Analüütiline keemia ja instrumentaalanalüüs eksami kordamisteemad (0)

KORDAMISTEEMAD EKSAMIKS Analüütiline keemia ja instrumentaalanalüüs 1. Keemilise analüüsi ajalugu Flogistoniteooria  ● rajaja Becher 17. sajandi keskpaigas ● flogiston on aine, mille tõttu asjad põlevad ● tuli on vaba flogiston ● Lavoisier   lükkas   ümber,   näidates,   et   põlemine   vajab   teatud  gaasi,   hapniku,   olemasolu   ning määras õhu ja vee keemilise koostise. Robert Boyle: nö märja keemia rajaja, lahuste kasutamine, esimeste gaasiliste ainete valmistamine. Mihhail   Lomonossov:   kvantitatiivse   analüüsi   meetodid,   võttis   kasutusele   kaalud,   sõnastas   massi jäävuse teaduse. Joseph Priestley: avastas ja eraldas hapniku.  Henry Cavendish: vesi ei ole keemiline element, koosneb hapnikust ja vesinikust. Martin Klaproth: avastas uraani, tsirkooni ja tseeriumi, arendas mineraalide keemilist analüüsi, andis nimetused   titaanile,   strontsiumile   ja   telluurile   ning   tuvastas   gravimeetriliselt   Kreeka   ja   Rooma vasesulamitest müntide jt metallesemente koostisi. Justus von Liebig: süstemaatiline elementanalüüs. Friedrich Ostwald: sõnastas analüütilise keemia eesmärgi – analüütiline keemia on kunst ära tunda erinevaid substantse ja tuvastada nende koostisosi. Alates 20. sajandist domineerib üha enam instrumentaalanalüüs. 2. Analüütiliste meetodite jagunemine Klassikalised meetodid: analüütide eraldamine sadestamisel, ekstraktsioonil või destillatsioonil. Kvalitatiivsed meetodid: värvuse, keemistemperatuuri, lahustuvuse, maitse jms tuvastamine. Kvantitatiivsed meetodid: gravimeetrilised (kaalanalüüs) ja tiitrimeetrilised (mahtanalüüs) mõõtmised.


Instrumentaalsed   meetodid:   uued   kiired   ja   efektiivsed   mõõtevahendid,   mõõdavad   analüütide füüsikalisi   suurusi,   nagu   elektrijuhtivus,   elektroodipotentsiaal   (pH-meeter),   valgusneelduvus (fotospektromeeter), massi-laengu suhe (massispektromeeter), fluorestsents jne. 3. Proovide liigitus. Homogeenne ja heterogeenne proov. Homogeenne ehk ühtlase koostisega, nt KOH vesilahus Heterogeenne ehk ebaühtlase koostisega, nt kivimid (graniit) Ideaalne proov heterogeensest materjalist koosneb mitmest proovist, mille summaarne koostis kajastab kogu uuritava objekti koostist. Proovi   ettevalmistuse   etapid:   homogeniseerimine,   kaalumine,   lisandite   eraldamine,   lahustamine, lahjendamine, filtrimine. 4. Analüüt ↔ analüütiline signaal ↔ dešifreeritud tulemus. Analüütik → analüüs → tulemus Analüütiline signaal  – uuritavas objektis analüüdi poolt põhjustatud  vastus  välisele mõjutusele, mida saab mõõta, näiteks neeldumise või kiirguse intensiivsus teatud lainepikkusel, elektrijuhtuvus jne. Dešifreeritud tulemus – lahtimõtestatud tulemus, näiteks massispektri piikide tähendus. Analüütik ehk analüüsi teostaja. 5. Keemilise analüüsi jagunemine. ● Kvalitatiivne     (värv, m/z, elektrijuhtivus jms) ja kvantitatiivne (kogus) analüüs. ● Makro-, mikro- ja poolmikro analüüs: ○ makroanalüüsis on ainet vähemalt 0,1 g ○ mikroanalüüsis on ainet 0,01 g või vähem ○ poolmikro analüüsis on ainet rohkem kui 0,01 g kuid vähem kui 0,1 g. ● Klassikaline (keerulisim masin on kaal) ja instrumentaalanalüüs. 6. Kvalitatiivne analüüs – eraldamise põhimõte ja näited Kvalitatiivne analüüs teeb kindlaks aine koostisesse kuuluvad komponendid.


Klassikaliseks   meetodiks   on  reaktsioonide   läbiviimine,   mille   aluseks   on   keemilistele   ainetele iseloomulikud reaktsioonid, millel on vaatluseks sobivad välised tunnused, nagu värvuse muutumine lahuses, värviliste sademete või gaaside teke, gaasipõleti leegi värvumine jt. Kvalitatiivset analüüsi jagatakse spetsiifiliseks ja süstemaatiliseks analüüsiks: ● spetsiifiline analüüs määrab üksikut ainet või ainete rühma (kas sisaldab halogeene/kloori) ● süstemaatiline analüüs määrab kõik objektis leiduvad ained, rühmitades neid reaktiivide abil. Näiteks anioonide ja katioonide süstemaatiline analüüs (mis sadeneb, mis valastub, mis värvi on sade), metallide ja sulamite analüüs, mineraalide analüüs, leekreaktsioonid. Näiteks vase olemasolu müntides on võimalik määrata HNO3 1:1 vesilahusega (lahus rohelise värviga). 7. Mahtanalüüs   –   tiitrimine.   Meetodi   põhimõte,   näited   ja   võimalused.   Kasutusalad tänapäeval.  Mahtanalüüs ehk tiitrimine on klassikalise analüütilise keemia meetod, mille eesmärk on mingi lahuses sisalduva komponendi sisalduse määramine ehk teisisõnu lahuse kontsentratsiooni määramine. ● Reaktsiooni järgi redokstiitrimine, hape-alus tiitrimine jne Tiitrimine põhineb tiitritava aine reaktsioonil titrandiga.  Reaktsioon titrandi ja analüüsitava (otsitava) aine vahel peab kulgema lõpuni. Reaktsiooni   lõpp-punkt   tuvastatakse   indikaatori   kaudu   (mingi   keemiline   või   füüsikaline   näitaja,   tihti kasutatakse fenoolftaleiini etanoollahust). ● Indikaatoriks võib olla mistahes parameeter, mis on seotud toimuva reaktsiooniga ja muutub reaktsiooni lõppedes, näiteks fenoolftaleiini värvuse muutus lahuse pH muutudes (happelisest aluseliseks), kuid ka voolujuhtivus potentsiomeetrilisel tiitrimisel, valgusneelduvus fotomeetrilisel tiitrimisel jne. Tiitrimisel peab olema teada: ● Mida tiitritakse ehk tiitritav lahus ehk määratav lahus ● Titrandi ehk mõõtelahuse kontsentratsioon  ● Titrandi ja tiitritava lahuse ruumalad ● Reaktsioonivõrrand, mis kirjeldab titrandi ja tiitritava aine vahelist moolsuhet. ● Mida oodata – lahuse värvuse, pH, elektrilise potentsiaali jms muutus Klassikaliseks   näiteks   on   HCl   sisalduse   määramine   lahuses   tiitrimisel,   kasutades   titrandina   leelist (NaOH, KOH jt).°


Proteolüütiline tiitrimine ehk hape-aluse tiitrimine, toimuvad neutralisatsiooni meetodil. ● HCl + NaOH = NaCl + H2O ● Vee tekkimine on protolüüsi tunnus. ● Hape on prootoni doonor ja alus prootoni aktseptor. ● Protolüütilise tiitrimise analüütiliseks signaaliks on pH muutumine. Tiitrimisel tänapäevased kasutusalad: ● hape-alus   tiitrimine   biodiisli   happesuse   ning   toiduainetööstuses   rasvhapete   sisalduse määramiseks ● redokstiitrimine joodi juuresolekul võimaldab määrata küllastumata rasvhapete sisaldust ● hape-alus   tagasitiitrimine   või   potentsiomeetriline   tiitrimine   seebistumisväärtuse   määramiseks, täpsemalt rasvas sisalduvate rasvhapete keskmise süsivesinikahela pikkuse määramiseks. ● Karl Fischeri tiitrimine vee jälgkontsentratsioonide analüüsimiseks ainetes. 8. pH-meetri tööpõhimõte pH-meeter ehk potentsiomeeter mõõdab indikaatorelektroodi ja võrdluselektroodi potentsiaalide vahet. ● Indikaatorelektroodiks on tihti klaaselektrood ● Võrdluselektroodiks on hõbe- või hõbekloriidelektrood. pH-meetri klaasi atomaarne struktuur laseb Na-ioonidel difundeeruda klaasist lahusesse, kuid H-ioonid klaasmembraani ei läbi.  Na-ioonide lahkumine süsteemist muudab selle vaba enegrgia muutu ning seda vaba energia muutu mõõdab pH-meeter. Elektroodi klaasi välis- ja sisesein laaduvad erinevalt sõltuvalt ioonide kontsentratsioonist uuritavas lahuses. 9. Sadetusmeetod ja kompleksmeetod – põhimõte.  Sadestusmeetodi aluseks on sademe teke tiitrimise käigus.  ● Lõpp-punkti määramine värvilise sademe tekke järgi – Mohri meetod.  ● Sademe   tekke   kriteeriumiks   on   selle   lahustuvuskorrutis   –   sade   tekib   kui   ioonide kontsentratsioonide korrutis on suurem lahustuvuskorrutisest. ● Sadestusmeetodit rakendatakse Cl-, Br-, I-, Ag+, PO43-, SO42- jt ● Sadestusmeetodi tiitrimiskõverad ioonselektiivsete elektroodidega. Kompleksmeetodi aluseks on kompleksühendite moodustumine analüüdi ja titrandi vahel. Levinuim on kompleksonomeetria, mis kasutab titrandina kompleksooni. ● Terve elektronpaari loovutamine/vastuvõtmine. ● Titrandiks tihti EDTA ehk eteendiamiintetraetaanhappe lahus (triloon B)


● EDTA moodustab metalliioonidega ühendeid suhtes 1:1 sõltumata nende oksüdatsiooniastmest. Kasutatakse vee kareduse määramiseks ning metalliioonide kontsentratsiooni määramine. 10. Tiitrimise jaottus lõpp-punkti järgi Tiitrimise jaotub ka lõpp-punkti mõõtmise metoodika järgi:  ● hape-alus tiitrimine ● redokstiitrimine ● sadestustiitrimine ● komplekstiitrimine ● amperomeetriline tiitrimine ● potentsiomeetriline tiitrimine ● soojustiitrimine jne. 11. Kaalanalüüsi ehk gravimeetria põhimõte, näited ja vahendid Kaalanalüüs on klassikalise analüütilise keemia meetod, millel saab määrata aine või ainete rühma sisaldust proovis. Kaalanalüüsi aluseks on analüüdi muutmine rasklahustuvaks kindla koostisega ühendiks, mida saab süsteemist eraldada ja kaaluda. ● Enamasti sadestatakse uuritav aine rasklahustuvaks sademeks. ● Vahel uuritav aine aurutatakse ja kogutakse absorbendile. ● Niiskuse analüüsil mõõdetakse kaaluvahet. ● Peamisteks vahenditeks on kaal ning filtrid (tuhavaba kurdfilter jt) Näiteks   vee   sulfaadisisalduse   määramine,   millel   sadestatakse   analüüt   BaCl2-ga   happelises keskkonnas, seejärel kuumutatakse 80...90 kraadi juures vähemalt 2h. Sade filtritakse, kuumutatakse 800 kraadi juures püsiva massini. Määramistäpsust vähendavad NO3- ja Cl- esinemine vees. Näide   väävel   metallimaagis:   metallimaaki   töödeldakse   HNO3   ja   kaaliumkloraadiga   (KClO3),   et   viia kogu   väävel   sulfaadivormi.   Nitraadid   ja   kloraadid   eemaldatakse   HCl-ga   töötlemisel.   Sulfaat sadestatakse Ba2+ ioonide abil baariumsulfaadina ja kaalutakse. Gravimeetria eelised: võib anda väga täpseid tulemusi, instrumentaalsed vead minimaalsed, pole vaja palju standardlahuseid, odav, kaalanalüüsi saab kasutada teiste instrumentide kalibreerimiseks Gravimeetria puudused: analüüsida saab korraga vaid  ühte elementi  või piiratud elementide gruppi, tänapäevane   termokromatograafiline   analüüs   või   elementanalüüs   annavad   kiiremaid   analüüse   ning


suurema   hulga   ainete   kohta,   kaalanalüüsi   meetod   võib   olla   väga   keerukas   ning  väike   viga   võib põhjustada suurt viga. Termogravimeetria   on   tehnika,   kus   proovi   massi   mõõdetakse   kontrollitud   temperatuuriprogrammis. Ainete lagunemise uurimine sõltuvalt temperatuurist. 12. Spektromeetria – üldine põhimõte. Mis on spekter, selle piirkonnad (elektromagnetlainete jaotust), spektri teke  Spektroskoopia  –   füüsikaharu,   mis   uurib   kiirguse   interaktsiooni   ainega,   st   kiirguse   neeldumist, emissiooni ja hajumist. Spektromeetria – spektroskoopia põhiline töövahend on spektromeeter. Spekter tekib kui valgus lasta läbi prisma.  Fotomeetriliste   analüüsimeetodite   aluseks   on   EMK   ehk   valguse   seos   ainega.   Vastavalt   kasutatud valguse omadustele jaotuvad meetodid: ● Spektraalanalüüs – uuritav aine kas neelab või kiirgab selektiivselt valgust. ● Refraktomeetria – uuritavas aines toimub valguse murdumine. ● Polarimeetria – uuritav aine on optiliselt aktiivne ning muudab valguse polarisatsiooni tasapinda. Spektromeetria uurib valguse (EMK) intensiivsuse ning lainepikkuse vahelisi sõltuvusi. Spektromeetria annab   teavet   aine   kohta,   kasutades   ära   aine   ja   valguse   vahelisi   reaktsioone.   Tööriist   selleks   on spektrofotomeeter, mis mõõdab valguse intensiivust sõltuvalt lainepikkusest. Elektromagnetlained:   gammakiirgus,   röntgenkiirgus,   UV-kiirgus,   nähtav   valgus,   infrapunakiirgus, mikrolained, raadiolained. 13. Spektrite liigid. Kuidas tekib aatomspekter? Kiirgusspekter ehk emissioonspekter ja neeldumisspekter ehk absorptsioonspekter Spekter võib olla kas pidev spekter või joonspekter. Aatomspektrit   on   võimalik   saada,   kui   elektron   vahetab   orbiiti   ning   siis   see   kas   kiirgab   või   neelab elekromagnetkiirgust (EMK). ● EMK koosneb valguskvantidest ehk footonitest. Footoni energiast sõltub valguse lainepikkus ja sagedus.


● Liikudes kõrgemale orbiidile neelab elektron EMK-st (absorptsioonispekter) ● Liikudes madalamale orbiidile kiirgab elektron EMK-st (emissioonispekter) ● Aine atomaarkoostisele vastavad kindla lainepikkusega joonspektrid. Kiirgusemissiooni saamiseks tuleb aine aatomid ergastada ehk viia need kõrgema energiaga olekusse. Kõrgemalt energiatasemelt madalamale minek vabastab seotud energiavaru. Lambert-Beeri seadus: valguse absorptsioon lahuses sõltub analüüsi kontsentratsioonist, valguse tee pikkusest lahuses ja absorbeeriva aine iseloomust. 14. Spektrofotomeetri ehitus On ühekiirelised ning kahekiirelised spektrofotomeetrid: ● Ühekiirelised   mõõdavad   ühe   valguskiire   absoluutset   intensiivsust   ning   mõõtmise   lineaarne piirkond on sageli suurem. ● Kahekiirelised   mõõdavad   kahe   valguskiire   intensiivsuste   suhet,   mõõtmised   stabiilsemad   ja lihtsamad. Esimestes   spektromeetrites   kasutati   monokromaatoreid   spektri   analüüsimiseks,   tänapäevastes instrumentides kasutatakse ka dioodvõresid, millel on palju fotosensoreid. On ka spektrofotomeetreid Fourier’ teisenduse meetodit, mis annab kiirema spektraalse informatsiooni. Spektrofotomeetri töö lühidalt: 1. Valgusallikast suunatakse valguskiir läbi proovi. 2. Proov absorbeerib osa valgusest. 3. Detektor mõõdab, kui palju valgust absorbeerus, ning muundab tulemuse numbrinäiduks, mis kuvatakse ekraanil. Spektrofotomeetri komponendid:  ● valgusallikas (D2 lamp või Volfram-lamp) ● filter ● monokromaator (võimaldab kiirgusallika spektrist eraldada kitsaid piirkondi) ● kiirejagaja, peegel, võrdlusproov* (kahekiirelises) ● proov ● fotodiood(id) – detektsioon ● arvuti Ühekiireline spektrofotomeeter: valgusallikast suunatakse valguskiir läbi filtri monokromaatorile, sealt edasi läbi proovi fotodioodile ning arvutisse, mis annab spektri graafikul.


Kahekiireline spektrofotomeeter: valgusallikast suunatakse valguskiir läbi filtri monokromaadile, sealt edasi jaguneb see kiirejagajas kaheks. Üks valguskiir läheb läbi proovi ühele fotodioodile ning teine võrdlusproovile ning teisele fotodioodile. Mõlemad tulemused suunatakse arvutisse, mis annav spektri graafikuna. 15. Infrapunaspektroskoopia üldpõhimõte Infrapunaspektroskoopia puhul mõõdetakse analüüdi poolt neelatud infrapunakiirguse intensiivsust. ● kui analüüdiks on molekulid – molekulaarspektroskoopia Vibratsiooni ehk võnkespektroskoopia: neeldumised spektris, mis põhjustavad molekulide üleminekut madalamalt võnkenivoolt kõrgematele, põhjustavad võnkumiste ergastumist. Paljusid võnkumisi saab siduda konkreetsete funktsionaalrühmadega. 16. Mass-spektroskoopia üldpõhimõte Massispektroskoopia on analüütilise keemia meetod, millel saab määrata ioonide masse nende massi- laengu  suhte abil.  Selle  abil on võimalik tuvastada ka ühendeid,  nende molekulmassi,  struktuuri jt. Vahend, mida selleks rakendatakse on massispektromeeter. Massispektroskoopia üldpõhimõte seisneb proovi ioniseerimises, kiirendamises ning massianalüsaatoris sorteeritakse tekkinud ioonid ja nende fragmendid massi järgi, seejärel detekteeritakse detektoris. Tulemus kuvatakse massispektrina. 17. Tuumamagnetresonantsspektroskoopia (NMR) üldpõhimõte NMR   spektroskoopia   ehk   tuumamagnetresonantsspektroskoopia   meetod   uurib   kindlate   aatomite tuumasid, seega NMR on aatomspektroskoopia alamliik. NMR   kasutab   spetsiaalsete   aatomite  tuumade   magnetilisi   omadusi,   et   uurida   aine   struktuuri, identiteeti,   kontsentratsiooni   ja   käitumist.   NMR   kasutab   nende   tuumade   omadusi,   mis   põhjustavad seda,   et  tuumad   neelavad   ning   eraldavad   elektromagnetilist   kiirgust   kindlatel   sagedustel.   Seda tekitatakse läbi tuuma ergastamise raadiosageduse abil. Tuuma relakseerudes registreeritakse eralduv kiirgus, mis põhjustab muutusi magnetväljas. Muutused eralduvas sageduses annavad informatsiooni osakese keskkonna kohta, st kuidas mõjutavad osakest teda ümbritsevad elektronid ning tuumad. Läbi selle on võimalik tuvastada molekulaarset identiteeti, geomeetriat jne. NMR võimaldab mõõta aatomeid, mille spinn ei ole 0. Spinn iseloomustab tuuma asendit magnetväljas. Seega on mõõdetavad tuumad, mille spinnkvantarv on 0,5, nt 1H, 13C, 15N jne. Spinnkvantarvuga 0,


nt  12C ja 16O  ei ole NMR jaoks  aktiivsed.  Seega on NMR rakendatav vaid kindlate  omastustega tuumadele. Tuumade   positiivne   laeng   annab   neile   kindla   spinni,   mis   käitub   kui   väike   magnetväli.   Kui   välist magnetvälja ei rakendata, on tuumade spinni suund juhuslik. Välise magnetvälja rakendamisel, nagu seda   tehakse   ülijuhtiva   magnetiga,   muudavad   tuumad   spinni   suunda   kas   välise   magnetvälja   (B0) suhtes paralleelseks ehk samasuunaliseks või antiparralleelseks ehk vastassuunaliseks. Välise   magnetväljaga   samasuunalise   spinniga   tuumad   on   madalamal   energia   tasemel   ning vastassuunalise spinniga tuumad kõrgemal energia tasemel. Nende energiate erinevus vastab kindlale sagedusele, mille teada saamiseks rakendatakse raadiosagedust. Seadme komponendid: ● mõõtepea, mis sisaldab proovi ning millega proov sisestatakse seadmesse ● proov väikeses silindris ● mähis (traat phmt) ümber proovi, millega rakendatakse raadiosagedust ● ülijuhtivast materjalist magnet mõlemal pool proovi ● vedela heeliumi vann, mis hoiab ülijuhtivat magnetit -269 kraadi juures ● vedela lämmastiku reservuaar, mis on puhver He ja toatemperatuuri vahel Magnetisse paigutatud proovi ümber on mähis, millega rakendatakse raadiosagedust. NMR spektroskoop sisaldab tugevat ülijuhtivat magnetit, mille keskele viiakse uuritav proov.  Uuritav proov võib olla kas vedel või tahke ning pannakse spetsiaalse väikese silindri sisse, mis sisestatakse mõõtepeaga masinasse nii, et proovi sisaldav silinder jääks ülijuhtimagneti keskele.  ● Ülijuhtivus on füüsikaline nähtus, kus madalatel temperatuuridel muutub aine eritakistus nulliks ning magnetväli tõrjutakse välja ehk Meissneri efekt. Ülijuhis   säilib   vool   põhimõtteliselt   energia   kadudeta,   kuna   ülijuhtivas   materjalis   on   aine   eritakistus madalal temperatuuril praktiliselt null. See tähendab, et niikaua kuni magnet NMRis on ülijuhtiv, juhib see elektrone ilma takistuseta ning elektronide tsirkulatsioon tekitab magnetvälja. Selleks, et materjal ülijuhtivust säilitaks, peab seda hoidma pea absoluutse nulli lähedal (täpsemalt 4,2K   ehk   -269*C),   milleks   kasutatakse   vedelat   heeliumit.   Heeliumi   vanni   ümber   on   kiht   vedelat lämmastikku, mis käitub puhvrina äärmiselt külma heeliumi ning toatemperatuuri vahel, milles masinat hoitakse. See aeglustab heeliumi aurustumist ning vähendab "raiskamist". Vedel heelium on väga kallis ning ka haruldane. NMR on üks oluliseimatest orgaaniliste ühendite struktuuri uurimise ja identifitseerimise meetoditest. 18. Kromatograafia – lahutamise põhimõte ja kromatograafia liigid


Kromatograafia on meetod segu üksikute komponentide lahutamiseks. Kromatograafia põhialus: ainete segu komponendid peavad läbi statsionaarse faasi liikuma  erineva kiirusega, sest vaid nii tagatakse segu komponentide lahutumine. Kromatograafiline analüüs toimub kolonnis, mis on täidetud sorbendiga, mis on liikumatuks faasiks, ning sellest voolutatakse läbi liikuvat faasi. ● kandja, millele on kantud liikumatu faas, nt paber, plaat, kolonn jt ● liikumatu faas ehk statsionaarne faas ehk sorbent ● liikuv faas ehk mobiilne faas Jaotuskoefitsent (Rf) on suhe aine läbitud teepikkuse ja eluendi frondi poolt läbitud tee pikkuse vahel kas kolonnis, paberil, plaadil või teisel kandal. Jaotuskoefitsent väljendab individuaalse aine liikuvust. ● jaotuskoefitsent   on   st.tingimustes   konstantne   kindla   aine   ja   voolutisüsteemi   jaoks   ning iseloomustab aine jaotuvust statsionaarse ja liikuva faasi vahel ● jaotuskoefitsendi konstantsuse tagab ühesugune liikuv faas, statsionaarne faas, statsionaarse faasi kihi paksus, uuritava aine kogus, temperatuur. Kromatograafilise analüüsi meetodid põhinevad proovi komponentide  erineval jaotumisel  liikuva ja liikumatu faasi vahel. ● proovi   komponendid   interakteeruvad   liikumatu   faasiga   erinevalt   sõltuvalt   nende jaotuskoefitsendist, seega on liikumatu faas selektiivne proovi komponentide suhtes ● jaotuskoefitsentide erinevuse tõttu on liikumatus faasis pikemalt paremini interakteeruvad osad ning lühemalt halvemini interakteeruvad osad ● liikuva faasi ülesandeks on juhtida proovi komponendid läbi kolonni: ○ LC on liikuv faas eluent ○ GC on liikuv faas gaasi voog Lahutamise põhimõte seisneb seega proovi komponentide erineval liikumiskiirusel läbi kolonni. Kvalitatiivne ja kvantitatiivne analüüs on võimalik, kui kolonni otsa panna detektor, mis kvantitatiivselt reageerib ainete väljumisele kolonnist. Retsensiooniaeg – ajavahemik, mille jooksul on pool proovi kogusest elueeritud. Kromatograafia peamised liigid: ● gaasikromatograafia ● vedelikukromatograafia (planaarkromatograafia, HPLC)


● erivahendeid mittenõudvad kromatograafia liigid, nagu paberkromatograafia ning õhukese kihi kromatograafia 19. Vedelikkromatograafia – lahutamise põhimõte, põhimõisted. Liikuv faas liigub läbi statsionaarse faasi, viies endaga kaasa analüüsitavat proovi läbi statsionaarse faasi. Vedelikkromatograafias on liikuvaks faasiks vedelik, mida nimetatakse eluendiks. LC liigid ● pööratud faasi kromatograafia ● normaalfaasi kromatograafia ● ioonivahetuskromatograafia ● geel-kromatograafia ● afiinsuskromatograafia Planaarkromatograafia – lihtsaim variant vedelikkromatograafiast. ● liikumatu faasi kandja on klaas, metall või sünteetiline materjal ● liikumatu ehk statsionaarne faas on õhukese kihina kandjale kantud materjal (adsorbent, tahke aine, geel, vedelik) või plaadi materjal ise, kromatograafiline paber või plaat ● liikuv ehk mobiilne faas ehk eluent ehk vooluti on vedelik või gaas, mis kannab proovis olevaid aineid   läbi   liikumatu   faasi   ning   liikub   statsionaarse   faasi   suhtes   rõhu,   gravitatsiooni-   või kapillaarjõudude mõjul ● lahutatav proov – ained, mis kanduvad eluendi liikumise mõjul läbi statsionaarse faasi. ● planaarkromatograafia   osad   on  eluent,   kromatograafiline   plaat,   uuritav   segu,   standardained, eluendi front ning stardijoon. ● Eelised: kiire, odav, lihtne ● Puudused: madal lahutuvus, halb korratavus, raske automatiseerida ● Kasutatakse nn esmaseks sõelumiseks. Kromatogramm   –   detektori   signaali   väljendus   analüüsiajana   (minutites)   või   liikuva   faasi   ruumala funktsioonina (ml). ● detektor   muudab   keemilise   signaali   ehk   informatsiooni   proovi   komponendi   kontsentratsiooni väärtuse kohta kolonni lõpus proportsionaalseks elektriliseks signaaliks (vooluks või pingeks), mis teisendatakse graafikuks. ● x-teljel on retsensiooniaeg, y-teljel detektori signaal ● retsensiooniaeg on ajavahemik, mille jooksul elueeritakse pool proovi kogusest ● aine   retsensiooniruumala   (ml)   on   liikuva   faasi   ruumala,   mis   on   vajalik   poole   aine   koguse elueerimiseks kolonnist.


Komponendid,   mis   interakteeruvad   statsionaarse   faasiga   nõrgemalt,   väljuvad   kolonnist   varem. Tugevamalt interakteeruvad komponendid elueeruvad hiljem. Kolonnkromatograafia ● ainete segu kromatograafiliseks lahutamiseks kasutatakse täidiskolonni ● preparatiivse lahutamise meetod ● vedelik liigub kolonnist läbi vedelikusamba raskusjõu toimel ● täidiskolonniks tavaliselt klaastoru, milles on peeneteraline suure eripinnaga tahke täidis ehk liikumatu faas, näiteks adsorbent, geel, sobiva vedelikuga immutatud tahke kandja, ioniit jm ● ainete segu juhitakse läbi kolonni täidise sobiva vedeliku vooluga ehk eluendiga,  milleks on liikuv faas ● sorptsiooni ja desorptsiooni mõjul liiguvad segu komponendid läbi faaside vahel sõltuvalt nende jaotuskoefitsentidest, mis põhjustab proovi komponentide erineva liikumise kiiruse läbi kolonni – komponendid lahutuvad ning tekivad kiiremini ja aeglasemalt liikunud osade tsoonid ● kolonni tuleb pidevalt lisada eluenti ning kolonnist väljuv vedelik kogutakse mitme fraktsioonina ● eraldatud   fraktsioonide   puhtust   hinnatakse   nt   õhukese   kihi   kromatograafiaga, spektrofotomeetriliselt või massispektromeetriga ● kolonni pikkuse suurendamine parendab ainete lahutumist. Kolonnkromatograafias on arendatud ka automatseeritud surve-vedelikukromatograafia süsteemid, mis on   varustatud   rõhu   tõstmise   pumbaga,   pakitud   kolonnidega,   kromatograafilise   detektoriga   ja automaatse fraktsioneerimisseadmega ● madalsurve vedelikukromatograafia (LPLC, kuni 5 atm) ● kesksurve vedelikukromatograafia (MPLC, üle 10 atm) ● kõrgsurve vedelikukromatograafia (HPLC, 400 atm ehk 40 MPa, osakesed 5 µm) ● ultrakõrgsurve VK (UPLC, kuni 1350 atm = 135 MPa, osakesed ≤ 2 µm) HPLC ehitus ● solvendi pudel filtriga ● pump ● solvendi filter ● proovi süstimisventiil ● filter ● eelkolonn ● kolonn ● detektor ● järelrõhuregulaator ● salvestaga ● jääkide anum


Kõrgrõhk on pumbast kolonnini. Madalrõhk on detektorist salvestaja ja jääkideni ning pumbast “väljapoole”. Proovi ettevalmistus: Tahked ained tuleb lahustada sobivad lahustis, parim lahusti on eluent. Kontsentreeritud proovid tuleb eelnevalt lahjendada. Vahel on proove vaja eelnevalt ka puhastada või modifitseerida. Eelkolonnid: lühikesed ja odavad kolonnid, milles on sama liikumatu faas kui vastavas analüütilises (pikas) kolonnis. Eesmärk on kinni püüda ained, mis pöördumatult seonduvad liikumatu faasiga (rikuks kalli kolonni). Kolonni valitakse sõltuvalt proovi omadustest:  ● vees lahustuvaid aineid analüüsitakse pööratud faasi kromatograafia abil ● ioone ioonvahetuskromatograafiaga ● isomeere ja vees lahustumatuid aineid normaalfaasikromatograafiaga. Kolonnid jagunevad ● mikrokolonnideks ● standardkolonnideks ● preparatiivseteks kolonniseks Statsionaarse faasi ehk kolonni täidise tähtsad näitajad: ● osakeste suurus: enamasti 3-20 µm, mida väiksem on osake, seda suurem on efektiivsus, rõhk kolonnis ja lahutuvus, osakeste suurused ei tohiks erineda üle 25%. ● osakeste kuju: sfääriline või ebakorrapärane, mõjutab rõhku kolonnis, ei mõjuta efektiivsust ● poorsus: osakesed kas läbinisti poorsed või kaetud poorse kihiga ehk pellikulaarsed, läbinisti poorsete   osakeste   puhul   on   kolonnide   mahtuvus   suurem,   pellikulaarsete   osakestega   on efektiivsus kõrgem ja kolonnide läbitavus parem. ● pind: kolonni retsensiooni ja selektiivsuse määravad liikumatu faasi funktsionaalrühmad, proovi molekulid   interakteeruvad   funktsionaalrühmadega   vesiniksideme   tekke,   dipool-dipool   ja elektrostaatiliste interaktsioonide kaudu. Kolonnide täidis võib olla looduslik, nt silikageel, või modifitseeritud. Mobiilse faasi ehk eluendi olulised näitajad: ● viskoossus ● keemistemperatuur – madalama keemistemperatuuriga lahustitest on kergem vabaneda ● sobivus detektoriga – näiteks nadal UV-neelduvus UV detektori puhul ● mürgisus


Levinud eluendid on heksaan, diklorometaan, etüülatsetaat, kloroform, atsetonitriil, metanool, atsetoon, vesi. Normaalfaasikromatograafia (ONP, ingl. k organic normal-phase chromatography) ● Statsionaarne faas polaarne: silikageel, millele on keemiliselt külge seotud tsüano-, amino-, diool- funktsionaalrühmad. ● Mobiilne   faas   mittepolaarne:   orgaanilised   lahustid,   nagu   heksaan,   heptaan,   millesse   on lisatud isopropanooli, etüülatsetaati, kloroformmi, atsetonitriili. ● Uuritav objekt: keskmise kuni suure polaarsusega molekulid, mille molekulmass on alla 2000 Da + ühendid, mis ei lahustu vees või lagunevad vees ● Mehhanism:   elueerimine  polaarsuse   kasvu   järgi  –   esmalt   elueeruvad   vähem   polaarsed komponendid, seejärel polaarsemad (orgaanika I meeldetuletus!) ● Mobiilse faasi polaarsuse suurendamine lühendab komponentide elueerimisaega Eelised: isomeeride hea lahutuvus, sobib väga hüdrofiilsete või hüdrofoobsete molekulide jaoks, vees lagunevate proovide korral saab proovi lahustada mittepolaarses lahustis, saab kasutada kõrgemaid voolukiirusi eluendi madala viskoossuse tõttu. Puudused:   kallis,   mürgised   jäägid,   halb   eluendi   tugevuse   kontroll,   eluendil   on   madal keemistemperatuur, mis põhjustab aurustumist ja mulle, kõikumised retsensiooniaegades, raskendatud gradientelueerimine. Pööratud faasi kromatograafia (RP, reversed-phase chromatography) ● Statsionaarse   faas   mittepolaarne:   PMMA   või   silikageel,   millega   on   seotud   kindlad funktsionaalrühmad ● Mobiilne faas polaarne: vesi, lisandiks metanool või atsetonitriil. ● Uuritav   objekt:  madala   kuni   keskmise   polaarsusega   molekulid,   alifaatsete   ja   aromaatsete rühmadega molekulid, molekulmass alla 2000 Da ● Mehhanism:   elueerimine  polaarsuse   kahanemise   järgi  –   esmalt   polaarsed   komponendid, seejärel vähem polaarsed. ● Mobiilse faasi polaarsuse vähendamisega saab komponentide elueerimisaega pikendada. Eelised: rakendatav väga paljudele molekulidele (laetud molekulidest polaarseteni, kasutatakse 75% kromatograafiliste   analüüsidega),   hea   korratavus   ja   kontrollitav   (orgaanika   kontsentratsiooni,   pH, temperatuuri abil), kolonnid on efektiivsed, PMMA kolonnid on stabiilsed ka väga madala pH juures, odavam, robustne Puudused:   ei   sobi   väga   polaarsete   molekulide   lahutamiseks,   ei   saa   kasutada   valkudega,   sest orgaaniline solvent põhjustab denaturatsiooni, ei saa lahutada isomeere.


Ioonvahetuskromatograafia (IEC) ● Statsionaarne   faas   polümeer:   divinüülstüreen,   millega   on   elektrostaatiliselt   seotud sulfoneeritud või amineeritud polümeerikile ● Mobiilseks faasiks puhverlahused: anioonkromatograafia – nõrga happe soolalahused, nagu salitsülaat, boorat, KOH; katioonlahused – HCl lahus ● Objektid:  anorgaanilised   ioonid  (peamiselt   anioonid,   nt   F-,   Cl-,   SO42-)   ja  biomolekulid,   nagu aminohapped, peptiidid, valgud, nukleiinhapped. ● Sagedased detektorid on elektrijuhtivuse detektor ja UV-detektor ● Supressorkolonn: H+-vorm: K+ vahetatakse H+ vastu välja: enne lahuses KF, KCl, K2SO4, pärast H+-vorm supressorkolonni lahuses HF, HCl, H2SO4. Anioonkromatograafia:   anioonid   seonduvad   (katioonvahetus)kolonni   täidisega,   sest  statsionaarse faasi pind on positiivse laenguga H+-vormis. Supressoris vahetatakse eluendi katioon H+-iooni vastu välja ning tekib nõrk hape, mida juhtivusdetektor ei registreeri. Katioonkromatograafia:   katioonid   seonduvad   (anioonvahetus)kolonni   täidisega,   sest  statsionaarse faasi pind on negatiivse laenguga OH--vormis. Supressoris vahetatakse eluendi (nt HCl) anioon välja OH-aniooni vastu, tekib vesi, mida ei saa detekteerida. Eksklusioonikromatograafia: ● molekulide lahutamiseks suuruse ja molekulmassi alusel ● statsionaarne faas poorsetest materjalidest, nagu silikageel, poorne klaas jms, mille pooridesse jäävad kinni väiksemad molekulid ● elueerumine molekuli mõõtmete järgi: kõigepealt suured molekulid, seejärel väiksemad ning siis nendest väiksemad jne ● süsteemi   peab   enne   kalibreerima   standardainega.   Tihti   on   tegemist   kallite polümeerstandarditega, nagu dekstraanid, pullulaanid, valgud jt. ● proov lahustatakse eluendis reeglina. LC detektorid Detektori   ülesandeks   on   produtseerida   elektriline   signaal,   mis   oleks   proportsionaalne   proovi kontsentratsiooniga. ● UV-VIS fotomeetrid ● fluorestsents ● infrapuna ● elektrokeemiline ● refrakomeetriline ● elektrijuhtivus


● mass-spektromeetriline jt Mitteselektiivsed: mõõdetakse eluendi omaduse muutust ajas, nt murdumisnäitajat või elektrijuhtivust. Selektiivsed: mõõdetakse analüüdi omadusi, nagu neelduvus, fluorestsents, massi-laengu suhe jt. Kontsentratsioon-selektriivne: signaal võrdeline proovi kontsentratsiooniga eluendis. Mass-selektiivne: signaal on võrdeline proovi molekulide arvuga ajaühikus (g/s). 20. Gaasikromatograafia üldpõhimõte, lahutamise põhimõte. Gaasikromatograafias on liikuvaks faasiks gaas ning statsionaarseks faasiks tahke aine või vedelik. Lahutatavad ained jaotuvad kandegaasi ja statsionaarse faasi vahel. Gaasikromatograafia jaguneb: ● gaasi-adsorptsioonkromatograafia (poorne täidis liikumatuks faasiks) ● gaasi-vedelikukromatograafia (poorne täidis vaid kandjaks liikumatule faasile) Seadme   komponendid:   kandegaas,   voolu   registraator,   proovi   sisestaja,   kolonn,   kolonni   termostaat, detektor. Saadakse kromatogramm. Kandegaasina ehk liikuva faasina kasutatakse inertgaase. Kasutatav kandekaas peab olema: ● keemiliselt inertne – need ei tohi reageerida analüüsitavate ainete ega statsionaarse faasiga ● kõrge puhtusaste  –  ei tohi sisaldava vett ega hapnikku, mis võivad lagundada statsionaarse faasi, põhjustada kolonni lekkimist ning lõpuks täielikku rikkumist ● ühilduv   kasutatava   detektoriga  –   näiteks   kui   kasutatakse   MS,   peab   kandegaas   olema heelium ● ökonoomsed ● ohutud ● efektiivsed Levinuimad kandegaasid on H2, N2 ja He. GC-s pumpasid ei ole vaja, kuna gaasi vool läbi süsteemi on kindlustatud gaasi silindri  liigrõhu tõttu. Voolu konstantseks hoidmiseks kasutatakse kahekäigulisi klappe, keerulisemate analüüside puhul koos vooluregulaatoriga. Kolonnid GC kasutatakse täidiskolonne ja kapillaarkolonne. ● Täidiskolonnid sisediameetriga 2...4 mm, 1...6 m pikad ning täidetud poorse materjaliga


● Sõltuvalt  sellest, kas poorne täidis on statsionaarseks faasiks või vaid kandjaks, eristatakse gaas-adsorptsioonkromatograafiat ja gaas-vedelikkromatograafiat ○ gaas-adsorptsioonkromatograafias on poorne täidis statsionaarseks faasiks ○ gaas-vedelikkromatograafias on poorne täidis vaid kandjaks statsionaarsele faasile ● Kapillaarkolonnide   sisediameeter   0,1...0,5   mm,   pikkus   5...100   m,   materjalina   kasutatakse polüimiidiga kaetud kvartskapillaari (Si). ● Statsionaarse   faasina   kasutatav   vedelikukile   kantakse   0,1...5   µm   paksuse   kihina   kapillaari siseseinale. Statsionaarne faas peab GC-s täitma kahe tingimust: ● võimaldama eristada segu komponente ● olema termiliselt stabiilne. Polümeersed   ühendid   on  termiliselt   stabiilsemad,  eriti  siloksaanid.  Statsionaarse   faasi   selektiivsuse muutmiseks   peab   seda   modifitseerima,   nt   CH3-rühmaga   (annab   mittepolaarse   polümeeri)   või tsüaanopropüülrühmadega (annavad väga polaarse polümeeri). GC detektorid GC-s kasutatakse peamiselt 2 tüüpi universaalseid detektoreid: ● leekionisatsioondetektor ● soojusjuhtivusdetektor Viimasel ajal üha rohkem ka MS-d kui detektoreid. Leekionisatsioondetektoreid (FID) ● Põhineb vesiniku leegi elektrijuhtivuse muutumisel elektriväljas, kui orgaanilised ained läbi selle leegi kantakse.  ● Orgaanilised ained lagundatakse ja ioniseeritakse leegis, tekib CHO+ katioon. ● Ioonide voog registreeritakse pingelanguna vastuvõtval elektroodil. ● Detektor reageerib süsinikuaatomite arvule ajaühikus ning seega on signaal proportsionaalne määratava aine massiga ning liikuva faasi voolukiirus mõjutab detektori signaali vähe. ● Detekteerimispiir väga madal, lineaarne mõõtmispiirkond lai. ● Puuduseks   ainete   lagundamine   detektorist   läbiminekul   ning   sobimatus   teatud   aineklasside puhul. Soojusjuhtivusdetektor (TCD) ● Mõõdetakse kandegaaside (He, H2) soojusjuhtivust katse ajal. ● Analüüdi juuresolekul kandegaasi soojusjuhtivus langeb, kuna gaaside soojusjuhtivus on 6...10 korda suurem kui orgaaniliste ainete soojusjuhtivus. ● Soojusjuhtivusdetektorid   on   mittespetsiifilised   –   neid   saab   kasutada   nii   orgaaniliste   kui anorgaaniliste ainete kontsentratsioonide mõõtmiseks.


● Teine pluss TCD puhul on see, et need ei lagunda aineid. ● Puuduseks on kõrge detekteerimispiir ja kitsas lineaarne mõõtmispiirkond. Detektori   signaal   peab   sõltuma   lineaarsest   ainekogusest,   mis   täidab   antud   hetkel   detektorit   ehk lineaarne mõõtmispiirkond. 21. Kapillaarelektroforees   ja   kapillaarelektrokromatograafia.   Mille   poolest erinevad, lahutamise põhimõte.  Elektroforees on elektriliselt laetud osakeste (ioonide) liikumine vedelikus elektrivälja mõjul: positiivsed osakesed liiguvad katoodile(-) ja negatiivsed anoodile(+). ● võib toimuda nii vedelikus kui geelis, aga ka vedelikuga immutatud tahkises. Kataforees – osakesed liiguvad elektriväljas katoodile. Anaforees – osakesed liiguvad elektriväljas anoodile. Eralduspõhimõte – laeng ja suurus. Kasutamine – analüütiline (bio)keemia (DNA, valgud), elektrokeemia (pinnakatted). Kapillaar(tsoon)elektroforees ehk C(Z)E – kapillaaris on puhvri vesilahus, mis võimaldab ioone ja laetud molekule lahutada. ● detektsioon UV-VIS, fluorestsents, MS Kapillaarelektrokromatograafia   CEC   –   kombinatsioon   HPLC   selektiivsusest   ja  kapillaarelektroforeesi kõrgest resolutsioonist ja efektiivsusest. Lahutab osakesti nende massi-laengu suhte põhjal. CEC   ja   CE   erinevus   seisneb   selles,   et   CEC   puhul   esineb   seina   küljes  statsionaarne   faas. Statsionaarse faasi olemasolek teeb CEC-st kromatograafia ning kapillaarile rakendatud elektriväli ning osakeste elektroforeetiline lahutamine CE. EOF ehk elektroendosmoos on nähtus, mille korral vedelik liigub rakendatud pinge mõjul kapillaaris. Põhjustatud kvartstoru kapillaari sisepinnal olevatest OH-rühmadest, mis sobiva pH korral kaotavad prootoni ning kapillaari sisepind omandab negatiivse laengu. Pinge rakendamisel hakkavad puhvris olevad prootonid liikuma katoodi(-) poole ning tõmbavad kaasa kogu puhvri, mistõttu liigub puhver nö anoodile katoodile. ● põhjustab järgmise väljumise järjekorra: katioonid, neutraalsed, anioonid. ● anioonid liiguvad tegelikult “vastassuunas”, seega on nende kiirus väikseim. EOF sõltub:


● puhvri pH-st ● rakendatud elektrokeemilisest potentsiaalist