· Geelimaterjali maht (Vg) Uuritava segu läbi kolonni transportimiseks ja erineva molekulmassiga ainete eraldamiseks, voolutatakse ehk elueeritakse kolonni sobiva vesilahusega (puhver, soolalahus) ja kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Igat uuritavas segus sisalduvat ainet iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx (see arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Vx eluaadi maht, mille uures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Vxmin - ehk minimaalne elueerimismaht, mis on võrdne kolonni vaba mahuga Vv kolonni vaba maht ( kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitvatesse geeli pooridesse, väljuvad nad segust esimesena.) Vxmax - maksimaalne elueerimismaht (aine molekulid difundeeruvad täielikult geeli pooridesse ja liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt.)Vxmax = Vt Vg
(lineaarne punavetikate polüsahhariid, mis sisaldab D-galaktoosi ja 3,6-anhüdro-L- galaktoosi molekuli jääke) või polüakrüülamiidist. Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud: Täidise maht Vt Kolonni vaba maht ehk graanulitevahelise vedeliku maht Vs Graanulitesisese vedeliku maht Vs Geelimaterjali maht Vg Seega Vt = Vv+ Vs+ Vg Ainet iseloomustab elumineerimismaht e väljumismaht Vx. See on eluaadi maht, mis on kogutud kuni aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni. Kui segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena, neil on minimaalne elueerimismaht Vxmin, mis võrdub kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et difundeeruda täielikult geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aeglaselt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on
täidise kogumaht ehk üldmaht (Vt). Vt = Vv + Vs + Vg Ainete segu juhtimisel läbi geelkromatograafia kolonni toimub molekulide lahutumine vastavalt molekulide võimele difundeeruda geeli pooridesse. Selleks, et uuritavat ainete segu läbi kolonni transportida, voolutatakse (elueeritakse) kolonni sobiva vesilahusega (puhver, soolalahus vm) ja kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Ainet iseloomustab elumineerimismaht e väljumismaht Vx. See on eluaadi maht, mis on kogutud kuni aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni kolonnist. Kui segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena, st neil on minimaalne elueerimismaht Vx min, mis võrdub kolonni vaba mahuga. Vxmin= Vv Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aeglaselt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vx max, mis on
Uuritava segu läbi kolonni transportimiseks ja erineva molekulmassiga ainete eraldamiseks, voolutatakse ehk elueeritakse kolonni sobiva vesilahusega (puhver, soolalahus) ja kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Igat uuritavas segus sisalduvat ainet iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx (see arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Vx – eluaadi maht, mille uures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Vxmin - ehk minimaalne elueerimismaht, mis on võrdne kolonni vaba mahuga Vv –kolonni vaba maht ( kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitvatesse geeli pooridesse, väljuvad nad segust esimesena.) Vxmax - maksimaalne elueerimismaht (aine molekulid difundeeruvad täielikult geeli pooridesse ja liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt.)Vxmax = Vt – Vg
võimele difundeeruda geeli pooridesse, s.t. vastavalt molekuli suurusele. Antud kolonn sisaldas Sefadex G75 geeli. Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised suurused: · Täidise maht ( Vt) · Kolonni vaba maht ehk graanulitevahelise vedeliku maht (Vv) · Graanulitesisese vedeliku maht (Vs) · Geelimaterjali ( maatriksi) maht (Vg) Vt=Vv+Vs+Vg Ainet iseloomustavad: Elueerimismaht ehk väljumismaht Vx. Ehk siis eluaadi maht, mis on kogutud kuni aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni. Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured, mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena. Tegemist on minimaalse elueerimismahuga Vxmin, kusjuures Vxmin=Vv. Ained, mis difundeeruvad täielikult geeli pooridesse liiguvad aeglaselt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on lähedane antud kolonni kogu mahule. Vxmax= Vt-Vg.
molekulid lahutuvad üksteisest vastavalt nende suurusele. Selleks, et uuritavat ainete segu läbi kolonni transportida ja et erineva molekulmassiga ained saaksid üksteisest eralduda, voolutatakse (elueeritakse) kolonni sobiva vesilahusega (puhver, soolalahus vm) ja kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht V x. Aine x väljumis- ehk elueerimismaht on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena (kõige kiiremini), st minimaalse elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga Vv. Vxmin = Vv Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse,
koosnevad kas dekstraanist, agaroosist või polüakrüülamiidist. Selleks, et uuritav proov saaks läbi kolonni liikuda, voolutatakse kolonni pidevalt vesilahusega ning kogutakse väljuv fraktsioon kindla mahu kaupa. Kogutud fraktsioonide kindlakstegemiseks kasutatakse füüsikalisi ja keemilisi analüüsi meetodeid. Igal ainel, mis uuritavas proovis sisaldub, on elueerimismaht, mis sõltub aine molekulmassist ja kolonni parameetritest. Elueerimismaht on selline eluaadi maht, milles vastava aine kontsentratsioon on kõige suurem. Kõige esimesena väljuvad kolonnist need molekulid, mis on liiga suured mahtumaks geeli pooridesse. Nende molekulide elueerimismaht on minimaalne ja võrdub kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga. Kõige viimasena väljuvad kolonnist need molekulid, mille molekulmass on väike ja mis mahuvad geeli pooridesse. Nende molekulide elueerimismaht on maksimaalne ja lähedane kasutatava kolonni kogumahule.
pooridesse. Selleks, et uuritavat ainete segu läbi kolonni transportida ja et erineva molekulmassiga ained saaksid üksteisest eralduda, voolutatakse kolonni sobiva vesilahusega ja kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Fraktsioonides sisalduvate ainete kontsentratsiooni määramiseks kasutatakse füüsikalisi ja keemilisi analüüsi meetodeid. Uuritavas segus sisalduva aine x väljumis- ehk elueerimismaht V x on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist kõige kiiremini, st minimaalse elueerimismahuga Vxmin, Vxmin= Vv. Küllalt väikse molekulmassiga ained, mis täielikult difundeerub geeli pooridesse, liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, Vxmax Vt.
mõõtmetega molekulide tungimine terakestesse on välistatud. Geelkromatograafia kolonni iseloomustasid järgmised mahud: · Täidise maht (Vt) · Kolonni vaba maht (Vv) · Graanulitesisese vedeliku maht (Vs) · Geelimaterjali maht (Vg) Ainete segu juhtimisel läbi geelkromatograafia kolonni toimub molekulide lahutumine vastavalt nende võimele difundeeruda geeli pooridesse (vastavalt molekuli suurusele). Ainet iseloomustab elueerimismaht ehk väljumismaht Vx (eluaadi maht, mis on kogutud kuni aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni.) Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena. Neil on minimaalne elueerimismaht (Vxmin = kolonni vaba maht). Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et difundeerude täielikult geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aeglaselt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga (Vxmax = Vt- Vg).
Geelkromatograafia kolonni iseloomustasid järgmised mahud: · Täidise maht (Vt) · Kolonni vaba maht (Vv) · Graanulitesisese vedeliku maht (Vs) · Geelimaterjali maht (Vg) Ainete segu juhtimisel läbi geelkromatograafia kolonni toimub molekulide lahutumine vastavalt nende võimele difundeeruda geeli pooridesse (vastavalt molekuli suurusele). Ainet iseloomustab elueerimismaht ehk väljumismaht Vx (eluaadi maht, mis on kogutud kuni aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni.) Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena. Neil on minimaalne elueerimismaht (Vxmin = kolonni vaba maht). Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et difundeerude täielikult geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aeglaselt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga (Vxmax = Vt-Vg).
esimesena, minimaalse elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdub kolonni vaba mahuga. Vxmin = VV. Geeli pooridesse difundeeruvad täielikult ained, mille molekulmass on väike, nad liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on arvuliselt lähedane kolonni kogumahule Vt. Seega võib kromatograafilise protsessi lugeda lõpetatuks, kui kolonnist väljunud vedeliku üldmaht võrdub ligikaudu kolonni kogumahuga. Kromatogrammiks nimetatakse eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust. Kromatografeerimissüsteem koosneb kolonnist, eluendi reservuaarist ja automaatsest fraktsioonikogurist. Selles praktikumis kasutatakse klaaskolonne, mis on eelnevalt täidetud pundunud dekstraangeeliga Sephadex. Vältimaks täidise väljavoolamist on kolonni alumine osa täidetud klaasvillaga. Kolonn on kinnitatud statiivi külge nii, et selle alla mahuks katseklaas
Kasutasin kolonni, mis sisaldas Sephadex G-75 geeli. Uuritava segu läbi kolonni transportimiseks ja erineva molekulmassiga ainete eraldamiseks, voolutatakse ehk elueeritakse kolonni sobiva vesilahusega (puhver, soolalahus) ja kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Igat uuritavas segus sisalduvat ainet iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx (see arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Vx eluaadi maht, mille uures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Vxmin ehk minimaalne elueerimismaht = Vv kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitvatesse geeli pooridesse, väljuvad nad segust esimesena. Vxmax ehk maksimaalne elueerimismaht = Vt - aine molekulid difundeeruvad täielikult geeli pooridesse ja liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt. Vxmax = Vt Vg
jpg?cb=1416556188] Geelkromatograafia kolonni iseloomustab täidise kogumaht Vt = Vv + Vs + Vg, kus Vv on graanutlitevahelise vedeliku maht, Vs graanulitesisese vedeliku maht ja Vg geelimaterjali ehk -maatriksi maht. Selleks, et uuritavaid aineid saaks läbi kolonni transportides üksteisest eraldada, tuleb kasutada sobivat voolutit ehk eluenti. Eluenti kogutakse aga kindla mahuga fraktsioonide kaupa (antud töös 2 ml). Elueerimismaht Vx on eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Liiga suured molekulid ei mahu graanulitesse ja väljuvad kolonnist esimesena, st nad on minimaalse elueerimismahuga ja on võrdsed graanulitevahelise vedeliku mahuga. Vxmin = Vv Väiksed molekulid suudavad difundeeruda geeli pooridesse ja liiguvad kolonnis kõige aeglasemini. Nad on maksimaalse elueerimismahuga on arvväärtuselt
o võimele difundeeruda geeli pooridesse). Et segu läbi kolonni transportida ja sisalduvaid aineid üksteisest eraldada, elueeritakse kolonni sobiva vesilahusega (puhver, soolalahus) ja kolonnist väljuvat lahust (eluaati) kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimis- e väljumismaht Vx, mille arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Uuritavas segus sisalduva aine elueerimismaht Vx on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Lühima ajaga väljuvad kolonnist molekulid, mis on liiga suured mahtumaks pooridesse. Nad väljuvad minimaalse elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdne kolonni graanulitevahelise vedeliku mahuga: Vxmin=Vv. Kõige aeglasemalt ja maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, väljuvad molekulid, mis on küllalt väikesed, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse.
Geelkromatograafia kolonne iseloomustavad mahud: Täidise üldmaht Vt Kolonni vaba maht (graanulitevahelise Vv vedeliku maht) Graanulitesisese vedeliku maht Vs Geelimaterjali (maatriksi) maht Vg Vt=Vv+Vs+Vg Igat uuritavas segus sisalduvat ainet iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx (see arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Vx eluaadi maht, mille uures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Vxmin ehk minimaalne elueerimismaht = Vv kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitvatesse geeli pooridesse, väljuvad nad segust esimesena. Vxmax ehk maksimaalne elueerimismaht = Vt - aine molekulid difundeeruvad täielikult geeli pooridesse ja liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt. Vxmax = Vt Vg
erineva molekulmassiga aineid üksteisest eraldada, voolutatakse ehk elueeritakse kolonni selleks sobiva vesilahusega. Kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati tuleb seejuures koguda kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx. Elueerimismaht sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni mõõtmetest. Uuritavas segus sisalduva aine x elueerimismaht Vx on selline eluaadi maht, mille juures väljub kolonnist fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Need molekulid, mis on liiga suured, et mahtuda geeli pooridesse, väljuvad kolonnist esimesena ja seda iseloomustatakse minimaalse elueerimismahuga Vxmin. Vxmin on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga: Vxmin=Vv Ained, mis täielikult difundeeruvad geeli pooridesse (väiksema molekulmassiga), liiguvad
kindlaks erinevate füüsikalise ja keemilise analüüsi meetodeid kasutades ELUEERIMIS- ehk VÄLJUMISMAHT (Vx): - iseloomustab iga ainet, mis sisaldub segus - selle suuruse arvväärtus sõltub aine molekulmassist ning kasutatava kolonni tüübist - erinevate molekulmassidega ainete väljumismahte tähistatakse: Vx1, Vx2, Vx3 ... - selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljuvas fraktsioonis on vastava aine kontsentratsioon maksimaalne MINIMAALNE ELUEERIMISMAHT (Vxmin ): - kui segus on molekule, mis on liiga suured, et mahtuda kolonni täitva geeli pooridesse,
Et uuritava ainete segu läbi kolonni transportida ja et erineva molekulmassiga ained saaksid üksteisest eralduda, voolutatakse (elueeritakse) koloni sobiva vesilahusega ja kolonnist väljuvat lahust (eluaati) kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueemiris- ehk väljumismaht , mille arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Uuritavas segus sisalduv aine väljumis- ehk elueerimismaht on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena, st minimaalse elueerimismahuga , mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga. Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et täielikult difundeerida geeli pooridesse,
läbi kolonni vesilahuse abil. Kolonni iseloomustavad suurused: Vv vaba maht (graanulitevahelise vedeliku maht) Vs - graanulitesisese vedeliku maht Vg geelimaterjali ehk maatriksi maht Vt - täidise üldmaht Vt = Vv + Vs + Vg Geelkromatograafias kasutatavad geelid võivad olla erineva koostisega, need on tavaliselt kas dekstraanist, agaroosist või polüakrüülamiidist. Iga ainet iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx, mis on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Molekulid, mis on liiga suured, et mahtuda geeli pooridesse väljuvad kolonnist esimesena ehk minimaalse elueerimismahuga, see aga on võrdne kolonni vaba mahuga. Vx min = Vv Vastupidises olukorras, kui molekulmass on piisavalt väike täielikult geeli pooridesse difundeerumiseks, siis need molekulid liiguvad kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse
molekulide suurusele (s.o võimele siseneda geeli pooridesse). Et segu läbi kolonni transportida ja sisalduvaid aineid üksteisest eraldada, voolutatakse kolonni sobiva vesilahusega ja kolonnist väljuvat lahust (eluaati) kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimis- e väljumismaht Vx, mille arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Uuritavas segus sisalduva aine elueerimismaht Vx on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Lühima ajaga väljuvad kolonnist molekulid, mis on liiga suured mahtumaks pooridesse. Nad väljuvad minimaalse elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdne kolonni graanulitevahelise vedeliku mahuga: Vxmin=Vv. Kõige aeglasemalt ja maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, väljuvad molekulid, mis on küllalt väikesed, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse.
Geelid koosnevad dekstraanist, agaroosist või polüakrüülamiidist. Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad mahud: Vv -kolonni vaba maht. Vs graanulitesisese vedeliku maht Vg geelimaterjali maht Vt üldmaht. Seega: Vt= Vs +Vg+ Vv Iga aine, mis sisaldub uuritavas segus iseloomustab elueerimis maht - Vx (V1, v2, v3....) mis sõltub molekulmassist. Vx selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava ained kontsentratsioon on maksimnaalne. Kõige väiksem elueerimismaht on kõige suuremates molekulides, mis ei mahu geeli pooridesse, ja siis väljuvad esimesena. Vxmin on võrdne kolonni granulitevahelise mahuga. Vxmin = Vv Kõige suurem elueerimismaht on ainetes, mille molekulmass nii väike, täielikult difundeeruda geeli pooridess. Need liikuvad kolonnis kõige aeglasem. VxmaxVt
vastavalt nende suurusele ja võimele geeli pooridesse difundeeruda. Selleks, et need erineva molekulmassiga molekulid saaksid üksteisest eralduda, elueeritakse kolonni sobiva vesilahusega ja kolonnist väljuvat lahust (eluenti) kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Fraktsioonis sisalduvate ainete konsentratsiooni kindlakstegemiseks kasutatakse mitmeid füüsikalisi ja keemilisi analüüsi meetodeid. Iga uuritavas segus leiduvat ainet iseloomustab väljumismaht-Vx selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon , milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Molekulid, mis ei mahu geeli kraanulite sisse, väljuvad lahusest kõige kiiremini, neil on minimaalne elueerimistmaht. Ained, mis täielikult difundeeruvad geeli pooridesse, väljuvad kolonnist kõige aeglasemalt ja maksimaalse elueerimismahuga. See on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule
Mina tegin antud protseduuri kolonnis nr 2 ja geeliks oli Sefadex G-50. Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud: Täidise maht Vt Kolonni vaba maht, st graanilitevahelise medeliku maht Vv Graanilitesisese vedeliku maht Vs Geelimaterjali maht Vg Seega Vt= Vs+Vg Ainete segu juhtimisel läbi geelkromatograafia kolonni toimub molekulide lahutumine vastavalt nende võimele difundeeruda geeli pooridesse. Ainet iseloomustab elueerimismaht Vx. See on eluaadi maht, mis on kogutud aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni. Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse siis väljuvad nad kolonnist kõige esimestena ja neil on minimaalne elueerimismaht, mis võrdub kolonni vaba mahuga ja tähistatakse Vxmin vxmin=Vv Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et difundeeruda täielikult geeli pooridesse,
difundeeruda geeli pooridesse. Selleks, et uuritavat ainete segu läbi kolonni transportida, voolutatakse (elueeritakse) kolonni sobiva vesilahusega (puhver) ja kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Iga ainet mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx, mille arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Uuritavas segus sisalduva aine väljumismaht Vx on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena, st minimaale elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga. Ained mille molekulmass on küllalt väike, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse, liiguvad
Lahuses sisalduvad erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise, võimalikult ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega. Pärast komatograafiakolonni voolutamist analüüsitakse lahustunud aineid sobival meetodil. Aine kvantitatiivse analüüsi eluaadi fraktsioonides viisin läbi mõõtes optilist tihedust nähtavas ehk visuaalses (VIS) piirkonnas, kuna töös uurisin värvilistest komponentidest koosnevaid segusid. Tööd alustan kolonni iseloomustamisega, et teaksin vajalikke suurusi ning arve töö käigust arusaamiseks ning hilisemate arvutuste tegemiseks. Samuti valmistan kolonni tööks ette, et
· geelimaterjali ehk maatriksi maht (Vg), · täidise kogumaht ehk üldmaht (Vt). Seega: Vt = Vv + Vs + Vg Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx, mille arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Erineva molekulmassiga ainete väljumismahte tähistatakse vastavalt Vx1, Vx2, Vx3 jne. Uuritavas segus sisalduva aine x väljumis- ehk elueerimismaht Vx on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Kui segus on molekulid, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis see aine väljub kolonnist esimesena ning see aine väljuvad minimaalse elueerimismahuga (Vmin), mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga. Vx min = Vv
võimele difundeeruda geeli pooridesse lahutuvad nad üksteisest. Et uuritavat ainet läbi kolonni transportida ja, et erinevad molekulmassiga ained saaksid üksteisest eralduda, voolutatakse ehk elueeritakse kolonni sobivat vesilahusega ja kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on kaks olulist parameetrid: 1) kolonni vaba mahtu Vv (=Vxmin) ehk eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu. 2) maksimaalset elueerimismahtu Vxmax ehk eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid, mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad. Liikuvusteguriga Rf iseloomustatakse aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja, mille elueerimismaht on kolonnis kindlaks määratud. Kromatogramm on eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vaheline sõltuvus.
(Vs), · geelimaterjali ehk maatriksi maht (Vg), · täidise kogumaht ehk üldmaht (Vt). Seega: Vt = Vv + Vs + Vg Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx, mille arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Erineva molekulmassiga ainete väljumismahte tähistatakse vastavalt Vx1, Vx2, Vx3 jne. Uuritavas segus sisalduva aine x väljumis- ehk elueerimismaht Vx on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Kui segus on molekulid, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis see aine väljub kolonnist esimesena ning see aine väljuvad minimaalse elueerimismahuga (Vmin), mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga. Vx min = Vv
vedeliku mahuga. Vx min= Vv Need ained, mis on liiga väikse molekulmassiga, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aegaselt ja väljuvad kõige hiljem, need väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, milline on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule Vt. Seega Vx=Vt Juhul kui Vg on teada saab leida Vxmax i Vxmax= Vt-Vg Rf = (Vx-Vx min)/(Vxmax Vx min) kus Rf on liikuvustegur, mille väärtused jäävad vahemikku 0-1 Eluaadi frkatsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nimetatakse kromatograammiks. Antud ttöös koosasin käsitsi. Tüüpiline kromatografeerimissüsteem koosneb kolonnist, eluendi reservuaarist ja automaatsest franktsioonikogust ehk kollektorist. Ainete kontsentratsioonide kindlakstegemiseks eluaadi fraktsioonides kasutataksse käesolevas töös spektromeetrilist meetodit. Töö käik
Mina tegin antud protseduuri kolonnis mis sisaldas geeli Sefadex G-75. Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud: Täidise maht Vt Kolonni vaba maht, st graanulitevahelise vedeliku maht Vv Graanulitesisese vedeliku maht Vs Geelimaterjali maht Vg Vt= Vs+Vg Ainete segu juhtimisel läbi geelkromatograafia kolonni toimub molekulide lahutumine vastavalt nende võimele difundeeruda geeli pooridesse. Ainet iseloomustab elueerimismaht Vx. See on eluaadi maht, mis on kogutud aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni. Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse siis väljuvad nad kolonnist kõige esimestena ja neil on minimaalne elueerimismaht, mis võrdub kolonni vaba mahuga ja tähistatakse Vxmin Vxmin=Vv Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et difundeeruda täielikult geeli pooridesse,
· Täidise kogumaht (Vt) Vt = Vv + Vs + Vg Molekulid lahutuvad üksteisest vastavalt nende suurustele ( võimele difundeerida geeli pooridesse). Et ained transportisid läbi kolonni ja eraldasid üksteisest, voolutatakse kolonni vesilahus ( nt soolalahus) ja kolonnist väljuvat eluaati kogutatakse kindla arvu fraktsioonide kaupa. Iga uuritavas segus oleval ainel on oma elueerimismaht Vx. Uuritavas segus sisalduva aine x väljumis- ehk elueerimismaht Vx on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Suured molekulid, mis ei mahu geeli pooridesse, väljuvad kolonnist esimesena ja on võrdsed kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv Väikese molekulmassiga ained liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax. Maksimaalne elueerimismaht on võrdne kolonni kogumahuga Vt. Vxmax ~ Vt
analüüsida. Vastavalt fraktsiooni värvile mõõdetakse tema optiline tihedus kindlal lainepikkusel. Optiline tihedus määrab aine kontsentratsiooni. Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud: Vt täidise maht Vv kolonni vaba maht (graanulitevahelise vedeliku maht) Vs graanulitesisese vedeliku maht Vg geelimaatriksi maht Vt=Vv+Vs+Vg Ainet iseloomustab elueerimismaht ehk väljumismaht Vx. See on eluaadi maht, mis on kogutud kuni aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni. Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena, st neil on minimaalne elueerimismaht Vxmin, mis võrdub kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv Ained, mille molekulid on piisavalt väiksed, et mahtuda täielikult geeli pooridesse väljumad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on ligilähedane kolonni kogumahule Vxmax Vt
spektromeetriliselt analüüsida. Vastavalt fraktsiooni värvile mõõdetakse tema optiline tihedus kindlal lainepikkusel. Optiline tihedus määrab aine kontsentratsiooni. Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud: Vt täidise maht Vv kolonni vaba maht (graanulitevahelise vedeliku maht) Vs graanulitesisese vedeliku maht Vg geelimaatriksi maht Vt=Vv+Vs+Vg Ainet iseloomustab elueerimismaht ehk väljumismaht V x. See on eluaadi maht, mis on kogutud kuni aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni. Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena, st neil on minimaalne elueerimismaht V xmin, mis võrdub kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv Ained, mille molekulid on piisavalt väiksed, et mahtuda täielikult geeli pooridesse väljumad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on ligilähedane kolonni kogumahule Vxmax Vt
Pärast proovi lisamist avatakse väljavool kolonnist ja lisatakse väike kogus voolutuslahust. Seda korratakse mõned korrad ning alles siis lisatakse voolutuslahust terve kolonni täitumiseni. Voolutuslahust peab esialgu lisama väikeste koguste kaupa, et kogu uuritav proov ühtlaselt geeli sisse läheks. Voolutuslahust tuleb lisada pidevalt, et kolonn kuivaks ei jääks. Kõigepealt kogutakse eluaat väiksesse keeduklaasi. Ühendatud fraktsiooni maht on 23 ml. Eluaadi kogumist 2 ml fraktsioonide kaupa alustatakse veidi enne dekstraansinise väljumist. Seejärel kogutakse eluaati 2 ml fraktsioonide kaupa eelnevalt nummerdatud katseklaasidesse kuni pärast viimase, kollase aine väljumist on eluaat värvusetuks muutunud. Kokku kogusin eluaati 37-sse katseklaasi. Arvutuste järgi oleks pidanud kasutama (75,58-23)/2 = 27 katseklaasi. 27 katseklaasi kogusin aga kõige intensiivsema kollase värvusega ainet. Ei oska öelda, millest võis selline
Fraktsioonide analüüs Antud töös väljendatakse aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Lainepikkused, millel mõõtmine läbi viiakse, sõltuvad uuritavate ainesegude koostisest ja need soovitab praktikumi juhendaja. Absorptsiooni mõõdetakse spektrofotomeetritel. Koostage kromatogramm, mille y-teljel on optiline tihedus ja x+teljel eluaadi maht, märkides ära Vminx, Vx ja Vmaxx asukohad. Dekstraansinine müoglobiin DNP-aspartaat Vxmin =21 ml Vx= 33 ml Vxmax= 73ml Vx - Vxmin 33-21 Rf = = = 0,230 73-21 Vxmax - Vxmin Järeldused Katse õnnetus enam-vähem. Erinevus teoreetilise ja saadud Vxmax-i vahel võis olla tingitud
mille sisepinnale on kantud õhuke vedelikukiht, milles toimub ainete lahutumine. Siit tuleneb ka meetodi nimetus kapillaarkormatograafia. Kapillaarkromatograafia meetod võimaldab kiiremat, efektiivsemat ja kõrgema saagisega lahutamist võrreldes traditsiooni- liste kolonnkromatograafia meetoditega. Peale kromatograafiakolonni voolutamist analüüsitakse lahutunud aineid sobival meetodil. Ainete kvantitatiivset analüüsi eluaadi fraktsioonides vib läbi viia mitmel meetodil: ¾ mõõtes optilist tihedust nähtavas e visuaalses (VIS) või ultraviolettkiirguses (UV), ¾ mõõtes murdumisnäitajat (RI - refractive index), ¾ kasutades keemilise analüüsi meetodeid erinevate ainete identifitseerimiseks, ¾ kasutades immunoreaktiivseid meetodeid. 36 Paber- ja õhukes kihi kromatograafia puhul võib:
Geelid, mida kas , koosnevad kas dekstraanist, agaroosist või polüakrüülamiidist. Geelkromotograafia kolonni iseloom järgmised mahud: täidise maht, kolonni vaba maht, graanulitesisese vedeliku maht, geelimaterjali maht. Ainete segu juhtimisel läbi geelkromotograafia kolonni toimub molekulide lahutumine vastavalt nende võimele difundeeruda geeli pooridesse, st vastavalt molekuli suurusele.Ainet iseloomustan elueerimismaht. See on eluaadi maht , mis on kogutud kuni aine maks kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni. Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siois väljuvad nad kollonnist esimestena, st neil on minimaalne elueerimismaht, mis võrdub kolonni vaba mahuga. Ained, mille molekulmass son küllalt väike, et difundeeruda täielikult geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aeglaselt ja väljubad maks elueerimismahuga , mis on lähedane kolonni kogumahule
vastavalt molekulide suurusele. Et segu läbi kolonni transportida ja sisalduvaid aineid üksteisest eraldada, voolutatakse kolonni sobiva vesilahusega ja kolonnist väljuvat lahust (eluaati) kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimis- e väljumismaht Vx, mille arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Uuritavas segus sisalduva aine elueerimismaht Vx on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Lühima ajaga väljuvad kolonnist molekulid, mis on liiga suured mahtumaks pooridesse. Nad väljuvad minimaalse elueerimismahuga Vx min, mis on võrdne kolonni graanulitevahelise vedeliku mahuga: Vx min=Vv. Kõige aeglasemalt ja maksimaalse elueerimismahuga Vx max, väljuvad molekulid, mis on küllalt väikesed, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse.
Kromatogramm · Teades, et komponentideks olid: 1. Dekstraansinisest 3mg/ml, Mr = 2 · 106 2. Müoglobiinist 6mg/ml, Mr = 1,7 · 104 3. DNP aspartaadist 0,3mg/ml Kuna sinine desktraansinine voolas läbi kolonni kõige kiiremini võib järeldada, et tema molekulmass on suurim. Kahjuks ma DNP aspartaadi molekulmassi ei tea, mistõttu on keeruline oletada, kumb väljus kolonnist enne, kes müoglobiin või DNP aspartaat. · Eluaadi maht dekstraansinise kõrgema kontsentratsiooni hetkel Vxmin = Vv = 31,5ml · Kuna ma OPN aspartaadi molekulmassi ei tea siis oletan, et ONP aspartaadi molekulmass on väiksem. Vx = 26ml · Kolonnist viimasena väljunud komponendi kõrgeima konsentratsiooniga fraksioon Vx1max = 57,5ml · Vx1max = 57,5ml Vxmax = 65,357 tõenäoliselt on see viga tekkinud, kas kolonni mõõtmisel või fraktsiooni ei ole täpselt kogutud
Molekulid, mis ei mahu geeli pooridesse väjuvad kõige esimesena, st minimaalse elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdne kolonni vaba mahuga. V xmin = Vv Ained, mis mahuvad geeli pooridesse, liigavad kõige aeglasemalt ja väjuvad maksimaalse elueerimismahuga V xmax, milline on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule. Et täidis väja ei voolaks, on kolonni alumine ots täidetud klaasvillaga. Eluendi lisamine kolonni ja eluaadi fraktsioonide kogumine toimub käsitsi. Ainehulkade kindlakstegemiseks kogutud fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrit. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine · Kontrollitakse, et kolonn oleks vertikaalne. · Märgitakse üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex'i mark ja seda iseloomustav tegur k. · Mõõdetakse geelisamba kõrgus L ja ja diameeter d. · Arvutatakse täidise kogumaht Vt
Molekulid, mis ei mahu geeli pooridesse väjuvad kõige esimesena, st minimaalse elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdne kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv Ained, mis mahuvad geeli pooridesse, liigavad kõige aeglasemalt ja väjuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, milline on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule. Et täidis väja ei voolaks, on kolonni alumine ots täidetud klaasvillaga. Eluendi lisamine kolonni ja eluaadi fraktsioonide kogumine toimub käsitsi. Ainehulkade kindlakstegemiseks kogutud fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrit. Töö käik Kontrollisin kolonni vertikaalsust. Tegin vastavaid mõõtmisi (kõrgus L ja diameeter d) ja kirjutasin endale Sephadex'i mark ja seda iseloomustav tegur k. Avasin kolonni väljavooluava ja täidise kohal olev voolutuslahus hakkas aeglaselt kolonni alla asetatud anumasse tilkuma
Molekulid, mis ei mahu geeli pooridesse väjuvad kõige esimesena, st minimaalse elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdne kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv Ained, mis mahuvad geeli pooridesse, liigavad kõige aeglasemalt ja väjuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, milline on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule. Et täidis väja ei voolaks, on kolonni alumine ots täidetud klaasvillaga. Eluendi lisamine kolonni ja eluaadi fraktsioonide kogumine toimub käsitsi. Ainehulkade kindlakstegemiseks kogutud fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrit. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine 1. Kontrollitakse, et kolonn oleks vertikaalne. 2. Märgitakse üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex’i mark ja seda iseloomustav tegur k. 3. Mõõdetakse geelisamba kõrgus L ja ja diameeter d. 4. Arvutatakse täidise kogumaht Vt 5
3. Milline ühine omadus iseloomustab kõiki geelkromatograafia kolonnide täidisena kasutatavaid materjale? Kõik materjalid on polümeerid ja geeli pooridesse ei mahu ükski molekul, mis on samas suurusjärgus või suurem, kui antud geeli poor. 4. Miks ei tohi kolonnist eluaati koguda liiga kiiresti? Kui elueerida liiga kiiresti, siis erinevad molekulid ei jõua lahutuda ning nad väljuvad seguna. 5. Kirjeldage, kuidas määratakse aine x elueerumismaht Vx. Aine elueerimismaht on sellise eluaadi maht, milles oleva aine kontsentratsioon on kõige suurem 6. Mida näitavad kolonni minimaalne ja maksimaalne elueerumismaht? Minimaalne võrdne graanulitevahelise vedeliku mahuga ja maht, mille juures väljub esimene aine maksimaalse kontsentratsiooniga Maksimaalne lähedane kolonni mahule ning maht, mille juures viimane aine väljub maksimaalse kontsentratsiooniga. 7. Mis on liikuvustegur Rf ja kuidas seda geelkromatograafia meetodi puhul arvutatakse? Millised on Rf piirväärtused?
difusiooni mõju lahutuvusele oleks võimalikult väike. 5. Kirjeldage, kuidas määratakse aine x elueerumismaht Vx. Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx, mille arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Erineva molekulmassiga ainete väljumismahte tähistatakse vastavalt Vx1, Vx2, Vx3 jne. Uuritavas segus sisalduva aine x väljumis- ehk elueerimismaht Vx on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. 6. Mida näitavad kolonni minimaalne ja maksimaalne elueerumismaht? Kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena (kõige kiiremini), st minimaalse elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga.
annaabi.ee 
