Tallinna Tehnikaülikool Immunoloogia Praktikum Õppejõud: Lilian Järvekülg Õpilane: Agnes Kivistik 112483YAGB42 Tallinn 2012 SDS-PAGE ELEKTROFOREES Meetod võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulaarmassi järgi ja annab liigikaudse hinnangu valgu kontsentratsioonist. Valgud jooksevad geelis „+“ poole, kuna nad on kaetud SDS-ga, mis annab neile „-„laengu. Liikumine geelis toimub lahuses oleva OH - rühma tõttu. Geelile kanname mitte ainult uuritavad valgud, vaid ka markeri. Marker- valkude segu, mis on kindla suurusega. Töö käik: 1. Geeli valmistamine: Lahutav geel (alumine Kontsentreeriv geel geel), (Ülemine geel) , 4% 10%
Tallinna Tehnikaülikool IMMUNOLOOGIA Praktikum Õppejõud: Lilian Järvekülg Õpilane: YAGB41 Tallinn 2012 SDS-PAGE ELEKTROFOREES · Meetod võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulaarmassi järgi ja annab liigikaudse hinnangu valgu kontsentratsioonist. · Valgud jooksevad geelis ,,+" poole, kuna nad on kaetud SDS-ga, mis annab neile ,,- ,, laengu. Liikumine geelis toimub lahuses oleva OH- rühma tõttu. · Geelile kanname mitte ainult uuritavad valgud, vaid ka markeri, mis on kindla suurusega valkude segu (selle järgi teeme hiljem kindlaks enda uuritud valgu suuruse, kD). Töö käik: 1. Geeli valmistamine: Lahutav geel (alumine geel), Kontsentreeriv geel (ülemine
didesoksünukleotiide, mille üks aatom ole radioaktiivne. Kui DNA molekulid läksid ööda geeli (vt. elektroforees meetod), siis saadud geelist tehti röntgen pildi. Ja seal oli näha neid redioaktiivseid nukleotiide.Kuna teatakse, ku sasub kindla nukleotiidida lõppev DNA lõik, loetakse manuaalselt matrits-DNA järjestuse. Automaatsekvenerimisel listakse igasse katseklaasi mitte radioaktiivne nukleotiid, vaid nukleotiid, millel on fosforistentne märk. Ja geelis on spetsiaalne auk laseri jaoks. Nüüd kui toimub elektroforees laser paneb floristentsida molekuli ja molekulid ergastuvad teatud lainepikkusega kiirguse, mida vastu võtab detektor. Arvuti programm, mis on ühendatud detektoriga, loeb lainepikkuse järgi DNA nukleotiidset järjestust.
Õpilane: YAGB-42 Tallinn 2012 SDS-PAGE ELEKTROFOREES · Meetod võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulaarmassi järgi ja annab liigikaudse hinnangu valgu kontsentratsioonist. · Valgud jooksevad geelis ,,+" poole, kuna nad on kaetud SDS-ga, mis annab neile ,,- ,,laengu. Liikumine geelis toimub lahuses oleva OH- rühma tõttu. · Geelile kanname mitte ainult uuritavad valgud, vaid ka markeri. Marker- valkude segu, mis on kindla suurusega. Töö käik: 1. Geeli valmistamine: Lahutav geel (alumine geel), Kontsentreeriv geel (Ülemine 10% geel) , 4%
Jälgida, et mulle ei tekiks ja eemaldada need. Millise % geeli valasime? Miks? Vaatasime lk 32 olemat tabelit nr. 6 ja otsustasime teha 1,5% geeli. Tabel näitab, et see geel sobib DNA’le pikkuses 0,2-3kb ja see on igati sobilik kõigi grupis olevate inimeste DNA lahutamiseks, kuna meie DNA’de pikkused jäid vahemikku 0,3-1,6kb. Mis juhtub kui unustame EtBr lisada? Kas olukorda saaks parandada? Kui me ei lisaks EtBr, siis me ei näeks enda DNA bande pärast geelis. Olukorra parandamiseks võib geeli EtBr’is solgutada. Oluline on, et geel oleks homogeenne ning et EtBr oleks ühtlaselt geelis jaotunud. 5 Kui oleks vaja valada 0,75% geel 80ml TAE puhvrist, mitu g agaroosi oleks tarvis võtta? Kui palju tuleks lisada EtBr kui alg- ja lõppkontsentratsioon on samad praktikumis kasutatutega? Lahusti: 80 ml Agaroosi on vaja: 80 x 0,75/100 = 0,6g EtBr algkontsentratsioon : 10mg/ml=10µg/µl EtBr
Elektriväljas lahutunud uuritava segu bändi(väiksed liiguvad kiiresti,suured ei) imutatakse värvimisega. Värvained seonduvad üskne lahutunud komponentidega. PAGE kasutakse kui väga detailse proteinogrammi saamiseks 13. vereseerumi vproteinogrammi saamise võimalused. Tänu R-gruppi valke lahutakse happeliste ja aluseliste alusel. Geeli viiakse polüamfolüütide segu ja lühiajalise elektrivälja rakendamisega tekitatakse geelis püsiv pH-gradient. Kandatke valkude Ag segu ja elektrivoolu toimel liiguvad valgud pH gradiendi kohani, kus nende pI võrdub vastava pHga geelis. Valgud jagunevad pI alusel vööditeks. Saab ka leida tundmatu valgu pI. 14.Vereplasma albumiini ja globuliinide biofuktsioon Puhrifunktsioon- amfolüütid(pH säälitamine) Transport- hidrofiilsedd ja lipidofiilsed Kolloidosmootne rõhku säilitamine Kaitsegunktsioon (nt immuuglobuliinid) Ensümaatiline roll( reniin)
Resttriktsiooniensüümid tunnevad ära konkreetsed kohad ja lõikavad DNA molekuli vaid sealt -Käärid. Lõikamismuster võimaldab võrrelda kahte taime ja leida ühisosasid või mutatsioone. PCR- polümeraasi ahelreaktsioon, võimaldab luua ühest DNA fragmendist tuhandeid koopiaid. (Kary Mullis). Geelelektroforees- Võimaldab eraldada DNA molekule suuruse järgi DNA on negatiivse laenguga ja seega liigub positiivse elektroodi poole. Mida suurem on DNA fragment, seda aeglasemalt see liigub geelis. Etiidium bromiid geelis võimaldab DNA värvida silmale nähtavaks (UV valguse all) Southern blot- Edwin Southern Testib, kas sisestatud geen on terve ja ühes tükis, õiges suunas ja koopia arvu. DNA kodeeriva järjestuse alusel disainitakse proo, millega hübridiseeritakse transgeense taime DNA-d filterpaberil. Proovil on küljes radioaktiivne signaal, mis näitab tulemust. Northern blot- testib, kas mRNA on taimes olemas ja et transkriptsioon toimib korrektselt. mRNA
o müoglobiin (6mg/ml) o 2,4-dinitrofenüülaspartaat (0,6mg/ml) · kolonni täidise pinnal olev eluent lastakse välja · kolonni voolukiirus reguleeritakse piiridesse 0,7 1,0 ml/min · kui vedeliku tase langeb täidise pinnani, suletakse kolonni väljavooluava · kolonni pipeteeritakse 0,5 ml uuritavat proovi, lastes proovil geelile mõne millimeetri kõrguselt tilkuda nii, et proov jaotuks geelis ühtlaselt · avatakse väljalaskeava ja jälgitakse, et eluenti oleks alati geeli kohal kui proov on täielikult geeli sisenenud, hakatakse juurde lisama eluenti, alguses väiksemate kogustena jälgides, et geel ei jääks kuivaks · kuni kolonni allaossa jõuab dekstraansinine, väljub kolonnist puhas vooluti, mis kogutakse ühendatud fraktsioonina kuiva 100 ml kolbi · ühendatud fraktsioon 16,75 ml
Tulemused ja nende intepreteerimine A. Täidis SpatelG75 Pundumis tegur 0,1 Täidise kõrgus 22,2 ja sisediameeter 1,8 Arvutatud täidise kogumaht 56,46 Arvutatud maksimaalne elueerimismaht 50,89 Arvutuslik fraktsioonide üldarv 25 B. C. Graafikult on näha kolme tõusu ja langust, mis näitavad, et aine konts. kolonnist väljumisel tõuseb, saavutab haripunkti ja langeb, kuni lõpuks on kogu aine kolonnist väljunud. Ained jagunesid geelis vastavalt molaarmassile. Dekstraansinine, mille molaarmass on tunduvalt suurem, kui müoglobiinil ja DNP-Aspartaadil, väljus kolonnist esimesena. Kolmandana elueerus DNA-Aspartaat, mille molekulid on piisavalt väikesed, et täielikult geeli pooridesse siseneda ning on seetõttu maksimaalse elueerimismahuga. D. E.Rf= Vx-Vxmin/Vxmax-Vxmin=
Kui vedeliku tase langeb täidise pinnani, suletan kolonni väljavooluava . Uuritav segu: 1.segu: Dekstraansinine (sinine), müüoglobiin (punane), DNP-aspartaat (kollane). Proovi sisestamine: Doseerimiseks kasutan automaatpipetti mahuga 0,5 ml. Viin 0,5 ml uuritavad segu kolonni vastu seina. Proov voolab geeli pinnale ühtlaselt. Avan kolonni väljavooluava ja kui uuritav segu on geeli sees lisan 2 ml eluenti.Kui kogu eluent on geeli sees ,lisan veel eluendi. Geelis olev proov moodustab sinist ja kollast kihti(punane oli nähtav ainult siis,kui kogusin katseklaasi. Kolonni voolutamine: Kolonnist tuleb puhas vooluti, mida kogun mõõtsilidrisse. Kokku tuli 20 ml ühendatud fraktsiooni. Kui tuli sinine riba asendasin mõõtsilinder katseklaasiga ja hakkasin koguma fraktsioonid. Kokku tuli 42 fraktsiooni. Fraktsioonide analüüsimine: Analüüsin saadud fraktsioonide absortsiooni tihedused spetrofotomeetril. Dekstraansinine
Katseklaasis peavad olema DNA polümeraas (ensüüm), matriits DNA, nukleotiide ((dATP, dCTP, dGTP, dDTP)= dNTP). Kujutame, et neljas katseklaasis segame kokku sama lahuse. Oletame, et paneme esimesse natukene näiteks didesoksüATP'd. Sünteesuvad lühemad ahelad, millede lõppu me teame antud juhul A. //Elektroforees. Geel on klaaside vahel, geeli peale võime proove kanda, näiteks DNA'd. Pannes geeli elektrivälja, siis teatud (omades laengut) juhul võivad molekulid läbi geelis olevate pooride teise elektroodi poole. Kõik nukleiinhapped hakkavad läbi geeli seega elektroodi poole liikuma. Kui proovis on erinevaid nukleiinhappemolekule, siis pikema ahelaga molekulid liiguvad aeglasemalt kui lühemad. Nii saame ahelaid üksteisest eraldad sõltuvalt nende suurusest//. Sandler pani katseklaasides sünteesitud ahelad geelile ja lahutas nad. (mingi radade jama). POLÜMERAASI AHELREAKTSIOON - PCR 12/11/09
34 107 0,074 35 109 0,027 36 111 0,015 37 113 0,01 38 115 0 Kogu eluaadi maht: 33+238=109 (ml) Graafikult on näha kolme tõusu ja langust, mis näitavad, et aine konts. kolonnist väljumisel tõuseb, saavutab haripunkti ja langeb, kuni kogu aine on kolonnist väljunud. Ained jagunesid geelis vastavalt molaarmassile. Dekstraansinine, mille molaarmass oli suurim, väljus kolonnist esimesena. Tema elueerumismaht on minimaalne. Kolmandana elueerus DNP- aspartaat, mille molekulid olid lahuses väikseimad ning difundeerusid täielikult geeli pooridesse. Seetõttu on DNP-Aspartaat maksimaalse elueerimismahuga. Müoglobiin väljus kohe pärast dekstraansinist, st tema molekulmass on dektraansinisest veidi väiksem.
Mutageen!) Kui geel on piisavalt jahtunud, valasime geeli alusele (konstrollisime, et alus asetsetus horisontaalselt), tegime augu hammastega ning panime üleöö tarduma. 3.1 Praktikum – DNA lahutamine geelis Visualiseerime ona PCRi produkti selleks, et kontrollida, kas reaktsioon toimus nii, kui oli oodetud (mitte inhibeeritud, kas kõik komponendid oli lisatud õigesti, kas programm oli koostatud ilma veata jne). Selleks lisasime PCR segule 4 µl 6xDNA värvi, et DNA ilusti hambasse vajuks ja tema migreerumisteekond oleks nähtav. Kandsin kogu segu TAE geelile ja jäätsime geelis lahutama 15min jooksul konstantse pinge all (100V). DNA lahutamine toimub geelis tänu tema fosfaat-selgroo
kui geel on tehtud vette, siis Tris puhver tõmbab geelist vee välja. Tagab stabiilse pH. Oluline, sest DNA/RNA laeng sõltub keskkonna pH-st. 13, Miks kasutatakse laadimispuhvrit ja mis on see tavaliselt? DNA proovide kandmisks geelile kasutatakse laadimispuhvrit, mis sisaldab glütserooli. Proov vajub kaevukese põhja. 13. Miks sisaldab puhver ka etiidiumbromiidi? Selleks, et hiljem visualiseerida DNA froees UV-valguses (254 nm). 14. Mis suunas liiguvad geelis molekulid? Liiguvad agaroosgeelis elektrivälja rakendamisel katoodilt anoodile (+). 15. Kui sul on kaks E.colit, mida teed, et teada saada kas RecA on olemas? 1) PCR 2) UV-ga kiiritad UV-ga kiiritad. Kui RecA on olemas, siis aktiveerib see RecA proteolüütilist stimuleeriva fn-i. RecA aktiveerib LexA autokatalüütilise proteolüüsi ja LexA vabastab enda kontrolli alt olevad SOS reparatsioonigeenid. LexA on repressor ja
· Eukarüootidel regulaatorvalkudeks TF transkriptsioonifaktorid · TF seostub cis-actingutega trans-acting Induktor repressoriga seostuja Attenuatsioon lisakontroll, fine-tuning, toimub translatsiooni tasemel Analüüsimeetodid võõrDNA jälgimiseks: · Hübridiseerimine: (kindla NA järjestuse tuvastamine NA molekulide segust kasutades komplementaarsusel põhinevat üksikahelate paardumist) o Geelis lahutatud DNA/RNA kantakse üle (nailon) membraanile nii , et nad oleksid üksikahelad. o Meid huvitav järjestus märgistatakse radioaktiivselt vm meetodil o Lastakse üksikahelatel omavahel paarduda o Mittepaardunud proov pestakse maha ja NA asukoht tuvastatakse märgise järgi · Sekveneerimine järjestuse määramine
Elektroonikas kontaktide katteks. Elektronmikroskoopias kaetakse uuritavad objektid elektrijuhtivuse tagamiseks õhukese kullakilega. 3 mm paksune rubiinklaasi ("Bullseye") klaasitükk. Klaasile annavad punase värvuse kolloidse kulla osakesed. Rubiinklaasi osati valmistada juba antiikajal. Vahepeal tema valmistamise meetod unustati, leiutati aga uuesti 1679. a. Johann Kunckel von Löwensterni poolt, kes sulatas klaasimassi nn. Cassiuse purpurit (kullakolloid tina(IV)hüdroksiid geelis). Rubiinklaasi värvuse mikroskoopiliseks põhjuseks on nn. pinnaplasmonid - kulla juhtivuselektronide "gaasi" võnkumised osakeste pindkihis. Pinnaplasmonite sagedus sõltub tugevalt kullaosakeste suurusest ja ilmneb kullakolloidide spektrites karakteerse neeldumiribana piirkonnas 500 ... 600 nm. Kiri "23K" ütleb, et tegemist on kullaga, milles muid metalle sisaldub 1/24 osa (puhast kulda 23/24). Teisisõnu on tegemist kullaga, mille proov on 960 (sisaldab 96% puhast kulda)
geneetilist muutlikkust. Selleks, et määrata geneetilise muutlikkuse osa kogu muutlikkuses, analüüsitakse juhuslikult valitud geenide alleelset varieeruvust. Mutatsioonid konkreetses geenis ning sellest tulenevad muudatused polüpeptiidi aminohappelises järjestuses on tuvastatavad mutantsete polüpeptiidide erineva liikuvuse kaudu geelelektroforeesil. Uuritavate polüpeptiidide asukoht geelis tuvastatakse kas nendele polüpeptiididele iseloomulike ensüümreaktsioonide teel (juhul, kui reaktsiooni tulemusena tekib geelis eristatav värviline produkt) või uuritavate polüpeptiidide vastaste antikehade abil. Ka inimese ensüümide puhul on kirjeldatud ulatuslik polümorfism. Näiteks 24-st oksüdoreduktaaside lookusest on 7 polümorfsed, transferaaside 29-st lookusest aga 10 (vt. Tabel 28.2). Valkude analüüs geelelektroforeesil ei võimalda tuvastada kõiki mutatsioone
koos iseloomuliku pesade morfoloogiaga anda kiiresti esmase mikrobioloogilise diagnoosi. Difteeria tekitaja ei lõhusta uureat. TOKSIGEENSUSE MÄÄRAMINE. Ainult need C. diphtheriae tüved, mis toodavad eksotoksiini, põhjustavad haigust. Isoleeritud tüve toksigeensuse määramiseks on võimalik kasutada katseloomi (merisiga), koekultuuri või siis PCR otseselt tox geeni detekteerimiseks. Levinum on in vitro Elek’i test e pretsipitat- sioonireaktsioon geelis (vt.õpik, I osa). Seerumagarile asetatakse filterpaberi riba (disk), mis on immutatud difteeriavastase antitoksilise seerumi e antitoksiini või selleks ette nähtud spetsiaalse seerumpreparaadiga. Kahele poole filterpaberi riba külvatakse vaheldumisi C. diphtheriae toksigeenne tüvi PW-8 (kontroll) ja uuritavad tüved. Kontrolltüve ja toksigeensete uuritavate tüvede poolt produtseeritud eksotoksiinid ja
MIS ON HEPARIIN? Hepariin on looduslik antikoagulant, mis takistab vere hüübimist. Antikoagulant muudab vere vedelamaks ja takistab nii verehüübe muutumist veelgi suuremaks. Samuti takistavad nad hüübest tükikeste või kogu hüübe lahti pääsemist oma asukohast ja liikumist verega mujale organismi (embolismi). Veenilaiendite raviks kasutatakse hepariini sisaldavaid geele. Hepariini sisaldus peab olema geelis vähemalt 300 ühikut grammi kohta. Geel määritakse haigetele kohtadele ning ta vähendab valu ja kiirendab veenipõletiku paranemist, soodustab ka juba tekkinud hüübe imendumist. Hepariini kasutatakse ka süvaveenitromboosi (SVT) raviks. Sellisel juhul süstitakse ravim veenikaudu. RAVIMTAIMED JA ALTERNATIIVSED VÕMALUSED VEENILAIENDITE OHJAMISEL. Veresoonkonda tugevdavates taimsetes ravimites on toimeaineks sageli bioflavonoidid, mis
molekulidega?. Nt. eksonukleaasne aktiivsus, peptidaasne aktiivsus? Geelfiltratsioon Ioonvahetuskromatograafia Afiinsuskromatograafia SDS geelelektroforees – geelelektroforees naatrium dodetsüül sulfaadiga (Sodium Dodecyl Sulfate); SDS annab valkudele tugeva negatiivse laengu, mistõttu on elektroforeesil võimalik eristada valke vaid nende massi järgi. Tavalisel geelelektroforeesil eristuvad valgu massi ja laengu järgi – mida väiksem mass ja suurem laeng, seda kiiremini liiguvad geelis. Isoelektriline fokuseerimine – elektroforeesi geeli on moodustatud pH gradient; sellel geelil liiguvad valgud seni, kuni on jõudnud sellise pH-ga geeli ossa, mis vastab nende isoelektrilisele puntkile (pI) e. kui valgu summaarne laeng muutub nulliks ja kui laeng on null ei ole võimalik enam elektriväljas edasi liikuda. α – heeliks – valgu helikaalne sekundaarstruktuur, mida stabiliseerivad keskteljega
Selle kontsi juures moodustuvad pindaktiivse aine molekulid mitselle. Hüdrofoobne saba on orienteeritud mitselli tsentrisse, negatiivne ioonrühm - väljaspoole. Tekkiv mitsell on negatiivselt laetud. Lahutamise käigus jaotuvad analüüdi neutraalsed molekulid mitsellide ja puhvri vahel. 43. Kapillaargeelektroforeesi põhimõte Kasutatakse DNA ja RNA fragmentide lahutamiseks. Fragmendid saadakse lõigates DNA ja RNA spetsiifiliste ensüümidega. Lahutamine toimub geelis, milles on kapillaarid. Fragmendid märgistatakse fluorestseeruvate rühmadega; ergastatakse kasutades LED lampi; emissiooni registreerib CCD kaamera. 44.Elektrokeemiline rakk Elektrokeemia - analüütiline meetod, kus kasutatakse analüüdi kontsi määramiseks või analüüdi keemilise reakttiivsuse määramiseks potensiaali, laengu või voolu mõõtmist. 45.Elektrokeemilise raku potentsiaal Elektrokeemilise rakku iseloomustavaks parameetriks on elektromotoorjõud.
tuvastamisel ja mikroobide tüpiseerimisel. 43. Elektrofrees Elektroforees on elektriliselt laetud osakeste liikumine vedelikus elektrivälja mõjul: positiivsed osakesed katoodile ja negatiivsed osakesed anoodile. Elektroforees on meetod, kus laetud osakesed liiguvad elektrijuhtivust omavas vedelas keskkonnas elektrivälja mõjul. Geel-elektroforees - DNA kaksikahel liigub geelis elektriväljas kiirusega, mis on pöördvõrdeline log10–ga tema massist (suurusest). 44. Nukleiinhapete hüdrediseerimine Kindla NA järjestuse tuvastamine NA molekulide segust kasutates komplementaarsusel põhinevat üksikahelate paardumist. - Geelis lahutatud DNA/RNA kantakse üle (nailon)membraanile, nii et nad oleksid üksikahelad - Meid huvitav järjestus märgistatakse radioaktiivselt vm meetodil (proov)
allpool) abil. Sel moel on võimalik teha indiviiditi kindlaks, kas vaadeldud piirkonnas esineb indiviidide vahel erinevusi. Mõnel juhul on neil väikestel erinevustel väga suur mõju konkreetse indiviidi fenotüübile. Näiteks on võimalik tuvastada inimese vastuvõtlikkust HIV-ile (ühele tüvele), kuidas inimene tunneb viiendat põhimaitset – umamit, sugulusastet jne. 138. DNA - geelelektroforeesi põhimõtted Geelelektroforeesil pannakse DNA fragmendid liikuma elektriväljas poorses geelis. DNA proovid sisestatakse geeli ühte serva ja geel asetatakse elektrit juhtiva vedeliku sisse (sama puhverlahus, millega algselt geel valmistati). Selliselt valmistatud süsteemis on nii geel kui seda ümbritsev lahus sarnase elektrijuhtivusega (mõlemates on samad lahustunud soolade ioonid sisuliselt samas kontsentratsioonis). Kui nüüd sellisest süsteemist juhtida läbi elektrivool (nimetatakse ka geeli voolutamiseks), hakkab DNA liikuma läbi geeli + laenguga elektroodi poole
Hüdrofoobsuskromatograafia vastavalt valkude hüdrofoobsusele. Geelfiltratsioon-kromatograafia vastavalt valgumolekuli suurusele. Afiinsuskromatograafia vastavalt interaktsioonidele. 3. Elektroforees, SDS-PAGE põhimõte, isoelektriline fokuseerimine, 2D elektroforees, valgu sõrmejälg (protein fingerprinting). Elektroforees kujutab endast laetud molekulide liikumist elektriväljas. Valkude elektroforees viiakse läbi pooltahkes keskkonnas geelis. SDS-PAGE valgud denatureeritakse ja ,,laetakse" SDS molekulidega (SDS'l on negatiivne laeng ja on võimeline katma suvalisi valgu molekule. Valgu pinnale tekib tugev negatiivse laenguga kate. SDS molekule on kattes nii palju, et valgule endale iseloomulik laeng tähtsust enam ei oma), sellisel juhul sõltub liikumiskiirus vaid molekuli suurusest. Isoelektriliseks fokuseerimiseks (IEF) nim valkude lahutamist elektriväljas vastavalt nende isoelektrilisele punktile
4) Vigastatud kohta tuleks hoida kõrgemal keha tasapinnast. See pärsib vere juurdevoolu vigastatud piirkonda, aidates sellega vähendada turse ja verevalumi ulatust. Loetletud toiminguid tuleks käsutada 48 tunni jooksul pärast õnnetust ja teha seda iga kolme kuni nelja tunni järel. SALVID JA GEELID KA VIGASTUSE ENNETAMISEKS Salvidest või geelidest võiks selle aja jooksul kasutada Deep Free-ze Cold-geeli või Deep Freeze- aerosooli, mida müüakse apteekides retseptita. Aerosoolis ja geelis sisalduvad toimeained põhjustavad külma aistingu ning valu vähenemise. Geeli tuleks kasutada kaks kuni kolm korda päevas ja masseerida õrnalt naha sisse. Lisaks võib kasutada veel Lioton-geeli, Troxevasin-salvi, Yellon-geeli, Ginker-geeli. Nimetatud ravimid on samuti saadaval retseptita. ..Kui turse on alanenud, tuleks kasutada põletikuvastaseid salve või geele. Tavaliselt alustatakse nendega kolmandal kuni neljandal päeval pärast vigastust
Selle käigus süstitakse ainete segu kromatograafilisse kolonni, edasi kantakse see läbi sorbendi (liikumatu faas) sobiva vedeliku või gaasi vooluga (liikuv faas). Toimub segu komponentide jaotumine, sest need liiguvad edasi erineva kiirusega. Moodustuvad kiiremini ja aeglasemalt liikunud komponentide tsoonid ning ained saab üksteisest eraldada. Protsess teostatakse kas kolonnis, kapillaaris, paberil või plaadil. 49. Elektroforees on lahustunud osakeste erinev liikumine vedelikus või geelis elektrivälja mõjul ja nende lahutamine üksteisest, sõltuvalt ühendi laengust. Positivse laenguga osakesed liiguvad katoodile ja negatiivse laenguga osakesed anoodile. Kasutatakse näiteks valkude ja DNA analüüsil. 50. Nukleiinhapete hübridiseerimine. In situ hübridisatsiooni põhimõte on fikseeritud koetükis märgistatud nukleiinhappe (DNA või RNA) ahela kinnitamine komplementaarse DNA või RNA ahela külge. Esmalt kuumutatakse, seejärel
b) hüdrofoobsuskromatograafia- vastavalt valkude hüdrofoobsusele c) geelfiltratsioon-kromatograafia-vastavalt valgumolekuli suurusele d) afiinsuskromatograafia-vastavalt valkude interaktsioonidele 3. Elektroforees, SDS-PAGE põhimõte, isoelektriline fokuseerimine, 2D elektroforees, valgu sõrmejälg Elektroforees- laetud molekulide liikumine elektriväljas, viiakse läbi pooltahkes keskkonnas – geelis e) SDS-PAGE – geelelektrofereesi meetod, kasutatakse ioonset detergenti SDS (sodium dodecylsulfate). Valgud denatureeritakse ja „laetakse“ SDS molekulidega (SDS’l on negatiivne laeng ja on võimeline katma suvalisi valgu molekule. Valgu pinnale tekib tugev negatiivse laenguga kate. SDS molekule on kattes nii palju, et valgule endale iseloomulik laeng tähtsust enam ei oma), sellisel juhul sõltub liikumiskiirus vaid molekuli suurusest.
sondide meetodit geneetiliste haiguste uurimisel, viirusinfektsioonide tuvastamisel ja mikroobide tüpiseerimisel. 44. Elektroforees – selle kohta ka Pata slaidides Elektroforees on elektriliselt laetud osakeste liikumine vedelikus elektrivälja mõjul: positiivsed osakesed katoodile ja negatiivsed osakesed anoodile. Elektroforees on meetod, kus laetud osakesed liiguvad elektrijuhtivust omavas vedelas keskkonnas elektrivälja mõjul. Geel-elektroforees - DNA kaksikahel liigub geelis elektriväljas kiirusega, mis on pöördvõrdeline log 10– ga tema massist (suurusest). 1. maatriks on agaroos või polüakrüülamiid 2. puhver tagab, et DNA on laetud negatiivselt 3. DNA liigub suunas - + (katoodilt anoodile). 45. Nukleiinhapete hübridiseerimine Kindla NA järjestuse tuvastamine NA molekulide segust kasutates komplementaarsusel põhinevat üksikahelate paardumist.
sondide meetodit geneetiliste haiguste uurimisel, viirusinfektsioonide tuvastamisel ja mikroobide tüpiseerimisel. 44. Elektroforees selle kohta ka Pata slaidides Elektroforees on elektriliselt laetud osakeste liikumine vedelikus elektrivälja mõjul: positiivsed osakesed katoodile ja negatiivsed osakesed anoodile. Elektroforees on meetod, kus laetud osakesed liiguvad elektrijuhtivust omavas vedelas keskkonnas elektrivälja mõjul. Geel-elektroforees - DNA kaksikahel liigub geelis elektriväljas kiirusega, mis on pöördvõrdeline log 10 ga tema massist (suurusest). 1. maatriks on agaroos või polüakrüülamiid 2. puhver tagab, et DNA on laetud negatiivselt 3. DNA liigub suunas - + (katoodilt anoodile). 45. Nukleiinhapete hübridiseerimine Kindla NA järjestuse tuvastamine NA molekulide segust kasutates komplementaarsusel põhinevat üksikahelate paardumist.
fosfataasi ACP varianti, mida määravad kolm alleeli ACPA, ACPB ja ACPC. Nende kolme alleeli kombineerumise tulemusena võivad tekkida kuus erinevat genotüüpi. Aluselise fosfataasi A, B ja C vormid on funktsionaalselt sarnased, kuid erinevad oma liikuvuselt geelelektroforeesil, sest nende aminohappelises järjestuses on erinevusi. Kuue erineva genotüübi puhul on valkude elektroforeetiline pilt erinev. Kõigi kolme homosügootse variandi puhul on geelis elektroforeetiliselt tuvastatavad kaks erinevat, igale tüübile spetsiifilist valgubändi, sest samal polüpeptiidil on kaks konformatsiooni, mis liiguvad geelis erinevalt. Iga erineva genotüübi puhul on ACP aktiivsus erinev, püsides teatavas väärtuste vahemikus. Erinevate genotüüpide korral need väärtused osaliselt kattuvad. Analüüsides ACP aktiivsust kogu populatsioonis saame pideva kõvera, mis näitabki, et selle tunnuse fenotüübiline muutlikkus populatsioonis on pidev. 8.2
· Millised tingimused on vajalikud loomarakkude kasvatamiseks kultuuris, miks nad peavad olema just sellised? Loomsed rakud vajavad rikastatud söödet: essentsiaalsed aminohapped (Lys, His, Leu, Ile, Met, Phe, Thr, Trp, Val; Cys, Glu, Tyr), Kasvufaktoreid, Vitamiine, Seerumit,(Kinnitus maatriksit (ECM kinnituseks) koosneb kollageenist, hüaluroon happest ja teistest ECM valkudest). Osad võivad kasvada ka 3D geelis ja suspensioonis. · Mida nimetatakse transfektsiooniks, milliseid alternatiivseid meetodeid saab kasutada? Transfektsioon on võõra DNA viimine rakku. Keemilised meetodid. Kaltsiumfosfaadi meetod, DEAE dekstraan Füüsikalised meetodid. Mikroinjektsioon ja elektroporatsioon Membraanide fusioonid. Liposoomid, katioonsed lipiidid ja DNA kompleks lipofektsioon (DNA) konstrukti sisestamine viiruste abil. DNA viirused= näit. SV 40 (simian virus)
minna, vaid süntees jääb selle koha peal pidama. Sekveneeritav DNA pannakse reaktsioonianumasse tavaliste desoksüribonukleotiididega ja sünteesitud didesoksüribonukleotiididega. Reaktsioonid viiakse läbi iga lämmastikalust sisaldava nukleotiidiga eraldi: igas eri anumas on sama tähega lõppevad lõigud. Järjestuse paika panemiseks viiakse läbi geel-elektroforees. Kõik tekkinud DNA lõigud on erineva pikkusega ja see mõjutab nende liikumist geelis: lühemad lõigud liiguvad kaugemale, pikemad lähemale. Kuna on teada, millise tähega iga eri pikkusega lõik lõppeb, siis saab teada, kus milline täht sekveneeritavas DNAs paikneb. Järgmise põlvkonna sekveneerimismeetodid. Järgmise põlvkonna sekveneerimistehnoloogia pidi lahendama kõik Sangeri meetodil esinevad probleemid nagu nt kõrge hind ja suhteliselt vähese informatsiooni saamine. Seda iseloomustavad platvormid, mis toodavad miljoneid lühikesi DNA järjestusi.
Väga kiire, väga täpne, väga kallis. Üldiselt kasutatakse teadaolevate mutatsioonide leidmiseks. SSCP punktmutatsioonide tuvastamiseks (90% 1 nukleotiidi vahetustest leiab üles). 1- ahelaline geenifragment amplifitseeritakse, denatureeritakse, kantakse mittedenatureerivale polüakrüülamiidgeelile, kus ta paardub iseendaga, võttes ühe neljast võimalikust kõige vähem energiat nõudvast konformatsioonist. Erineva konformatsiooni tõttu liiguvad liiguvad jupid geelis erinevalt kõige rohkem pakitud versioon kõige kiiremini. Heterodupleks test segad kontrollDNA paljude teistega kokku, kuumutad ja paned geelile. Ahelad hübridiseeruvad, mittesobivuse korral tekib ahelasse mull (mutatsioonide korral). Mulliga liiguvad tavaliselt aeglasemalt ja on geelis ootamatute kohtade peal. RFLP ensümaatilisel restriktsioonil põhinev polümorfismide analüüs. Esinevad polümorfismid, mis tekitavad või kaotavad restriktsioonisaite
radioaktiivne. Kui DNA molekulid läksid ööda geeli (vt. elektroforees meetod), siis saadud geelist tehti röntgen pildi. Ja seal oli näha neid redioaktiivseid nukleotiide.Kuna teatakse, ku sasub kindla nukleotiidida lõppev DNA lõik, loetakse manuaalselt matrits-DNA järjestuse. Automaatsekvenerimisel listakse igasse katseklaasi mitte radioaktiivne nukleotiid, vaid nukleotiid, millel on fosforistentne märk. Ja geelis on spetsiaalne auk laseri jaoks. Nüüd kui toimub elektroforees laser paneb floristentsida molekuli ja molekulid ergastuvad teatud lainepikkusega kiirguse, mida vastu võtab detektor. Arvuti programm, mis on ühendatud detektoriga, loeb lainepikkuse järgi DNA nukleotiidset järjestust. 45. Polümeraasi ahelreaktsioon vt. konspekt (12.11) PCR viiakse läbi biokeemilise reaktsioonina ja selle puhul ei vajata elusorganisme DNA kopeerimiseks. Reaktsioon
aktiivsus puudub? gusA geen on defektne. 16. Miks peab PCR-il kasutama kahte praimerit? DNA-l on kaks ahelat. 17. Miks peab PCR-il kasutama termostabiilset DNA polümeraasi? DNA denatureeritakse 94-98 kraadi juures. Tavaline polümeraas denatureerub. 18. Miks valmistatakse elektroforeesi puhul geel puhvris, mitte tavalises vees? pH stabiilsuse tagamiseks, PCR toimub ainult kindlal pH-l. 19. Kuidas eristada DNA-fragmente geelelektroforeesil? Molekulid tuleb geelis nähtavaks tuua. Agaroosi kasutatakse maatriksina. 20. Miks voolutatakse geelelektroforeesil paralleelselt reeglina ka suurusmarkerit? Suurusmarker koosneb kindlaksmääratud suurusega molekulide segust, saab määrata meie proovi molekuli suurust. 21. Millise vea oled teinud, kui elektroforeesi ajal proovide liikumist tähistav marker liigub vales suunas? Klemmid valet pidi. 7. teema 1. Mida mõistetakse bakterite kasvu all?
terminaatornukleotiidi(ddNTP), millest on igaüks märggitud erineva flourestseeruva märgisega. Selle tulemusena tekivad DNA fragmendid, mis algavad kõik samast kohast, kuid nende süntees on termineerunud erinevatest kohtadest. Sünteesitud DNA fragmendid lahutatakse polüakrüülamiidgeeli. Geelelektroforeesi tingimused on sellised, et sünteesitud DNA fragmendid eristuvad geelist üksteisest ühenukleotiidse täpsusega. Mida ühem onfragment, seda kiiremini liigub ta geelis. See võimaldab DNA fragmentide mustrist lugeda välja DNA lõigu nukleotiidset järjestust. 46. Polümeraasi ahelreaktsioon. PRC meetod võimaldab spetsiifiliselt amplifitseerida(saada DNA paljundamisel koopiaid) suvalist DNA järjestust. PRC rakendamiseks on vaja teada amplifitseeritavast DNAst primaarjärjestust paljundatava DNA piirkonna mõlemast otsast.PRC toimub kolmeetapiliselt: 1. Amlifitseeritava DNA denatureerimine emperatuuri toimel (92-95 kraadi juures) 2
Elektrivälja toimel amfolüütide lahusele hakkavad summaarset positiivset laengut kandvad molekulid liikuma katoodile (katioonid liiguvad katoodile) ja negatiivset kogulaengut kandvad molekulid liiguvad anoodi suunas (anioonid liiguvad anoodile). Isoelektrilises punktis on molekulide keskmine laeng null ja seetõttu nad elektriväljas ei liigu. Kuna elektroforees viiakse läbi pH gradiendis siis liiguvad amfolüüdid, seni kuni satuvad geelis kohta, kus pH = pI ja sellest punktist nad edasi ei liigu. Lisaks pI määramisele saab isoelektrilise fokuseerimise abil lahutada ka erinevaid amfolüüte nende segudest. Mõned makromolekulid sisaldavad suurel hulgal kas ainult positiivseid või ainult negatiivseid laenguid. Selliseid molekule nimetatakse polüelektrolüütideks. Tugevad 10
Kromatograafiat kasutatakse, et eraldada segunenud ained üksteisest. Siinkohal siis on vaja valgud eemaldada lahusest e rakuekstraktist. Ioonvahetuskromatograafia, õhukese kihi kromatograafia, pöördfaaskromatograafia, geelfiltratsioonkromatograafia. Geelelektroforeesi põhimõte – lahutamine poorses keskkonnas elektrivälja toimel. Kasutatavad polüakrüülamiid geel ja agaroos. Isoelektriline fokuseerimine. Biomolekulide detekteerimise meetodid geelis. Geel värvitakse valgu spetsiifilise värviga/spets antikehad. 11. Nukleotiidid Nukleiinhapped on biomakromolekulid, milles nukleotiidijäägid on seostunud fosfodiestersidemega. Inimkehas on kaks nukleiinhapet – DNA ja RNA. Nukleotiidid on nukleiinhapete monomeerid, rakus esinevad anioonidena, on happed. Nukleotiid koosneb lämmastikalusest (N-alustest, pentoosist ja ühest või enamast fosfaatrühmast: • N-aluseks on puriin voi pürimidiin
Ioonvahetuskromatograafia (laeng), õhukese kihi kromatograafia, pöördfaaskromatograafia, geelfiltratsioonkromatograafia (valkude sadestumine suuruse järgi. Geelelektroforeesi põhimõte lahutamine poorses keskkonnas elektrivälja toimel. (1 aine liigub teiste suhtes, liikuma panev jõud- elekter). Kasutatavad polüakrüülamiid geel ja agaroos. Isoelektriline fokuseerimine. Biomolekulide detekteerimise meetodid geelis. Geel värvitakse valgu spetsiifilise värviga/spets antikehad. Geeli sisu peab olema aluseline, kõik valgud aluselises KK on neg. laenguga- ioonid liiguvad 11. Nukleotiidid Nukleiinhapped on biomakromolekulid, milles nukleotiidijäägid on seostunud fosfodiestersidemega. Inimkehas on kaks nukleiinhapet DNA ja RNA. Nukleotiid koosneb lämmastikalusest (N-alustest, pentoosist ja ühest või enamast fosfaatrühmast: · N-aluseks on puriin voi pürimidiin
PCR- on kôrvaletôrjumas DNA sondide meetodit geneetiliste haiguste uurimisel, viirusinfektsioonide tuvastamisel ja mikroobide tüpiseerimisel. 40. Elektroforees Elektroforees on elektriliselt laetud osakeste liikumine vedelikus elektrivälja mõjul: positiivsed osakesed katoodile ja negatiivsed osakesed anoodile. Elektroforees on meetod, kus laetud osakesed liiguvad elektrijuhtivust omavas vedelas keskkonnas elektrivälja mõjul. Geel-elektroforees - DNA kaksikahel liigub geelis elektriväljas kiirusega, mis on pöördvõrdeline log 10 ga tema massist (suurusest). 1. maatriks on agaroos või polüakrüülamiid 2. puhver tagab, et DNA on laetud negatiivselt 3. DNA liigub suunas - + (katoodilt anoodile). 40. Nukleiinhapete hübridiseerimine NH hübridiseerimine pôhineb denatureerunud DNA ja RNA renatureerumise fenomenil, mis seisneb selles, et teatud tingimustel denatureeritud NH ahelad on vôimelised uuesti renatureeruma ja
paljundada uuritavad DNA-d. Põhineb: termostabiilne DNA polümeraas; komplementaarsed praimerid meid huvitavale järjestusele; tsükleerimine (ahelate lahtisulatamine 95o 20 s; praimerite paardumine 50-650 20 s; ahelate sünteesimine 72o 1 min; seda kokku 30-40 korda). 43.Elektroforees. 44.Nukleiinhapete hübridiseerimine. Kindla NA järjestuse tuvastamine NA molekulide segust kasutades komplementaarsusel põhinevat üksikahelate paardumist. 1) geelis lahutatud DNA/RNA kantakse üle (nailon)membraanile, nii et nad oleksid üksikahelad. 2) meid huvitav järjestus märgistatakse radioaktiivselt või muul meetodil. 3) lastakse üksikahelatel omavahel paarduda. 4)mitteseostunud proov pestakse maha ja NA asukoht tuvastatakse märgiste järgi. Kromatograafia. Segu lahustatakse vedelikus - nn ‘’mobiilne faas’’, mis voolutatakse (flow) läbi nn ‘’statsionaarse faasi’’
polüakrüülamiidgeele aga väikeste DNA lõikude ja valkude puhul. Polüakrüülamiidgeelis on nukleiinhappel laengu esinemise tõttu väikseimaks erustuvaks üksuseks üks nukleotiid, polüpeptiidahelal aga umbes 10 aminohapet. Agaroosgeeli värvimisel etiidiumbromiidiga läheb see interkaleeruv värvaine DNA kaksikheeliksi nukleotiidide vahele ning DNA fragmente UV valgusega valgustades on need geelis nähtavad roosade helendavate triipudena. 50. Nukleiinhapete hübridiseerimine. In situ koloonia- ja faagilaikude hübriidimine on teiseks käsitlusviisiks rekombinantse DNA selektsioonil. Kolooniahübridiseerimise meetodit kasutatakse peale plasmiidide ka kosmiididega konstrueeritud klonoteekide puhul. Faagilaikude hübriidimist kasutatakse aga faag lambda põhjal konstrueeritud genoteekide puhul. Mõlemad hübridiseerimismeetodid on väga sarnased. Koloonia hübridiseerimisel
PCR- on kôrvaletôrjumas DNA sondide meetodit geneetiliste haiguste uurimisel, viirusinfektsioonide tuvastamisel ja mikroobide tüpiseerimisel. 40. Elektroforees Elektroforees on elektriliselt laetud osakeste liikumine vedelikus elektrivälja mõjul: positiivsed osakesed katoodile ja negatiivsed osakesed anoodile. Elektroforees on meetod, kus laetud osakesed liiguvad elektrijuhtivust omavas vedelas keskkonnas elektrivälja mõjul. Geel-elektroforees - DNA kaksikahel liigub geelis elektriväljas kiirusega, mis on pöördvõrdeline log 10 ga tema massist (suurusest). 1. maatriks on agaroos või polüakrüülamiid 2. puhver tagab, et DNA on laetud negatiivselt 3. DNA liigub suunas - + (katoodilt anoodile). 40. Nukleiinhapete hübridiseerimine NH hübridiseerimine pôhineb denatureerunud DNA ja RNA renatureerumise fenomenil, mis seisneb selles, et teatud tingimustel denatureeritud NH ahelad on vôimelised uuesti renatureeruma ja
geeni transkriptsioonis osalevad valgud ei mõjuta naabergeene, mis on eraldatud SAR-iga. 36. Kuidas tuvastada transkriptsiooniregulaatorite märklaud geene? Muteerides uuritavat transkriptsiooni regulaatorit (selle leidmiseks võib kasutada nt DNase I footprintingut, mis näitab valgu asukohta (valk DNA-l, hakatakse lõikama lühikesi juppe, märgistatud 32P-ga) ja EMSA-ga saab tuvastada (tekitatakse radioaktiivne DNA ja seotakse sellega valgulüsaat, pärast lahustatakse geelis kompleks liigub aeglasemalt)) nii, et see enam ei funktsioneeri, tuleb kaardistada muutus geeniekspressioonis (DNA 10 microarray analüüsi abil). Geenid, mille ekspressioon on selle tagajärjel muutunud, ongi antud transkriptsiooniregulaatori märklaud geenid. 37. Miks kasutatakse "heat-shock" geenide promootoreid?
Lahust inkubeeritakse, mille jooksul mõlemad antigeenid konkureerivad võrdselt pinnale seotud piiratud antikeha sidumiskohtade pärast. 3. Seostumata antigeen pestakse minema ja lisatakse substraat. 4. Resultaat: mida tugevam värvuse intensiivsus, seda vähem oli uuritavat antigeeni proovis. Immunoblotting - valguliste antigeenide analüüsimiseks/identifitseerimiseks. Valgud lahutatakse elektroforeesil polüakrüülamiid geelis, kantakse siis nitrotselluloosmembraanile. Membraani inkubeeritakse esmalt uuritava antigeeni vastase antikeha lahusega, siis antiimmunoglobuliini antikehadega või proteiin-Aga, mis on märgistatud fluoresentse värviga või ensüümiga. SDS-PAGE elektroforees - võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulmassi järgi. SDS (naatriumdodetsüülsulfaat) on anioonne detergent, mis on vajalik valkude denatureerimiseks. SDS seostub
4 rakkudes. Seetõttu nimetatakse seda põhiliseks faktoriks. Bakteris Escherichia coli on põhiliseks faktoriks 70, Bacillus'es 43. Stressitingimustes (näit. temperatuuri tõus kasvukeskkonnas, toitainete nälg, oksüdatiivne stress) lülitatakse tööle geenid, mille promootoreid tunnevad ära alternatiivsed faktorid. faktorite tähistamisel kasutati algul indeksit, mis iseloomustas vastava valgu liikuvust SDS geelis. Paljud faktorid liikusid aga anomaalselt ning sellepärast hakati indeksina kasutama arvestuslikku molekulmassi kDa-nites, mis tuletati geeni pikkusest. Näit. Bacillus subtilise 43 algne tähis oli 55. Bacilluse puhul jäädi ka selle nomenklatuuriga hätta, kuna mitmete faktorite molekulass oli ligikaudu 30 kDa. Seetõttu võeti kasutusele tähestik. Viimasel ajal on 43 asemel kasutusel tähis A. Bakteris E. coli on teada 7 erinevat sigma faktorit Alternatiivsed faktorid bakteris E
segatakse kindla hulga ensüüm-märgistatud antigeeniga. Lahust inkubeeritakse, mille jooksul mõlemad antigeenid konkureerivad võrdselt pinnale seotud piiratud antikeha sidumiskohtade pärast. 3. Seostumata antigeen pestakse minema ja lisatakse substraat. Resultaat: mida tugevam värvuse intensiivsus, seda vähem oli uuritavat antigeeni proovis. Immunoblotting- Tehnika valguliste antigeenide analüüsimiseks ja identifitseerimiseks. Valgud lahutatakse elektroforeesil polüakrüülamiid geelis, kantakse siis nitrotselluloosmembraanile. Membraani ikubeeritakse esmalt uuritava antigeeni vastase antikeha lahusega, siis antiimmunoglobuliini antikehadega või proteiin-Aga, mis on märgistatud radioisotoobi või fluoresentse värviga või ensüümiga. SDS-PAGE elektroforees- SDS-PAAG (polüakrüülamiidgeel) võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulmassi järgi. SDS (naatriumdodetsüülsulfaat) on anioonne detergent, mis on vajalik valkude denatureerimiseks
fosfataasi ACP varianti, mida määravad kolm alleeli ACPA, ACPB ja ACPC. Nende kolme alleeli kombineerumise tulemusena võivad tekkida kuus erinevat genotüüpi. Aluselise fosfataasi A, B ja C vormid on funktsionaalselt sarnased, kuid erinevad oma liikuvuselt geelelektroforeesil, sest nende aminohappelises järjestuses on erinevusi. Kuue erineva genotüübi puhul on valkude elektroforeetiline pilt erinev. Kõigi kolme homosügootse variandi puhul on geelis elektroforeetiliselt tuvastatavad kaks erinevat, igale tüübile spetsiifilist valgubändi, sest samal polüpeptiidil on kaks konformatsiooni, mis liiguvad geelis erinevalt. Iga erineva genotüübi puhul on ACP aktiivsus erinev, püsides teatavas väärtuste vahemikus. Erinevate genotüüpide korral need väärtused osaliselt kattuvad. Analüüsides ACP aktiivsust kogu populatsioonis saame pideva kõvera, mis näitabki, et selle tunnuse fenotüübiline muutlikkus populatsioonis on pidev.
fosfataasi ACP varianti, mida määravad kolm alleeli ACPA, ACPB ja ACPC. Nende kolme alleeli kombineerumise tulemusena võivad tekkida kuus erinevat genotüüpi. Aluselise fosfataasi A, B ja C vormid on funktsionaalselt sarnased, kuid erinevad oma liikuvuselt geelelektroforeesil, sest nende aminohappelises järjestuses on erinevusi. Kuue erineva genotüübi puhul on valkude elektroforeetiline pilt erinev. Kõigi kolme homosügootse variandi puhul on geelis elektroforeetiliselt tuvastatavad kaks erinevat, igale tüübile spetsiifilist valgubändi, sest samal polüpeptiidil on kaks konformatsiooni, mis liiguvad geelis erinevalt. Iga erineva genotüübi puhul on ACP aktiivsus erinev, püsides teatavas väärtuste vahemikus. Erinevate genotüüpide korral need väärtused osaliselt kattuvad. Analüüsides ACP aktiivsust kogu populatsioonis saame pideva kõvera, mis näitabki, et selle tunnuse fenotüübiline muutlikkus populatsioonis on pidev.
Nüüd ahela süntees 70-75°C juures kasutades termo-resistentset DNA polümeraasi (nn. Taq polümeraas saadud Thermus aquaticus'elt). Sama protseduuri (denaturatsioon, liitmine ja ahela süntees) korrata 20-45 korda (s.o. 1 million kuni 35 trillionit koopiat). Jahutame 4°C ja säilitame paljundatud DNAd analüüsideks. Kaasaegne automatiseeritud sekveneerimine fluorestseeriva märgiga: 4 värviga märgitud nukleotiidid ühes tuubis ja foreesitakse ühel joonel polüakrüülamiid geelis või siis kapillarides, millistes on geel. UV laser detekteerib värvid ja loeb järjestuse. Järjestus visualiseerub eri värvidega kromatogrammil, mis vastab nukleotiidide järjestusele. Väljund umbes 1200 aluspaari reaktsioonis ja 96 reaktsiooni 3 tunni jooksul. Enamus automatiseeritud sekvenaatoreid laetakse robotitega ja need töötavad 24 tundi järjest. Minimaalne tööjõu kulu. DNA fingerprinting ehk DNA tüpiseerimine (profiling). Ei ole olemas kahte ühesuguse
annaabi.ee 
