Bioloogia eksami materjal (0)

Transkriptsioon - RNA molekuli süntees DNA info põhjal. DNA ahelale sünteesitakse komplementaarne RNA üksikahel, mida nimetatakse transkriptiks.
RNA- üksikahelaline polünukleotiidide ahel. Suhkruks on riboos. Alusteks adeiin, guaniin , tsütosiin ja uratsiil .
RNA molekulide tüübid:

• mRNA- kodeerib valke ( translatsioon )
  
• tRNA- transpordi RNA
  
• rRNA- ribosoomide koostises
  
• snRNA- väikesed tuuma RNAd , osalevad nitronite splaissimisel.
  

RNA sünteesiks ei ole vaja praimerit. Iga RNA molekuli süntees algab uue molekuli sünteesiga päris algusest.
RNA polümeraas- ensüüm, mis sünteesib DNA ahelale komplementaarse RNA ahela.
Pöördtranskriptsioon e. revertaas- ensüüm, mis sünteesib RNA ahelale komplementaarse DNA ahela. Vajab praimerit.
Promootor - DNA järjestus, millele RNA polümeraas seondub. Selle abil saab reguleerida geeni ekspressiooni.

• Konstitutiivne promootor- ekspressioon toimub kogu aeg igas taime osas.
  
• Valikuline promootor- ekspressioon toimub teatud taime arengu faasis ja teatud taime kudedes. Sõltub välistest teguritest.
  

Enhanser järjestus- DNA järjestus, millele regulaatorvalgud saavad seonduda, et omakorda reguleerida RNA polümeraasi tegevust ja seeläbi transkriptsiooni. Asub promootorist eespool või tagapool.
Transkriptsiooni valgud - Spetsiaalsed regulaatorvalgud, mis määravad ära millist geeni ja millal aktiveerida. Neil on DNA-ga seonduv osa ( domeen ), mis võimaldab neil DNA järjestusega (enhanser, promootori elemendid) seonduda.
Transkriptsioon toimub tuumas.
Transkriptsioon faasid:

Initsiatsioon e. algus (initiation)- Nukleotiidi molekule lisatakse ükshaaval kuni 9 aluspaari on lisatud ja siis saab alata elongatsioon (RNA polümeraas saab liikuda ).

Elongatsioon e. pikendus (elongation)- DNA lahtikeeramine ja nukleotiidide lisamine jätkub

Terminatsioon e. lõpp (termination)- Moodustab juuksenõela struktuuri (enda suhtes komplementaarne).
mRNA modifikatsioonid:

• 5’ ‘müts’ (cap)- funktsioonid: Olla ‘lipuks’ transpordil tuumast välja, Kaitsta lagundamise eest, Seondumiskoht ribosoomile (translatsiooni algus)
  
• 3’ polü(A) saba- funktsioonid: Kaitseb lagundamise eest, Vajalik translatsiooni lõpetamiseks
  
• Splaissimine - snRNA molekulid viivad läbi. Splaissing võimaldab ühelt DNA järjestuselt kodeerida erinevaid valke. Spinat ja müürlooga rubisco aktivaas oli esimene 1998
  
  • Eksonid – järjestuse osa, mis jääb alles
    
  • Intronid – väljalõigatud järjestuse osad
    

Regulaatorvalgud- reguleerivad RNA polümeraasi tööd.
Repressor ja aktivaator - molekulid, mis soodustavad või takistavad transkriptsiooni.
Mittekodeeriv RNA molekul - Funktsionaalne RNA molekul, mille info põhjal ei sünteesita valku

• Kaks peamist gruppi:
  
  • Pikad mitte-kodeerivad RNAd (oluline roll bioloogilistes protsessides, nt areng, paljunemine)
    
  • Lühikesed mitte-kodeerivad RNA (21-24 nukleotiidi). Funktsioon on geeni vaigistamine
    
    • microRNA (miRNAs)
      
    • short interfering RNA (siRNAs)
      
    • piwi-interacting RNA (piRNAs)
      

Pikad ncRNAd Kolm kategooriat:
loomulikud antisense transkriptid (natural antisense transcripts (NATs).
Pikad intronites sisalduvad RNAd.
Pikad geenidevahelises järjestuses asuvad RNAd (long intergenic noncoding RNAs (lincRNAs) 
Oluline roll bioloogilistes protsessides
arengu regulatsioon
stressi vastused
paljunemine
vastus patogeenidele jm taimedel.
Geeni vaigistamise viisid:

• mRNA translatsiooni mõjutamisega
  
• Kromatiini epigeneetiliste modifikatsioonide kaudu
  

RNA vaigistamisel Dicer (DCL) tükeldab RNA ahela väiksemateks osadeks (lühikesed RNA dubleksid), mis seonduvad Argunautiga.
Argonaute valk seob väikesed RNA molekulid ja nende sihtjärjestused.
( Argonaut valk sai nime müürlooga järgi, sest müürlook meenutab kaheksajalga)
siRNA - vahendatud vaigistamine (transkriptsioon ja post-transkriptsioon). Takistavad viiruste replikatsiooni, vaigistavad transposoone ja korduselemente, kaitsevad ka bakterhaiguste eest.

• Enamus taime viiruseid on RNA viirused , mis paljunevad läbi kaksikahelalise vaheetapi. Selle vältimiseks kaksikahelaline RNA molekul lõigatakse DCL poolt väikesteks siRNA molekulideks, mis seonduvad Argonaut (AGO) valguga, et vaigistada viiruse replikatsiooni.
  
• Taimedel võib tekkida viiruste vastu resistentsus
  
• Mutant taimedel puudub siRNA molekul ja nad on viirustele vastuvõtlikumad
  
• siRNA sihtmärgiks on heterokromatiin, transposoonid, viirused jt patogeenid
  

miRNA - vahendatud mRNA lõikamine ja translatsiooni takistamine. Reguleerivad taimedes arengut ja füsioloogilisi protsesse

• Arenenud siRNAdest
  
• Põhjustavad mRNA osadeks lõikamise ja takistavad translatsiooni
  

(RNA vaigistamise fenomeni avastamiseks tehti katseid petuuniatega.) Sir. David Baulcombe
Väikeste RNA molekulide rakendus:

• Nt allergeenide eemaldamine maapählitest
  

Väike RNA molekul, mis on homoloogne viiruse RNA-ga on olemas nii inokuleeritud lehtedes kui ka uutes lehtedes. Väikseid RNA molekule ei ole kontroll-lehtedes ( platseebo
Viiruse infektsioon tekitab süsteemset siRNA kogunemist. Taime rakkude vahel on poorid , miskaudu toimub reguleeritud ainete transport. Vaigistamine levib süsteemselt niinerakkude ( floeem ) kaudu.
Viirustel on valgud, mis suruvad alla RNA vaigistamise.
RNA vaigistamise häirimisega saab viirus häirida taime viiruskaitse mehhanismi. Häirijad-valgud võivad olla aktiivsed igas faasis.
Transgeenide vaigistamine
Taime viidud transgeenid on sageli siRNA poolt vaigistatud
Vaigistamise lülitab sisse:
Väga kõrge ekspressiooni tase
dsRNA , mis tekib transgeenilt
Hälvik RNA-d, mida transgeen kodeerib
Transgeene vaigistatakse post-transkriptsionaalselt ja ka transkriptsiooni ajal.
1980-tel lõid teadlased meetodi, et viia geene taime genoomi, kasutades taime patogeeni Agrobacterium tumefaciens (bakter). Sisestatud geene kutsutakse transgeenideks.
Kalkooni süntaas on ensüüm, mis on oluline antotsüaanide biosünteetilise raja alguses.
Fenomen, kus mõlemad geenid (transgeen ja oma geen) on vaigistatud, nimetatakse ‘koos-allasurumiseks.
Translatsioon- RNA ahelast saadakse geneetilise koodi kaudu valgu aminohappeline järjestus. Toimub ribosoomidel.
mRNA- RNA molekul, kus toimub translatsioon
geneetiline kood- 1 koodon (3 nukleotiidi) kodeerib 1 hapet. Olemas on 20 aminohapet.
START koodon- AUG,( metioniin ) tähistab translatsiooni algust, ilma selleta translatsiooni ei toimuks.
STOP koodon- UGA, UAA, UAG. Tähistavad translatsiooni lõppu.
Aminohape koosneb amiingrupist (NH2) ja karboksüülrühmast (COOH)
Asendamatud aminohapped peab inimene saama toiduga.
Ribosoom: organell tsütoplasmas, kus toimub valgu süntees (translatsioon).
Polüpeptiidid sünteesitakse mRNA molekuli info põhjal.
Translatsiooni faasid:

• Initsiatsioon ehk algus
  
  • Ribosoom ankurdub mRNAle start-koodoni lähedal. tRNA tunneb ära start-koodoni ja kinnitub sellele.
    
• elongatsioon ehk pikendamine
  
  • tRNA molekulid seonduvad mRNAle, jättes maha vastava aminohappe, mis seotakse peptiidsidemesse
    
• terminatsioon ehk lõpetamine
  
  • stop-koodon annab ribosoomile signaali, et mRNA pealt alla hüpata
    

Rubisco ensüümil on 2 domeeni, mida kodeeritakse tuuma ja kloroplastide geenidelt
Pärast translatsiooni toimub valgu pakkimine (aitavad abivalgud e tšaperonid) ja transport.
Esimest järku struktuur on valgu aminohappeline järjestus, seda hoiavad peptiidsidemed.
Teist järku struktuur on keerdumine või voltimine .
Kolmas gloobul (nõrgad sidemed).
Neljas: mitme polüpetiidi ühinemine.
Valgu struktuuri muutmine:

• valkude denaturatsioon - valkude kõrgemat järku struktuuride lagunemine (nt kuumutamine )
  
• valkude renaturatsioon - kõrgemat järku valkude taastumine
  
• valkude hüdrolüüs- peptiidsidemete lõhkumine ( keetmine )
  

Translatsiooni järgselt suunatakse valk kloroplasti.
Translatsioon ja post-translatsiooniline regulatsioon
Koodonikasutus – geenid, mille ekspressiooni tase on rakus madal, sisaldavad nö. haruldasemaid aminohappeid (sünonüümsus koodonite puhul)
Inhibitsioon lõpp-produktiga – mida rohkem on sünteesitud valku, seda rohkem see takistab edasist sünteesi.
Koodonit – nukleotiidi kolmikud, millele vastab konkreetne aminohape
Epigeneetika : Igasugune potentsiaalselt stabiilne ja pärandatav muutus geeni ekspressioonis, mis tekib ilma DNA järjestuse muutuseta.
Eukromatiin on kromatiini osa. See on lõdvalt pakitud kromosoomi ala, mille pealt toimub transkriptsioon.
Heterokromatiin ehk kondenseerunud kromatiinaine on DNA pakitud vorm, mis on tuumas inaktiivne ja mikroskoobis nähtav tumedate aladena
Histooni kood on hüpotees, mille järgi histoonide modifikatsioonid mõjutavad kromatiini olekut ja seeläbi organismide pärilikkust läbi epigeneetika. Selle hüpoteesi pakkusid 2000. aastal välja Brian Strahl ja David Allis
Epigeneetiline programmimine taimedes aitab kontrollida arengu etappe .
Geenitehnoloogia on üks sordiaretuse variant
Meetod, mille käigus viiakse geen või geenid ühest organismist teise.
Võimaldab viia vaid ühe huvipakkuva tunnuse geeni teise organismi ehk võimaldab täppisaretust
Geneetiliselt muundatud organism (GMO): organism (bakter, taim, loom), mille geneetilist materjali on muudetud looduses mittetoimuval viisil, et anda taimele uus omadus.
Klassikaline sordiaretus vs geenitehnoloogia
GMO ehk geneetiliselt muundatud organism
Elusolendid (taimed, loomad, bakterid ), kelle pärilikkuse ainele on biotehnoloogiliste meetodite abil kunstlikult lisatud teiste elusolendite pärilikkuse ainet või kelle pärilikkuse ainet on muul viisil nüüdisaegse geenitehnoloogia abil muudetud.
Cisgenesis - liigisiseselt geneetiliselt muundatud taim (kasutatud on sama taime geene)
cis-geen - geen, mis kodeerib konkreetset tunnust, mis on võetud samalt taimelt või taimelt millega ristumine on võimalik (millega ka traditsiooniline sordiaretus on võimalik). Geen samalt organismilt
Cis-geeniga taim – GM taim ainult cis-geeniga Amflora tärklise kartul. Modifitseeritud tärklis tootmise jaoks- amüloosi süntaasi geeni tagurpidi koopia, et geeni ekspressiooni vaigistada
Transgeen – Geen teiselt organismilt.
Transgeenne taim - GM-taim, milles on transgeen. Mais MON810- putukaresistentne
40 aastat tehnoloogia arengut
esimene geenitehnoloogia abil
loodud organism 1971 (Escherichea coli)
esimene geenitehnoloogia abil loodud taim 1983 (tubakas)
TOMAT - üks esimesi taimi GM tööstuses. 1998-2002. Deaktiveeritud polügalakturonaasi geen, mis vastutab tomati pehmenemise eest. Tomatite tootmine turu huvi puudumise tõttu lõpetati, kuna modifitseerimiseks võetud tomatisort küll ei küpsenud nii kiiresti, kuid viljade kest oli sama pehme nagu kontroll taimedel
Geeni ekspressiooni mõjutavad abiootilised ja biootilised faktorid
Abiootilised: valgus, temperatuur (FLC geen reg, õitsemist), toitained (glutamaadi süntaas).
Biootilised: haiguse tekitajad , teised organismid.
R-geen: resistentsuse geen taimes
Avr geen- mitte-nakatamise geenid patogeenis
On teada palju R-geene, kuid nende struktuur ja täpne funktsioon on teadmata.
DNA eralduse protsess
Purusta rakud, Lisa soolalahus, et DNA viia lahusesse, Lisa orgaaniline lahus (kloroform), et valgud ja rasvad eralduks. Tsentrifuugi ja eralda vesifaas. Lisa alkohol ja DNA sadestub välja
Resttriktsiooniensüümid tunnevad ära konkreetsed kohad ja lõikavad DNA molekuli vaid sealt -Käärid. Lõikamismuster võimaldab võrrelda kahte taime ja leida ühisosasid või mutatsioone.
PCR- polümeraasi ahelreaktsioon, võimaldab luua ühest DNA fragmendist tuhandeid koopiaid . (Kary Mullis ).
Geelelektroforees- Võimaldab eraldada DNA molekule suuruse järgi DNA on negatiivse laenguga ja seega liigub positiivse elektroodi poole. Mida suurem on DNA fragment , seda aeglasemalt see liigub geelis. Etiidium bromiid geelis võimaldab DNA värvida silmale nähtavaks (UV valguse all)
Southern blot- Edwin Southern
Testib, kas sisestatud geen on terve ja ühes tükis, õiges suunas ja koopia arvu. DNA kodeeriva järjestuse alusel disainitakse proo, millega hübridiseeritakse transgeense taime DNA-d filterpaberil. Proovil on küljes radioaktiivne signaal , mis näitab tulemust.
Northern blot- testib, kas mRNA on taimes olemas ja et transkriptsioon toimib korrektselt. mRNA eraldatatakse, kantakse filterpaberile. Radioaktiivse sildiga DNA proov seob mRNA külge ja on nähtav.
Western blot- testib valgu olemasolu, valgu proovid eraldatakse transgeensetest taimedest ja kantakse membraanile. Prooviks on antikehad , mis tunnevad ära eesmärk valgu.
DNA sekveneerimine - võimaldab kindlaks teha konkreetse DNA järjestuse.
Promootor- Nende abil saab reguleerida geeni ekspressiooni.
Konstitutiivne promooter – ekspressioon toimub kogu aeg igas taime osas.
Valikuline promooter – ekspressioon toimub ainult teatud taime arengu faasides, teatud taime kudedes või sõltub ekspressioon välistest teguritest.
Tugevad ja nõrgad promootorid – mõjutab ekspressiooni kogust (valgu hulka)
Marker geen-Geen, mille alusel saab otsustada, kas huvi all olev geen on teise organismi kandunud. Tavaliselt antibiootilist või herbitsiidi resistentsust tagavad geenid
Reporter geen- Paigutatakse huvi all oleva geeni lähedale. Võimaldab identifitseerida transformeerunud rakke NING võimaldab hinnata ekspressiooni hulka (ainult retseptist ehk geenist on vähe kasu, kui ta valku ei tooda).
Transformatsioon ehk DNA ülekanne- Geneetilise materjali taime viimine
Füüsilised ja bioloogilised meetodid
Kaks peamist meetodit: Biolistiline meetod (gene gun), Mullabakter Agrobacterium abil
Marc Van Montagu ja Jozef Schell- mullabakter geenikandjana.