TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL MATEMAATIKA-LOODUSTEADUSKOND Geenitehnoloogia instutuut Praktiline töö nr. 2 SDS-PAGE Protokoll Koostaja: XXXXXX Juhendajad: Katrina Laks, Merlin Friedemann Tallinn, 2015.a Teoreetiline osa. Elektroforees on makromolekulide eraldamine elektrivälja toimel. SDS-PAGE (naatrium- dodetsüül sulfaat polüakrüülamiid geel elektroforees) on laialdaselt kasutatav valkude elektroforeetilise eraldamise meetod, kus valkude denatureerimiseks kasutatakse SDS-i. SDS (ka laurüül sulfaat) on anioonne detergent, mis seostub valgumolekulidega ja annab molekulidele negatiivse kogulaengu ning elektriväljas liiguvad nad anoodile (positiivselt laetud elektrood). Polüakrüülamiid geel piirab molekulide migreerumiskiirust, kusjuures väiksemad molekulid liiguvad kiiremini, kui suuremad molekulid
170 M 1 2 100 250 500 130 100 70 55 40 35 25 15 10 Tulemused- uuritav üleekspresseeritud valk on umbes 45 kDA ja üle 250 mikrogrammi/milliliitri kohta. marker Immunoblot Immunoblot on meetod, mis võimaldab uuritavas segus identifitseerida kindlat valku, eeldusel, et on olemas sellevastane antikeha ning määrata tema molekulaarmassi. Töö koosneb kolmest etapist: 1. Valkude lahutamine SDS-polüakrüülamiid geelektroforeesil. 2. Valkude ülekandmine membraanile. Pärast elektroforeesi hoiame geeli bloti puhvris umbes 10 min. Valkude ülekandmine geelist membraanile bloti aparaadis. Selleks, et seda teha, paneme bloti aparaadi anoodplaadi peale puhvris olnud filter, siis puhvis olnud membraan, siis geel ja jälle filter. Rullime kõik mullid välja ja paneme katoodplaat peale. Ülekanne toimub 15-25min, 10-15V.
hoiavad värvi tugevamalt kinni kui geel). Esimene marker on ära tulnud, seega loen algusest ühe juurde. Minu valgu suuruseks on umbkaudu 28 kD ja kontsentratsiooniks 150 µg/µl. Immunoblot (Western Blot) Immunoblot on meetod, mis võimaldab uuritavas segus identifitseerida kindlat valku, eeldusel, et on olemas sellevastane antikeha, ning määrata tema molekulmassi. Töö koosneb kolmest etapist: 1. Valkude lahutamine SDS-polüakrüülamiid geelektroforeesil. 2. Valkude ülekandmine membraanile. · Pärast elektroforeesi hoiame geeli bloti puhvris umbes 10 min. · Valkude ülekandmine geelist membraanile bloti aparaadis. Paneme bloti aparaadi anoodplaadi peale puhvris olnud filtri, membraani, geeli ja jälle filtri. Rullime kõik mullid välja ja paneme katoodplaadi peale. · Ülekanne toimub 15-25min, 10-15V.
lahusest ära ja pildistame neid. Markerite suuruse järgi määrame uuritava valgu suurus. Seega minu uuritava valgu suurus on liigi kaudu 25 Da. Immunoblot. Immunoblot on meetod, mis võimaldab uuritavas segus identifitseerida kindlat valku, eeldusel, et on olemas sellevastane antikeha ning määrata tema molekulaarmassi. Töö koosneb kolmest etapist: 1. Valkude lahutamine SDS-polüakrüülamiid geelektroforeesil. 2. Valkude ülekandmine membraanile. · Pärast elektroforeesi hoiame geeli bloti puhvris umbes 10 min. · Valkude ülekandmine geelist membraanile bloti aparaadis. Selleks, et seda teha, paneme bloti aparaadi anoodplaadi peale puhvris olnud filter, siis puhvis olnud membraan, siis geel ja jälle filter. Rullime kõik mullid välja ja paneme katoodplaat peale. · Ülekanne toimub 15-25min, 10-15V.
1959. aastal alustati jaama laienduse projekteerimisega. Paralleelselt otsiti uusi võimalusi veetoodangu tõstmiseks. Vertikaalsed settebasseinid ehitati hõljuva kihiga selititeks. Kui settebasseinides eraldus koagulatsioonil tekkinud sade ainult oma raskusjõu mõjul ja vee liikumiskiirus ei olnud seetõttu kuigi suur, siis hõljuva kihiga selitites kasutati ära ka hõljuva settekihi filtreerimisvõime, mis lubas tõsta vee voolu kiirust. Kasutusele võeti abikoagulandina polüakrüülamiid rahvakeeles polla. Aastaid hiljem, kui koagulandi vagunist laadimisel kasutati lintlaadijat, mille rahvakeelseks nimetuseks sai pontu, oli hommikustel nõupidamistel lööklauseks teade: ,,Pontu on rikkis ja polla ei jookse." Jaama laiendus 1965. aastal võeti kasutusele jaama laiendus. Veepuhastusjaama toodanguks loeti nüüd 102 000 m3/ööpäev. Uue ehitusega muutus jaama töös palju: seadmed viidi üle
Valgud lõhutakse merkaptoetanooliga, lõhutakse SDS-ga (dodetsüülsulfaat) nii, et laeng muutub võrdeliseks molekulkaaluga (1 SDS 2 AH kohta), misläbi valk muutub vardakujuliseks, liikudes aeglasemalt geelil oma pikkuse tõttu. Kahemõõtmelisus 1. IEF - lahutamine laengu järgi 2. SDS-PAGE - proovi lahutamine suuruse järgi SDS-PAGE eesmärk on lahutada valke suuruse alusel. SDS - naatrium dodetsüülsulfaat, denatureerib valku peptiidahelaks, primaarstruktuuriks. PAGE - polüakrüülamiid geelelektroforees; kui denatureeritud valgud elektrivälja panna, hakkavad nad liikuma "+" laengu suunas ühe kiirusega. Lahutamiseks tuleb lisada keskkonda geel, polüakrüülamiid, misläbi toimub lahutumine suuruse alusel, kus väiksemad liiguvad läbi esmalt, seejärel suuremad valgud. Voogsisestusanalüüsi põhiidee ja aparatuurne realisatsioon Diskreetse e Batch analüüsi puhul on erinevad proovid erinevates anumates läbi kõigi analüüsitsüklite; Suurema läbilaskevõimega,
ca 170 °C peal. Seejärel lastakse tselluloosi mass koos tegelikult hüdroperoksiid-anioon HOO- , mis tekib · viibimisaja regulaatorid (alumiiniumsulfaat, äratootanud keedulahusega ("weak black liquor") katlast vesilahuses: polüakrüülamiid). Nende ülesanne on kinni pidada välja sõela peale. Äratöötanud keedulahus H2O2 + NaOH = HOO- + Na+ + H2O täiteainete väikesi osakesi (palju väiksemad, kui eemaldatakse vaakumiga. Pulp suunatakse pesemiseks H2O + Na2O2 = HOO- + 2Na+ + OH-
Kromatograafilised meetodid baseeruvad biomolekulide korduval selektiivses jaotumises kahefaasilises süsteemis. Kromatograafiat kasutatakse, et eraldada segunenud ained üksteisest. Siinkohal siis on vaja valgud eemaldada lahusest e rakuekstraktist. Ioonvahetuskromatograafia, õhukese kihi kromatograafia, pöördfaaskromatograafia, geelfiltratsioonkromatograafia. Geelelektroforeesi põhimõte – lahutamine poorses keskkonnas elektrivälja toimel. Kasutatavad polüakrüülamiid geel ja agaroos. Isoelektriline fokuseerimine. Biomolekulide detekteerimise meetodid geelis. Geel värvitakse valgu spetsiifilise värviga/spets antikehad. 11. Nukleotiidid Nukleiinhapped on biomakromolekulid, milles nukleotiidijäägid on seostunud fosfodiestersidemega. Inimkehas on kaks nukleiinhapet – DNA ja RNA. Nukleotiidid on nukleiinhapete monomeerid, rakus esinevad anioonidena, on happed.
Kromatograafiat kasutatakse, et eraldada segunenud ained üksteisest. Siinkohal siis on vaja valgud eemaldada lahusest e rakuekstraktist. Ioonvahetuskromatograafia (laeng), õhukese kihi kromatograafia, pöördfaaskromatograafia, geelfiltratsioonkromatograafia (valkude sadestumine suuruse järgi. Geelelektroforeesi põhimõte lahutamine poorses keskkonnas elektrivälja toimel. (1 aine liigub teiste suhtes, liikuma panev jõud- elekter). Kasutatavad polüakrüülamiid geel ja agaroos. Isoelektriline fokuseerimine. Biomolekulide detekteerimise meetodid geelis. Geel värvitakse valgu spetsiifilise värviga/spets antikehad. Geeli sisu peab olema aluseline, kõik valgud aluselises KK on neg. laenguga- ioonid liiguvad 11. Nukleotiidid Nukleiinhapped on biomakromolekulid, milles nukleotiidijäägid on seostunud fosfodiestersidemega. Inimkehas on kaks nukleiinhapet DNA ja RNA.
tüpiseerimisel. 40. Elektroforees Elektroforees on elektriliselt laetud osakeste liikumine vedelikus elektrivälja mõjul: positiivsed osakesed katoodile ja negatiivsed osakesed anoodile. Elektroforees on meetod, kus laetud osakesed liiguvad elektrijuhtivust omavas vedelas keskkonnas elektrivälja mõjul. Geel-elektroforees - DNA kaksikahel liigub geelis elektriväljas kiirusega, mis on pöördvõrdeline log 10 ga tema massist (suurusest). 1. maatriks on agaroos või polüakrüülamiid 2. puhver tagab, et DNA on laetud negatiivselt 3. DNA liigub suunas - + (katoodilt anoodile). 40. Nukleiinhapete hübridiseerimine NH hübridiseerimine pôhineb denatureerunud DNA ja RNA renatureerumise fenomenil, mis seisneb selles, et teatud tingimustel denatureeritud NH ahelad on vôimelised uuesti renatureeruma ja moodustama ka vabade komplementaarsete NH ahelatega topeltahelaid.
tüpiseerimisel. 40. Elektroforees Elektroforees on elektriliselt laetud osakeste liikumine vedelikus elektrivälja mõjul: positiivsed osakesed katoodile ja negatiivsed osakesed anoodile. Elektroforees on meetod, kus laetud osakesed liiguvad elektrijuhtivust omavas vedelas keskkonnas elektrivälja mõjul. Geel-elektroforees - DNA kaksikahel liigub geelis elektriväljas kiirusega, mis on pöördvõrdeline log 10 ga tema massist (suurusest). 1. maatriks on agaroos või polüakrüülamiid 2. puhver tagab, et DNA on laetud negatiivselt 3. DNA liigub suunas - + (katoodilt anoodile). 40. Nukleiinhapete hübridiseerimine NH hübridiseerimine pôhineb denatureerunud DNA ja RNA renatureerumise fenomenil, mis seisneb selles, et teatud tingimustel denatureeritud NH ahelad on vôimelised uuesti renatureeruma ja moodustama ka vabade komplementaarsete NH ahelatega topeltahelaid.
Elektroforees on elektriliselt laetud osakeste liikumine vedelikus elektrivälja mõjul: positiivsed osakesed katoodile ja negatiivsed osakesed anoodile. Elektroforees on meetod, kus laetud osakesed liiguvad elektrijuhtivust omavas vedelas keskkonnas elektrivälja mõjul. Geel-elektroforees - DNA kaksikahel liigub geelis elektriväljas kiirusega, mis on pöördvõrdeline log 10– ga tema massist (suurusest). 1. maatriks on agaroos või polüakrüülamiid 2. puhver tagab, et DNA on laetud negatiivselt 3. DNA liigub suunas - + (katoodilt anoodile). 45. Nukleiinhapete hübridiseerimine Kindla NA järjestuse tuvastamine NA molekulide segust kasutates komplementaarsusel põhinevat üksikahelate paardumist. - Geelis lahutatud DNA/RNA kantakse üle (nailon)membraanile, nii et nad oleksid üksikahelad - Meid huvitav järjestus märgistatakse radioaktiivselt vm meetodil (proov)
Elektroforees on elektriliselt laetud osakeste liikumine vedelikus elektrivälja mõjul: positiivsed osakesed katoodile ja negatiivsed osakesed anoodile. Elektroforees on meetod, kus laetud osakesed liiguvad elektrijuhtivust omavas vedelas keskkonnas elektrivälja mõjul. Geel-elektroforees - DNA kaksikahel liigub geelis elektriväljas kiirusega, mis on pöördvõrdeline log 10 ga tema massist (suurusest). 1. maatriks on agaroos või polüakrüülamiid 2. puhver tagab, et DNA on laetud negatiivselt 3. DNA liigub suunas - + (katoodilt anoodile). 45. Nukleiinhapete hübridiseerimine Kindla NA järjestuse tuvastamine NA molekulide segust kasutates komplementaarsusel põhinevat üksikahelate paardumist. - Geelis lahutatud DNA/RNA kantakse üle (nailon)membraanile, nii et nad oleksid üksikahelad - Meid huvitav järjestus märgistatakse radioaktiivselt vm meetodil (proov)
Lahust inkubeeritakse, mille jooksul mõlemad antigeenid konkureerivad võrdselt pinnale seotud piiratud antikeha sidumiskohtade pärast. 3. Seostumata antigeen pestakse minema ja lisatakse substraat. 4. Resultaat: mida tugevam värvuse intensiivsus, seda vähem oli uuritavat antigeeni proovis. Immunoblotting - valguliste antigeenide analüüsimiseks/identifitseerimiseks. Valgud lahutatakse elektroforeesil polüakrüülamiid geelis, kantakse siis nitrotselluloosmembraanile. Membraani inkubeeritakse esmalt uuritava antigeeni vastase antikeha lahusega, siis antiimmunoglobuliini antikehadega või proteiin-Aga, mis on märgistatud fluoresentse värviga või ensüümiga. SDS-PAGE elektroforees - võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulmassi järgi. SDS (naatriumdodetsüülsulfaat) on anioonne detergent, mis on vajalik valkude denatureerimiseks. SDS seostub
elektroforeesi. Elektroforees DNA ja RNA on negatiivse laenguga ja seetõttu liiguvad elektriväljas negatiivse elektroodi katoodi poolt positiivse elektroodi anoodi suunas. Nukleiinhapete elektroforeesil lahutatakse erineva suurusega DNA fragmentide segu vastavalt fragmentide suurustele ja võrreldakse neid mingi standardiga e. markeriga. Elektroforeesil liiguvad nukleiinhapped elektrivälja mõjul spetsiaalses keskkonnas geelis. Kaks tüüpilist foreesikeskkonda on: 1. Polüakrüülamiid 2. Agaroos Polüakrüülamiid on sünteetiline polümeer, mis moodustab poorse struktuuriga erineva läbimõõduga tunnelite labürindi. Kasutatakse lühikeste DNA/RNA fragmentide (5-500 bp) lahutamiseks. Polüakrüülamiidgeel elektroforees võib olla: • Vertikaalne ühedimensiooniline • Vertikaalne kahedimensiooniline • Horisontaalne Agaroos on lineaarne polümeer, mis koosneb D- ja L-galaktoosi jääkidest. Agaroosi ahelad
segatakse kindla hulga ensüüm-märgistatud antigeeniga. Lahust inkubeeritakse, mille jooksul mõlemad antigeenid konkureerivad võrdselt pinnale seotud piiratud antikeha sidumiskohtade pärast. 3. Seostumata antigeen pestakse minema ja lisatakse substraat. Resultaat: mida tugevam värvuse intensiivsus, seda vähem oli uuritavat antigeeni proovis. Immunoblotting- Tehnika valguliste antigeenide analüüsimiseks ja identifitseerimiseks. Valgud lahutatakse elektroforeesil polüakrüülamiid geelis, kantakse siis nitrotselluloosmembraanile. Membraani ikubeeritakse esmalt uuritava antigeeni vastase antikeha lahusega, siis antiimmunoglobuliini antikehadega või proteiin-Aga, mis on märgistatud radioisotoobi või fluoresentse värviga või ensüümiga. SDS-PAGE elektroforees- SDS-PAAG (polüakrüülamiidgeel) võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulmassi järgi. SDS (naatriumdodetsüülsulfaat) on anioonne detergent, mis on vajalik valkude denatureerimiseks
Nüüd ahela süntees 70-75°C juures kasutades termo-resistentset DNA polümeraasi (nn. Taq polümeraas saadud Thermus aquaticus'elt). Sama protseduuri (denaturatsioon, liitmine ja ahela süntees) korrata 20-45 korda (s.o. 1 million kuni 35 trillionit koopiat). Jahutame 4°C ja säilitame paljundatud DNAd analüüsideks. Kaasaegne automatiseeritud sekveneerimine fluorestseeriva märgiga: 4 värviga märgitud nukleotiidid ühes tuubis ja foreesitakse ühel joonel polüakrüülamiid geelis või siis kapillarides, millistes on geel. UV laser detekteerib värvid ja loeb järjestuse. Järjestus visualiseerub eri värvidega kromatogrammil, mis vastab nukleotiidide järjestusele. Väljund umbes 1200 aluspaari reaktsioonis ja 96 reaktsiooni 3 tunni jooksul. Enamus automatiseeritud sekvenaatoreid laetakse robotitega ja need töötavad 24 tundi järjest. Minimaalne tööjõu kulu. DNA fingerprinting ehk DNA tüpiseerimine (profiling). Ei ole olemas kahte ühesuguse
mRNA 5´otsas ribosoomiga seondumise ala) samas lugemisraamis uuritava geeni valgu N- terminaalset osa kodeeriv DNA järjestus ja mõõdetakse liitvalgu ekspressiooni. Arvestama peab võimalusega, et sellise liitjärjestuse puhul võib olla muutunud mRNA stabiilsus ning see võib samuti mõjutada liitvalgu ekspressioonitaset. 5. 2-D geelid ja mass-spektromeetria. Erinevate valkude hulga hindamiseks bakterirakus kasutatakse totaalvalgu lahutamist 2-D polüakrüülamiid-geelelektroforeesil. Igale valgule vastab geelis kindel koht, kus valk on visualiseeritav täpina. Mida rohkem on valku, seda intensiivsem on vastav täpp. Kui eraldada totaalvalk erinevates tingimustes kasvatatud bakterirakkudest, näeme täppide mustris erinevusi. Mass-spektromeetria võimaldab määrata valgu järjestusi ka väga väikeste valgukoguste (pikomoolide ja isegi femtomoolide) korral, mida on võimalik saada valkude puhastamisel 2-D geelist
võimalik retentsiooniaeg (olenevalt sellest, kas osakesed läbivad kõikvõimalikud sorbendi poorid või liiguvad ümber sorbendiosakeste). 115. Afiinsuskromatograafia põhimõte. Tahke kandjaga on seotud kovalentselt afiinsusligand (biokeemiline ühend), mis selektiivselt seob teatud proovi komponendid. Ülejäänud proov elueerub kolonnis sorbeerumata. Väga suur selektiivsus, mis on kasulik preparatiivseks tööks. Tahked kandjad on hüdrofoobsed: agaroos, tselluloos, polüakrüülamiid. Ligandid: ensüümid, antikeha. Seotud ühendite elueerimine: ligandi lahuse abil. Kasutatakse biokeemilistes rakendustes, kus analüüt seostub statsionaarse faasiga, kõik muu ei seostu. Valides sobiva eluendi saame analüüdi statsionaarse faasi küljest lahti VEDELIKKROMATOGRAAFIA 116. Kõrgefektiivne vedelikkromatograafia (HPLC), selle aparatuur. Ainete eraldamine võib toimuda mitmete erinevate omaduste järgi. Tavalisim: Polaarsus
ribosoomiga seondumise ala) samas lugemisraamis uuritava geeni valgu N-terminaalset osa kodeeriv DNA järjestus ja mõõdetakse liitvalgu ekspressiooni. Arvestama peab võimalusega, et sellise liitjärjestuse puhul võib olla muutunud mRNA stabiilsus ning see võib samuti mõjutada liitvalgu ekspressioonitaset. 5. 2-D geelid ja mass-spektromeetria. Erinevate valkude hulga hindamiseks bakterirakus kasutatakse totaalvalgu lahutamist 2-D polüakrüülamiid-geelelektroforeesil. Igale valgule vastab geelis kindel koht, kus valk on visualiseeritav täpina. Mida rohkem on valku, seda intensiivsem on vastav täpp. Kui eraldada totaalvalk erinevates tingimustes kasvatatud bakterirakkudest, näeme täppide mustris erinevusi. Mass-spektromeetria võimaldab määrata valgu järjestusi ka väga väikeste valgukoguste (pikomoolide ja isegi femtomoolide) korral, mida on võimalik saada valkude puhastamisel 2-D geelist.
annaabi.ee 
