suureneb.
HPLC süsteem koosneb kõrgsurve pumbast, dosaatorist, kromatograafilisest kolonnist, detektorist ja andmete töötlemise seadmest. HPLC-s kasutatakse edasi-tagasi liikuva kolviga pumpasid, mis varustavad kolonni eluendiga kindlal sagedusel. HPLC-s kasutatakse roostevabast terasest 2,1-4,6 mm sisediameetriga ja 30-300 mm pikkust kolonni, mille täidiseks on 3-10 μm läbimõõduga ebaregulaarse kujuga silikageeli osakesed.
Retentsiooniaeg (tR) – aeg, mis kulub ainel kolonni sisenemise hetkest detektorini jõudmiseks. Retentsiooniaeg kasvab proportsionaalselt kolonni pikkusega.
Eluendi retentsiooniaeg (t0) – aeg, mis kulub mobiilse faasi frondil kolonni läbimiseks.
Teoreetiliste taldrikute kõrgus (H) – iseloomustab kolonni efektiivsust pikkusühiku kohta. Sõltub osakeste diameetrist. L- kolonni pikkus (mm):
Teoreetiliste taldrikute arv ehk efektiivsus (N) - kolonni lahutamise efektiivsus. Mida suurem arv, seda kitsamad piigid . Sõltub kolonni pikkusest, statsionaarse faasi osakeste suurusest ja eluendi voo kiirusest:
Lahutuvus ehk resolutsioon (RS) - mida parem resolutsioon, seda parem lahutuvus, mis kajastub kitsamate piikidena ja suuremate vahedega ainete retensiooniaegades. Kui RS = 0 elueeruvad ained koos, ainete täielikuks lahutumiseks peab RS olema vähemalt 1,5-2. Tavaliselt on piigi laiust poolkõrgusel palju kergem mõõta kui piigi aluse laiust. Sellisel juhul näeb lahutuvuse valem välja järgmine, kus w0.5,1 and w0.5,2 on piigi laiused poolkõrgusel:
Mahtuvusfaktor ehk retentsioonifaktor (k’) - analüüdi viibimise aja statsionaarses faasis suhe analüüsi viibimise ajaga mobiilses faasis, tavaliselt k’=1–20. Piik mahtuvusfaktoriga 0 läbib kolonni statsionaarse faasiga interakteerumata ning väljub mobiilse faasi frondil:
Selektiivsuskoefitsent (𝛼) - määratud faasisüsteemi (liikumatu faas/ eluent ) ja analüüdi
omadustega, ainete lahutumiseks peab 𝛼 > 1:
Töö eesmärk:
Segu komponentideks lahutamine pöördfaasikromatograafia abil ning detekteerimine UV-detektoriga. Segus on järgmised ained:
Süsteem:
Kolonn : C18, L=150 mm, d=4,6 mm, dosake=5 μm
Eluent: atsetonitriil/vesi
Dosaator : 5 μl
Voolu kiirus: 0,7 ml/min
Detekteerimine 254 nm (UV)
Töö käik:

• Valmista 5 mM standardlahustest 1 ml proovi metanoolis nii, et analüütide sisaldus oleks 0,1 mM.
  

20 μl kvertsetiini, 20 μl rutiini. 1000 μl-40 μl=960 μl metanooli.

• Puhasta enne katsete alustamist süstal ja dosaator vähemalt 3 korda Milli-Q veega, seejärel prooviga
  
• Sisesta proov dosaatorisse nii, et sinna ei satuks mulle!
  

Arvutused:
1. Teoreetiliste taldrikute arv (N)
2. Teoreetiliste taldrikute kõrgus (H)
3. Lahutuvus ehk resolutsioon (RS)
4. Mahtuvusfaktor ehk retentsioonifaktor (k’)
5. Selektiivsuskoefitsent (𝛼)
6. Standardhälve (SD) ja suhteline standardhälve (RSD) katsete 2-4 retentsiooniaegadele
7. Iseloomusta saadud parameetrite põhjal süsteemi lahutusvõimet ja katsete korduvust
Katse 1; isokraatne elueerimine. 90% ACN, 10% H2O.
0,55
Alla 1,5, mis kirjeldabki seda, kui vähe lahus nad on.
= 1524 ,33
=2372,18
Katse 2. Gradientelueerimine. 20-100% ACN, ülejäänu vastavalt H2O (0-100 oleks ajad pikemad tulnud)
2,57
2,343
16866,78
45778,14
Katse 3 (Katse 2 kordus)
22,2
=1,10
=2,57
2,336
16947,21
43431,28
Katse 4 (Katse 2 kordus)
22,56
=1,103
=2,575
2,334
17101,47
46204,86
Katse 5 (piigi indentifitseerimine, Rutiiniga); võtta 200 μl proovi ning lisada sellele 2 μl standardlahust (rutiin või kvertsetiin) ning korrata katset:
22,64
1,109
2,582
2,328
17441,07
46387,44
Standardhälve (SD) ja suhteline standardhälve (RSD) retensiooniaegadele:
Kokkuvõte:
Ained elueeruvad standardhälbega 0,0092 ja 0,0075, vastava keskmise retensiooniajaga 7,162 ning 4,208 minutit, suhtelise standardhälbega 0,21% ja 0,11%.
Rutiini lisamisega pikenesid mõlema ühendi retensiooniajad, kuid esimesel ühendil rohkem, kusjuures mõlemi piigid kitsenesid. Võib öelda, et meetod on usaldusväärne .
Arvutatud α järgi on ained üksteisest hästi eraldatud ning N (kolonni efektiivsus aine lahutamisel) järgi on kolonn ja kasutatud eluentsüsteem antud ainete lahutamiseks sobivad. Rs järgi on piigid üksteisest hästi lahutatud, kuna Rs on väga palju üle 1. Ainel, mille K’ on üle 2, interakteerub kolonniga rohkem, elueerudes hiljem.