Karotenoidid lipiidid Tamm (0)

Martin Tamm (121006YASB)
Biokeemia   praktikum  (töö nr. 2.2 ja 1.3)
                                                          YKL0060 Biokeemia
Laboratoorne töö 
Töö pealkiri: Karotenoidide identifitseerimine ja sisalduse 
nr. 2.2
määramine
Õpperühm: 
Töö  teostaja : Martin Tamm / 121006YASB
YASB21
Juhendajad:  assistent  Ti na  Randla  ja doktorant  Kaia  Kukk
1
Martin Tamm (121006YASB)
Biokeemia praktikum (töö nr. 2.2 ja 1.3)
Karotenoidid    on   ühendid   mida   klassifitseeritakse   ehitusepoolest   kui   tetraterpenoidid   (40 
süsinikku sisaldavad ühendid). Karotenoidid on polüeensed  ahelad , mille ühes või mõlemas 
otsas   on   reeglina   6-liikmelised   ionoontsüklid.   Karotenoide   grupeeritakse   kahte   rühma: 
karoteenid  (ühendid mis sisaldavad ainult süsinikku ja vesinikku) ja ksantofüllid (ühendid mis 
sisaldavad ka hapnikku süsiniku ja vesiniku kõrvalt). 
Karotenoidid täidavad mitu erinevat ja tähtsaid ülesandeid taimedes: valguse absorbeerimine 
( neeldumine )   ja   valguse   ülekanne   klorofüllidele,   valguse   liigne   neeldumine,   rakkude 
kaitsmine fotokahjustuste eest ja hapnikuradikaalide eest. 
Loomsetel organismidel on üks tähtis  vitamiin  mis vastutab nägemisprotsessi eest: vitamiin A 
ehk retinaal. Retinaal  tekib kahest karoteenist  ja ühest krüptoksantiinist  ensüüm   karoteen  
oksügenaasi abil. 
α-karoteen + γ-karoteen + β-krüptoksantiin * retinaal
* - karoteen oksügenaas 
Retinaali   funktsioonideks   on   nägemisprotsessi  tagamine   ja   käitumine   antioksüdandina. 
Samuti   kaitseb   retinaal   silmi   kahjuliku   UV   kiirguste   eest   ja   käitub   regulaatorina   raku 
diferentseerumisel ja kasvamisel.  Loomsed  organismid ise karotenoide ei suuda sünteesida 
siis nendel tuleb neid hankida toidu seest. Karotenoidid on struktuuriliselt polüeenid ja mis 
tähendab,   et   nad   on   vees   lahustamatud   ja   piiratud   lahustuvusega   teatud   solventides   kuid 
karotenoidid   lahustuvad   hästi   orgaanilistes   solventides.   Karotenoidid   on   värvilised   mis 
Joonis 1. Karotenoidide ja 
klorofül ide neeldumisspektrid. 
(al  ikas : Biokeemia praktikumide 
juhend lk 60)
2
Martin Tamm (121006YASB)
Biokeemia praktikum (töö nr. 2.2 ja 1.3)
tähendab, et nad absorbeerivad valgust. Nende spektrid piirduvad 400-700  nanomeetri  juures. 
Kui proovis on rohkem kui üks spetsiifiline karotenoid, siis neeldumisspektrid muutuvad. 
Töö käik
Töö   käik   koosneb   kahest   osast:   karotenoidide    isoleerimine    ja   neeldusspektri   võtmine   ja 
analüüs.
Karotenoidide isoleerimine
Vajalikud   töö   vahendid:   uhmer ,   nui,   tehniline   kaal,   väike   kaaluklaas,   riiv,   50   ml 
mõõtesilinder, lehter, kuiv filterpaber ,  lusikas
Vajalikud ained: tükk  porgandit  (0,5-2,0 g), Na2SO4, liiva, heptaani
1. Võtta tükk porgandit, ja riivida 0,5-0,6 grammi väiksesse kaaluklaasi.
2. Kvantitatiivselt üle viia riivitud  porgand  uhmrisse ja lisada natukene liiva. 
3. Uhmri nuiaga hõõruda segu ühtlaseks massiks. 
4. Lisada Na2SO4  soola samal ajal segades massi kuni lõpuks on vesi seotud ja mass näeb 
välja kuiv (valge  tekstuur  ja peenikesed terakesed). 
5. Võtta uhmer pulbriga tõmbekapi alla ja alustada ekstraheerimist heptaaniga. Alguses lisada 
umbes 10 ml heptaani ja läbi segada.
6. Valmis seada mõõtesilinder  ja lehter mille  sees on filterpaber.  Alustada ekstrahendi ja 
karotenoidide segu filtrimist  mõõtesilindrisse kasutades lusikat. 
3
Martin Tamm (121006YASB)
Biokeemia praktikum (töö nr. 2.2 ja 1.3)
7. Jätkata ekstraheerimist ja filtrimist kuni sademe kohal olev ekstrahent on värvusetu. 
8. Alustada spektrivõtmist. 
Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs
Alustatakse   spektri   võtmist   kasutades   spektrofotomeetriat.   Spektrofotomeetria   näitab   aine 
kontsentratsiooni mis on väljendatud optilise tiheduse kaudu. Karotenoidide  neeldumisspekter  
jääb lainepikkuste 350-650 nm vahele ja võrdluslahuseks on orgaaniline solvent mida kasutati 
ekstraheerimiseks. Ekstraheeritud karotenoide pannakse klaasküvetti kuna neeldumisspektrit 
mõõdetakse nähtava valguse piirkonnas. 
1. Võtta klaasküvett ja panna heptaani küvetti. Heptaan on võrdlemislahuseks. 
2. Mõõta ekstraheeritud karotenoidide segu neeldumisspektrit. 
3. Kirjutada ära iseloomulikud neeldumisspektrite maksimaalsed väärtused ja nende optilised 
tihedused  (teoreetiliselt peaks kolm erinevat neeldumisspektrit olema ja kolm erinevat  optilist  
tihedust ). 
4. Välja trükkida neeldumisspekter ja analüüsida. 
Karotenoidi sisalduse arvutamine (kvantitatiivne analüüs)
Uuritavad lahuses oleva  karoteeni  isomeeri sisalduse määramist saab ära arvutada kasutades 
järgnevat valemit:
K = (A * V * d * 103) / (E 1%
1cm
 * g)    kus,
A – absorptiooni väärus, mis vastab arvutuse  aluseks valitud neeldumismaksimumile.
E 1%
1cm
 - vaadeldava karotenoidi ekstinktsioonikoefitsient.
V- ekstrakti  kogumaht
d – kasutatud ekstrahendi tihedus, g/cm3
g – uurimiseks võetud taimse materjali mass, g.
103 – tegur milligramidele üleminekuks. 
Arvutatud tulemust võrrelda  teoreetilise  tulemusega ja analüüsida töö õnnestumust. 
Andmed
m(porgand) = 0,51 g
V(ekstrakt) = 28 ml
4
Martin Tamm (121006YASB)
Biokeemia praktikum (töö nr. 2.2 ja 1.3)
Tabel 1. Neeldumismaksimumid  ja optilised tihedused saadud lahusest
Neeldumismaksimum (nm)
Optiline tihedus (ABS)
477,0 
0,1932
451,5
0, 2214
427,0
0, 1641
Tabel 2. Ligilähedased abipigmendid uuritavas lahuses
Luteiin
β-karoteen
Krüptoksantiin
Zeaksantiin
α-karoteen
Neeldumismaksimumid  42
44
47
42
45
48
42
45
48
42
45
48
42
44
475
(nm)
0
7
7
5
1
2
5
1
3
3
1
3
0
5
Kuna   porgandis   ei   ole   ainult   üks   abipigment,   siis   pidin    otsima    ka   teisi   abipigmendi 
neeldumismaksimume mis on ligilähedased saadud neeldumismaksumil.  
5
Martin Tamm (121006YASB)
Biokeemia praktikum (töö nr. 2.2 ja 1.3)
Joonis 1. Porgandist tehtud neeldumisspekter
Nagu näha neeldumisspektri graafikust, siis kaks täiesti eristatavad neeldumismaksimumi  ja 
kolmas peaaegu  eristatav  neeldumismaksimum on olemas. 
Karotenoidi sisalduse arvutamine proovis: 
K = (A * V * d * 103) / (E 1%
1cm
 * g)
K = (0,2214*28* 0.6837*103) / ( 2650 *0,51) = 3,14 mg%
Kirjanduse   alusel   on   β-karoteen   domineeriv   karoteeni    isomeer    porgandis,   mis   annab   ka 
porgandile iseloomustava oranži värvi. 
Analüüs ja kokkuvõte
Kuna porgandis  domineerib  β-karoteen siis see annab porgandile iseloomuliku oranžika värvi. 
Heptaaniga   ekstraheerimisel   lahus   muutus   helekollaseks.   Kirjanduse   alusel   leidsin,   et 
porgandis sisaldub ka muid abipigmente mis muutis katsetulemust ja neeldumisnihet. 
Karotenoidide  protsendiline  sisaldus oli mul 3,14mg%. Ühik milligrammi protsendis (mg%) 
on   1000   korda   väiksem   kui   protsent   (%).   Kui   võtta   100   grammi   porgandit,   siis   saan 
karotenoidide sisalduse kokku 3,14mg. Internetis olevate andmete põhjal leidsin, et umbes 69 
–  70%   porgandis   sisalduvatest   karotenoididest   on   β-karoteen.   Karotenoidide   sisaldus   100 
grammis  porgandis kõigub 6 kuni 54 mg vahel mis on suurem kui minu saadud tulemus (3,14 
6
Martin Tamm (121006YASB)
Biokeemia praktikum (töö nr. 2.2 ja 1.3)
mg). Β-karoteeni õnnestus kätte saada mis oli näha kollakast lahusest ekstaheerimisel kuid 
mitte   nii   palju   kui   kirjanduses   kirjas   on,   ehk   siis   kõike.   Vigu   võis   olla   mitu:   ebatäpne 
ekstraheerimine, vähene peenestamine.
7
Martin Tamm (121006YASB)
Biokeemia praktikum (töö nr. 2.2 ja 1.3)
                                                          YKL0060 Biokeemia
Laboratoorne töö 
Töö pealkiri: Lipi dide reaktsioonid
nr. 1.3
Õpperühm: 
Töö teostaja: Martin Tamm / 121006YASB
YASB21
Juhendajad: assistent Ti na Randla ja doktorant Kaia Kukk
8
Martin Tamm (121006YASB)
Biokeemia praktikum (töö nr. 2.2 ja 1.3)
Lipiidid  on ühendid mille molekulide keemilist ehitust iseloomustab enamasti estersidemete 
esinemist .    Lipiidid    ei   lahustu   polaarsetes   lahustites   (vesi,   etanool   jne)   kuid   lahustuvad 
apolaarsetes lahustites ( benseen , heptaan,  tetraklorometaan  ja teised). Lipiididel on oluline 
bioloogiline   roll   elusorganismides   just   struktuurse,   suure   energiamahu   ja  signaalide   tõttu. 
Lipiide  jaotatakse järgnevalt:
Rasvhapped 
Rasvad  
Glütserofosfolipiidid
Sfingolipiidid
Vahad
Steroidid
Terpenoidid
Rasvad on keemiliselt ehituselt glütserüülestrid. Rasvhapped on pikad hüdrofoobse  sabaga  
molekulid   mille   otsas   on   hüdrofiilne   „peake“   ja    vesikeskkonnas    moodustab   mitselle. 
Steroidide ehitusaluseks on steraanituum mille kolmanda süsiniku küljes on hüdroksüülrühm. 
9
Martin Tamm (121006YASB)
Biokeemia praktikum (töö nr. 2.2 ja 1.3)
Töö käik
Töö käike on kokku neli, kus  seletatakse   ära mis töö tehakse,   kemism   (kui võimalik)  ja 
näidatakse ära tulemused. 
1.3.1 Rasvapleki  proov
Rasvapleki proovi katses kasutatakse orgaanilist  lahustit  (atsetoon), et ära määrata kas tahkes 
aines on rasva või mitte. Kasutatakse filterpaberit, kuhu peale pannakse läbi lahustatud kaks 
proovi kus kus ühes on rasva ja teises ei ole. 
1. Võtta kaks filterpaberit, kaks katseklaasi. 
2. Katseklaasidesse panna 1 g vastavad tahket ainet (proov 1 ja proov 2). 
3. Lisada 0,5 ml orgaanilist solventi ja loksutatakse hoolikalt. 
4. Tahke materjali  settimise  jaoks lastakse 5 minutit katseklaasidel olla. 
5.   Filterpaberile   panna   klaaspulgaga   mõlemast   katseklaasist   üks   tilk   ja   oodata   kuni 
filterpaberil olev „täpike“ ära kuivab. 
6. Ära määrata kummas tundmatus tahkes aines oli rasva ja kummas mitte. 
Järeldus:  Esimeses proovis oli rasva sees ja seda oli näha sellega, et kui vaatada valguse 
poole läbi paberfiltri, siis täpike oli natukene läbipaistev. Teisel filterpaberil seda ei olnud. 
1.3.2 Emulsioonitest
Emulsioonid on üks liik kahe- või enamafaasilisetest süsteemidest, mida tuntakse kolloidide 
nime   all.   Emulsioonid   hajavad   läbivat   valgust,   siis    emulsiooni    moodustumisest   annab 
informatsiooni   selge   lahuse   muutumine   häguseks.   Rasvade   ja   rasvhapete   iseloomulikuks 
tunnuseks   on   hüdrofoobsus   polaarsetes   keskkondades.   Kuid   lahustuvad   orgaanilistes 
solventides. Kui solvendis valmistada lahus  lipiididest , ja siis panna polaarsesse keskkonda, 
tekib õli-vees tüüpo emulsioon . 
1. Võtta kaks katseklaasi, kaks korki, 4 ml 96%-list etanooli, 2 ml uuritavat lahust (kokku 4 
ml). 
2. Panna uuritavad  lahused  katseklaasidesse ja lisada 2 ml  96%-list etanooli kummagisse 
katseklaasi ja panna korgid peale.
3. Loksutada  intensiivselt lahuse moodustumiseni. 
4. Mõlemasse katseklaasi lisatakse 4 ml destilleeritud vett, et tekitada polaarne keskkond. 
5. Loksutada taas intensiivselt ja oodata natukene.
6. Järeldatakse kumma proovis on lipiide sees lähtudes emulsiooni  tekkest . 
10
Martin Tamm (121006YASB)
Biokeemia praktikum (töö nr. 2.2 ja 1.3)
Järeldus: Esimeses katseklaasis ei tekkinud lipiide kuna lahus ei muutunud häguseks pärast 
destilleeritud   vee   lisamist   ja   intensiivset   loksutamist.   Teises   katseklaasis   tekkis   hägune 
keskkond sisse mis tähendab, et emulsiooni keskkond tekkis katseklaasi ja lipiide on sees mis 
moodustasid õli-vees emulsiooni. 
1.3.4 Küllastumata rasvhapete  tuvastamine  lipiidides
Küllastumata   rasvhapete   tuvastamine   toimub   halogeniseerimisel   ehk    reaktsioon  
halogeenidega.   Tuntuimad   halogeenid   millega   oleks   võimalik   küllastumata    rasvhappeid  
tuvastada on  jood  ja broom. Kui küllastumata  rasvhape  reageerib halogeeniga siis kaksikside 
katkeb ja tekib kaks sidet kahe halogeeniga ja seda on silmaga näha kui värv katseklaasis 
valastub.  Broomi  iseloomulik värvus on pruun. 
1. Võtta kolm katseklaasi ja sisse valada 2 ml erineva lipiidi lahust orgaanilises solvendis: 
rasvhappe ( palmithape ), loomne  rasv ( searasv ) ja taimnerasv (oliiviõli). 
2. Lisada tilkhaaval võrdne kogus broomi lahust kloroformis ehk triklorometaanis. 
3. Loksutatakse ettevaatlikult ja vaadeltakse tulemusi. 
Tulemused
Palmithape – broomi iseloomulik värvus ei kadunud mis tähendab seda, et  kaksiksidemeid  ei 
ole ja rasvhape on alguses peale küllastunud.
Searasv – Broomi iseloomulik värvus  kadus  mis tähendab seda, et searasvas on küllastumata 
rasvhappeid.
Oliiviõli – broomi iseloomulik värvus kadus mis tähendab seda, et oliiviõlis on küllastumata 
rasvhappeid.
Järeldus:  Kahes proovis kolmest  sisaldas  küllastumata  rasvhappeid  mis  oli  ära näidadud 
broomi iseloomuliku värvuse valastumise kaudu. 
1.3.5 Liebermann -Burchard kolesterooli määramise test
Kolesterooli reageerimisel äädikhappe anhüdriidiga väävelhappe keskkonnas moodustub tume 
sinakas -rohelise värvusega reaktsioonisegu. Kuna tegemist on mitmeastmelise reaktsiooniga 
siis värvus võib varieeruda kuna on kindlaks tehtud, et  kolesterool  reageerimisel happelises 
keskkonnas äädikhappe anhüdriidiga annab veel erinevaid produkte. 
11
Martin Tamm (121006YASB)
Biokeemia praktikum (töö nr. 2.2 ja 1.3)
1. Kolmesse puhtasse katseklaasi valatakse 2 ml kolesterooli lahust, oliiviõli lahust, searasva 
lahust. 
2. Lisatakse 6-7 tilka äädikhappe anhüdriidi ja 4-5 tilka väävelhapet happelise keskkonna 
tekkimiseks.
3. Loksutatakse hoolikalt ja jälgitakse katseklaasides toimuvaid muutusi.
Tulemused
Kolesterool – tekkis tumesinine lahust mis näitab ära kolesterooli olemasolu lahuses.
Oliivõli – tekkis  kollakas  värvus. 
Searasv – värvus ei muutunud.
Järeldus:  kolesterooliga   tekkis   tumesinikas   värvus   katseklaasi   mis   tähendab   seda,   et 
kolestrool    reageeris   äädikhappe   anhüdriidiga   hästi   happelises   keskkonnas.   Oliiviõli   ka 
reageeris äädikhappe anhüdriidiga tekitades kollakat värvus katseklaasis olevasse lahusesse. 
Searasvaga   ei   juhtunud   midagi   mis   näitab   ära   seda,   et   õiget   reaktsioonitsentrit   ei   olnud 
millega äädikhappe anhüdriid oleks  reageerinud . 
12