Geenitehnoloogia I konspekt (2)

Geenitehnoloogia I konspekt

Raku ja embrüotehnoloogiad

Kloonimine – geneetiliselt identse järglaskonna saamine paljundatavast üksikobjektist. Vegetatiivselt taime paljundamine on sisuliselt kloonimine
Meristeempaljundus –algkoerakkude kasutamine ühelt taimelt suure arvu vegetatiivsete järglaste saamiseks. Neid rakke leidub võrsete kasvukuhikutes, pungades. Ka vigastuste paranemisel tekkiv kallus on suures osas algkude. Algkoe rakud pole differentseerunud, seega sobivates tingimustes, taimehormoonide toimel, kasvab neist välja terve taim. Meristeemilõigust võib eri söötmetel kasvatada sadu kuni tuhandeid võrseid. Loomadel on sellised rakud vaid moorula rakud.
Embrüosiirdamine – arengu algusjärgus oleva embrüo ülekanne indleva emaslooma või rasestumisvalmis naise emakasse. Kasutatakse põllumajandusloomadel, et selekteerida välja kõige paremate omadustega järglased, mis tagab suure ressursside kokkuhoiu ning saadakse ühelt väärtuslikult paarilt palju rohkem järglasi. Teiselt loomalt pärit embrüotest järglasi sünnitanud loomi nimetatakse surrogaatemadeks ehk asendusemadeks.
In vitro viljastamine – väljaspool organismi munaraku viljastamine.
Dolly meetod kloonimisel – udararaku doonori rakutuum ja eemaldatud tuumaga munarakk liidetakse elektriimpulsiga, vegetatiivne rakk areneb kultuuris, embrüo siirdatakse surrogaadile ja saadakse tuumadoonoriga geneetiliselt identne isend
Terapeutiline kloonimine – tekitatakse kloonembrüo, eraldatakse tüvirakud ja neist kasvatatakse koed /organid
Tüvirakud – diferentseerumata või vähe diferentseerunud jagunemisvõimelised rakud, mis võivad diferentseeruda teisteks rakutüüpideks, kuid säilitavad ka endasuguseid.
Rakuteraapia – ravimeetodid, mille puhul organismi hävinud rakke või organite kahjustunud funktsioone taastatakse tüvirakkude siirdamisega.
Blastomeer – totipotentne tüvirakk
Embrüonaalsed tüvirakud – kõik rakutüübid, aga ei tule tervikorganismi
Nabaväädivere tüvirakud – stimulatsiooni korral saavad areneda paljudeks koetüüpideks
Täiskasvanu tüvirakud – nt vereloome tüvirakud
Geenitehnoloogia seidneb DNA valitud lõikude eraldamises, töötlemises in vitro ja siirdamises sama või muu liigi isendi geneetilisse struktuuri – kromosoomi, plasmiidi või viirusesse.
Rekombinantne DNA – DNA molekul , milles on ühendatud eri liikidelt pärit DNA fragmendid .
Restriktaas- omapärane ensüüm, mis lõikab dna kaksikahelat kindlate järjestuste kohalt. Bakterid sünteesivad neid, et end kaitsta end erinevate viiruste sissetungi eest – need lõikavad viiruse dna tükkideks enne kui see jõuab rakku kahjustada.
Ligaas – ensüüm, mille toimel ühinevad ahelate otsad ka kohalentsete sidemetega ja lõpetab rekombinantse molekuli moodustumise
Transgeenne organism – organism, kelle genoomi on siiratud mõne teise liigi geene, mis neid organismides avalduvad ja ka järglastele päranduvad.
Geeni nokaut =geenisihtimine – suunatud mutageneesiga tekitatav geenirike, mis geeni avaldumise täielikult välistab. Sel viisil loodud organismid on nokaut-organismid. Luuakse DNA- konstrukt , mis sisaldab suure osa sihitava geeni nukleotiidijärjestusest, kuid selles on oluline viga, mis geeni avaldumist ei võimalda. Peale selle pannakse konstrukti ka mingi markergeen. See konstrukt sisestatakse rakku, see rekombineerub normaalse geeniga ja crossingoveriga tuleb mutantne geen, millel funktsiooni pole.
GM Taimed ja nende ohud:

Herbitsiidikindlad( ohuks on see, et levib mujale tõrjumatu umbrohuna)

Bakteritoksiini tootjad – loodusele ideaalis head, kuid imejad putukad nagu lehetäid ja lutikad jäävad ellu aga on mürgised hiljem lepatriinudele, jooksiklastele, seega see kõik süvendab imurputukate kahjurluse probleemi.

Nt sojaoale lisati maapähkli geeni ning saadi allergeenne sojauba

Säilivusaeg

Toiteväärtus – nt kuldne riis , mis sisaldab beetakaroteene, millest moodustub vit A
Kimäär – organism, kes sisaldab kahe erineva päritoluga geneetilist materjali.
Geeniteraapia – normaalselt talitleva geeni siirdamine raske geneetilise puudega inimese mingi koe(organi) rakkudesse. Osaldel juhtudel seisneb ravi ka mutantse geeni avaldumise vaigistamises.
Geenivaigistus – kindlad mRNA molekulid blokeeritakse või lammutatakse kiirelt mikro RNA-de kaudu, mille tulemusena geen ei avaldu ja valku ei saa sünteesida.
Molekulaargeneetiline diagnostika – mutantsete geenide äratundmine DNAproovide abil. Kasutatakse juba embrüodest alates.
Molekulaarbioloogia dogma -
DNA sõrmejäljed
Onkogenees – protsess, mille käigus normaalsed rakud muutuvad kasvajarakkudeks
Kasvaja – ebanormaalsete rakkude kogumik
Metastaas – rakkude liikumine primaarsest kasvajast teistesse organitesse
Geneetiliselt muteerunud rakud jagunevad aja jooksul kontrollimatult või keeldub apoptoosist (enesehävitus juhul, kui midagi valesti läheb)
Kasvaja areng – kui rakk kasvab ja paljuneb kiiremini kui teised, siis tal on suurem vüimalus ka mutatsioonideks ja see on järjest kiirenev protsess iga kasvu soodustava mutatsiooniga. Tekib angiogenees, ehk kasvaja haarab endale veresoontevõrgustikust osa, et soodustada enda kasvu
Järgmiseks tungib kasvaja läbi membraani, koest väljapoole, tema üksikud rakud sisenevad verre, mille kaudu liiguvad mujale organismi osadesse – nad metastaseeruvad, ehk loovad uusi koldeid teistes kohatdes üle kogu keha
Healoomuline kasvaja ei levi organismis, kuid võib välja türjuda ümbritsevad rakud nt ajukasvaja, tüükad.
Pahaloomulised kasvajad võivad levida organismis ja põhjustada sekundaarseid kasvajaid.
Sonic hedgehog geen kontrollib:

• Vasak-parem asümmeetriat
  
• Kesknärvisüsteemi dorso-ventraalset diferentseerumist
  
• Somiitide teket
  
• Areneva jäseme anteiro-porterioorse telje teket ning sõrmede-varvaste moodustumist
  

On oluline järgmiste kudede/organite arengus:

• Kopsud
  
• Soolestik
  
• Hambad
  
• Karvad
  
• Pankreas etc
  

Kasvaja teraapia:

Kirurgia

Keemiaravi

Kiiritud

Immunoteraapia

Antiangiogeneetiline teraapia
Valkude funktisoonid.

• Ensümaatiline – biokeemiliste reaktsioonide (keemiliste sidemete tekke või lõhkumise) katalüüs
  
• Ehituslik – nt keratiin(karvad küüned sarved ), aktiin(tsütoskelett), histoonid (DNA pakkimine kromosoomides)
  
• Transport – nt hemoglobiin
  
• Retseptor – nt atsetüülkoliini retseptor (närvirakkude siganaalide vahendamine )
  
• Regulatoorne – valgulised hormoonid (nt kasvuhormoon )
  
• Kaitse – antikehad
  
• Liikumine – müosiinid, kinesiinid
  
• Energeetiline – kui lipiidide ja sahhariidide varud on ammendunud
  

Valkude struktuurid:

Primaarne – lineaarne

Sekundaarne – alfaheeliks või beetaplaat, aminohappejärjestused on omavahel seotud vesiniksidemetega

Tertsiaarne – kui alfaheeliks ja beetaplaat on omavahel sidus paljudes kohtades

Kvaternaarne – valk, mis koosneb mitmest erinevast aminohappejärjestusest
Valgud seovad teisi struktuure (ligande) spetsiifiliselt, sellest tulenevad valkude bioloogilised omadused. Ligandideks võivad olla ioonid , väikesed molekulid, teised valgud, rasvad , nukleiinhapped jne.
Antikehad seonduvad oma antigeenile.
Aktiin polümeriseerub, moodustades tsütoskeleti (nt neuronite jätkete pikenemine)
Heksokinaas seob ATP-d, kandes fosfori glükoosile.
Transkriptsioonifaktorid seonduvad DNA-le järjestusspetsiifiliselt.
RNAde liigid:

mRNA – infokandja DNA ja valkude sünteesi vahel (2-5% raku RNAst )

rRNA - üle 90%raku RNAst

tRNA – aminohapete transport ja geneetilise koodi dekodeerimine valgu sünteesiks

ribosüümid – RNA-ensüümid

mikro- RNAd – posttranskriptsiooniline geenide aktiivsuse regulatsioon
Escheria coli – soolekepike
Saccharomyces cerevisiae – pagaripärm
Schizosaccharomyces pombe – poolduv pärm
Caenorhabditis elegans – ümaruss
Drosophila melanogaster – äädikakärbes
Danio rerio – sebrakala
Geen – DNA järjestuse lõik, mis kodeerib valku või struktuurset, katalüütilist või regulatoorset RNAd
Histoon – väga konserveerunud aluseline valk
DNA ja RNA erinevused:

• desoksüriboos, riboos
  
• tümiin, uratsiil
  
• kaheahelaline, üksikahelaline
  
• RNA omab katalüütilist funktsiooni
  

Transkriptsioon ehk RNA süntees.
Splaising – RNA modifikatsioon pärast transkriptsiooni, kus intronid eemaldatakse ja eksonid liidetakse. Toimub eukarüood mRNAs enne kui ta saab translatsiooniga toota korrektse valgu.
Ribosoom – valgutehas, mis sisaldab rRNAd ja ribosoomi valke. rRNA sünteesitakse tuumakeses, valgud tsütoplasmas.
Igat aminohapet polüpeptiidis kodeerib üks nukleotiidikolmik, mis ei kattu omavahel ning pole ka väljajäetavaid nukleotiide . Ühele aminohappele vastab rohkem kui üks koodon , erinevus on enamasti viimases nukleotiidis. Stoppkoodonid. Kood on universaalne.
Antibiootikumid – passiveerivad bakterite valgusünteesi.
Genoom – antud liigi täielik geenikogum
Geeni ekspressioon e avaldumine – geeni transkriptsioon(RNA toodang) ja translatsioon (valgu toodang)

Konstituiivne ekspressioon – geenidel, mille produkte on igas rakus igal ajal vaja=housekeeping geenid

Muutuva tasemega ( induktsioon ja repressioon) – avaldumise tase muutub vastavalt vajadusele: välised signaalid /raku arenguprogramm
Ekspressiooni regulatsioon

• Transkriptsiooni initsiatsioon (kindlad dna järjestused, regulaatorvalgud, dan-valk ja valk-valk seondumise mõjud, RNA polümeraas)
  
• Promootor – dna järjestus, millele RNA-Pol seostub ja initsieerib transkriptsiooni
  
• Operaator – DNA järjestus, millele seostub repressorvalk, et kõrvalpaiknevate geenide transkriptsiooni takistada
  
• Cis- acting elemen – DNA järjestus, mis mõjutab oma lähedaloleva geeni avaldumist
  
• Sigma-abifaktor – prokarüootidel soodustab RNA-Pol seost DNA järjestustele
  
• Eukarüootidel regulaatorvalkudeks TF – transkriptsioonifaktorid
  
• TF seostub cis-actingutega – trans-acting
  

Induktor – repressoriga seostuja
Attenuatsioon – lisakontroll, fine-tuning, toimub translatsiooni tasemel
Analüüsimeetodid võõrDNA jälgimiseks:

• Hübridiseerimine: (kindla NA järjestuse tuvastamine NA molekulide segust kasutades komplementaarsusel põhinevat üksikahelate paardumist)
  
  • Geelis lahutatud DNA/RNA kantakse üle (nailon) membraanile nii , et nad oleksid üksikahelad.
    
  • Meid huvitav järjestus märgistatakse radioaktiivselt vm meetodil
    
  • Lastakse üksikahelatel omavahel paarduda
    
  • Mittepaardunud proov pestakse maha ja NA asukoht tuvastatakse märgise järgi
    
• Sekveneerimine – järjestuse määramine
  
  • Praegu kasutusel ensümaatiline meetod, kus DNA polümeraas lisab vahel ahela sünteesi käigus dNTP asemel didesoksünukleotiidi, mis lõpetab antud ahela pikenemise. Märgistatud DNA ahelda geel-elektrofreesis pikkuse järgi.
    

Geenikogud

Genoomse DNA kogud

cDNA kogud (eri liigid ja koed) – ainult eksoneid sisaldav, annab infot geenide avaldumise kohta.
PCR(polümeraasi ahelreaktsioon
Võimaldab eksponentsiaalselt paljundada uuritavat DNAd (miljardid molekulid 1-2 tunniga)
Põhineb termostabiilsel DNA polümeraasil, kus luuakse komplementaarsed praimerid meid huvitavale järjestusele ja siis tsükleeritakse (ahelate lahtisulatus, praimerite paardumine, ahelate sünteesimine kokku 30-40 korda)