Vastus leiad õppematerjalist: Rekombinantsed peptiidid ja kloonimine

Rekombinantsed peptiidid ja kloonimine (0)

1 Hindamata

Esitatud küsimused

Mis rolli mängib DNA metüleerimine restriktsiooni analüüsis?
Milleks seda kasutatakse?
Milliseid meetodeid kasutatakse plasmiidi sisestamiseks Ecoli rakkudesse?
Mis on fagemiid?
Millised eelised on antud vektoritel?
Kuidas on võimalik ligeerida sisend vektorisse õige suunaga?
Millised monomeeride rühmad tuleb kaitsta ja miks?
Kuidas ja millal kaitsvad rühmad eemaldatakse?
Kuidas on võimalik sünteetilisi geene konstrueerida?
Kuidas erinevaid etappe analüüsitakse?
Kuidas on võimalik sisestada restriktsioonikohad PCR-i produkt?
Millised on sarnasused ja erinevused Sanger ja Maxam-Gilbert meetodite vahel?

Selgita „tömbi“ ja kohessiivse otste põhimõtet („blunt“ ja „ sticky ends“)
Need otsad saadakse erinevate restriktsiooni tüüpide tulemusena.
Tömbi otstele on iseloomulik komplimentaarse aluste baaspaari olemasolu. Lihtsam ligeerida vektoriga. Probleemiks DNA võib endast ümber pöörata ning valesti sisse minna.
Kohessiivsed otsad – ilmuvad astmelise katkestuste tõttu ( trepi – sarnased otsad.). Väga kergesti kleepuvad omavahel: aitavad bakteriofaagile moodustada rõbjast struktuuri.

Mis rolli mängib DNA metüleerimine restriktsiooni analüüsis?
Metüleerimise abil kaitstakse DNA restriktsiooni eest. Nii nt.kaitseb E.coli oma genoomset DNA enda poolt toodetud restriktaaside eest. Sellega võib manipuleerida : välja lülitada kloonimisel, et oleks võimalik DNA lõikamist restriktaasiga selleks, et sinna ehitada huvipakkuva DNA järjestust.

Võrdle omavahel järgnevate E.Coli ensüümide omadusi.
DNA polümeraas I
Klenow fragment
Sequenase
Taq polümeraas
5’ → 3’ DNA-sõltuv polümeraasne aktiivsus (on vaja praimeri)
3’ → 5’ eksonukleaasne aktiivsus (DNA parandamine)
DNA sünteesil
DNA polümeraasi „mutantne“ vorm. 5’ → 3’ polümeraasne aktiivsus.
5’ → 3’ eksonukleaasne aktiivsus
Tömbi otste saamiseks.
5’ → 3’ eksonukleaasne aktiivsus puudub.
Kasutatakse peamiselt sekveneerimisel. 3’ → 5’ eksonukleaasne aktiivsus
Kasutatakse peamiselt PCR-reaktsioonides. 3’ → 5’ eksonukleaasne aktiivsus puudub.

Kirjelda järgnevate ensüümide funktsiooni:

Pöördtranskriptaas:sünteesib DNA kasutades RNA ahelat
Terminaalne deoksünukleotiid transferaas (TDT): Katalüüsib pöördumatu dNTP lisamine DNA 3’ otsa hüdroksüül-rühma peale. Kasutatakse radioaktiivseks märgistamiseks, kloonimisel (RACE tehnika), et lisada homopolümeersed osad DNA molekuli 3’ otsale kloonimiseks.
Alkaalne fosfataas „BAP“: bakteriaalne alkaalne fosfataas, mis eemaldab 3´ ja 5´ fosfaatrühmad DNAst ja RNAst . Tähtis roll kloonimisel: defosforüülib 5´-fosforüülitud otsa selleks, et takistada vektori ise-ligeerimist. BAP aktiivne 65°C juures for at least 1 h ja seda inaktiveeritakse phenol extraction.
Alkaalne fosfataas „CIP“: fosfataas, mis eemaldab 3´ ja 5´ fosfaatrühmad DNAst ja RNAst. Hüdrolüüsib NTPd ja dNTPd. Kasutatakse kloonimisel, et vältida korduvat ligeerimist (Aga seda raske väljalülitada, võib häirida ligeerimist). Võib kasutada ka dNTP lõhutamiseks PCR reaktsioonis, et valmistada DNA sekveneerimiseks või SNP analüüsiks.
Rnaas H: Lõhustab heterodupleksis (RNA/DNA) olevat RNA. Tulemusena moodustub üheahelaline DNA.
Nukleaas S1: Lõhustab üheahelalist DNA ja RNA, moodustades 5´fosforüülitud mono- ja oligonukleotiide.

Millised omadused peavad olema plasmiididl, et ta saaks toimida kui kloonimise vektor ?

Antibiootikume resistentsust kodeeriv geen (ampitsiliin või tetratsükliin
Väike suurus
Kloonimise site (MCS), koht kuhu viiakse järjestuse sisse (plasmiidi ala)
Sisene inaktivatsioon (insertional inactivation)
Alfa-komplimentaarsus

Too 1 selektiivse markeri näide, mida saaks kasutada plasmiidi sisaldava bakteri registreerimiseks/identsifitseerimiseks

X-Gal värvib sinisteks rakud , mis ei sisalda huvipakkuva järjestuse, valged on need, mis sisaldavad huvipakkuva järjestuse. Põhineb alfa-komplimentaarsusel

Selgita mõistet ja milleks seda kasutatakse?

Polycloning site – faagi või plasmiidse vektori regioon, mis sisaldab mitu restriktsiooni saiti, mis on reeglina unikaalsed kogu vektori piires. Kasutatakse selleks, et oleks lihtsam vektorisse mingi järjestuse sisse viia.

Kuidas saab identsifitseerida/selekteerida baktereid rekombinantse plasmiidiga, kui plasmiidil on geenid , mis vastutavad nii ampitsilliini kui ka tetratsükliini resistentsuse eest ja sisend asub järjestuses, mis kodeerib tetratsükliini resistentsust?
Selleks, et tuvastada huvipakkuva järjestusega baktereid, tuleb nende kolooniate osad asetada keskkonnale, kuhu lisati eelnevalt tetratsükliini ja inkubeerida. Need kolooniad , mis jäävad ellu ei sisalda huvipakkuva järjestust, kuna nende tetratsükli suhtes resistentsed geenid töötavad. Need, mis hukkuvad, sisaldavad huvipakkuva järjestuse. Saadud tulemusi võrreldakse esimese peetritassiga ja tuvastatakse, mis kolooniat sisaldavad järjestust.

Selgita alfa-komplimentatsiooni. Millised omadused peavad olema vektoril ja peremeesrakkul selle toimimise jaoks?
Bakteritel asub lac z regioon, mis kodeerib B-galaksidaasi produtseerimist. Vektori ja peremeesrakku tehakse kunstlikult mutandiks nii, et vektor sisaldaks selle regiooni alfa-jääki ja peremeesrakk sisaldaks ainult omega -jääki. Ainult sel juhul, kui on mõlemad osad ühendatud, toimub B-galaksidaasi produtseerimine. Kui see toimub, siis värvib X-Gal marker need bakterid sinisteks (tunneb ära B-galaksidaasi tootmist).
Kui vektori sisetakse bakterirakku ning need jäägid, mis on omavahel komplimentaarsed, ei seostu omavahel, siis see olukord viitab sellele, et nende vahel esineb huvipakkuv järjestus ning need rakkud jäävada valgeks.
Selle meetodi toimimiseks, peavad olema mutantsed vekto ja bakter (alfa- ja omegajäägid), peab esinema ka polycloning site.

Milliseid meetodeid kasutatakse plasmiidi sisestamiseks E.coli rakkudesse? Mis on kompetentsed rakud?
Bakterid on võimelised omaks võtta võõra DNA konkreetsetel tingimustel. Rakud, mis esinevad niisuguses olekus, mille jooksul võivad võõra DNA võtta nimetetakse kompetentseteks rakkudeks. Tavaliselt see juhtub kasvu perioodis . Eristatakse loodusliku ja kunstliku transformatsiooni . Looduslik toimub ise (pole vaja eeltöötlemist). Kunstliku transformatsiooni puhul kasutatakse soojusesokki või elektroporatsiooni. Soojusoki käigus (42C) sisenevad plasmiidid bakteriraku mebraani pooride kaudu. Elektroporatsiooni käigus rakendatakse elektrivoolu, mis teeb poorid bakteriraku membraani sees, mille kaudu sisenevad plasmiidi sisse.
Teiseks võimaluseks on konjugatsioon . Bakterite vaheliste konjugatsiooni tulemusena võib plasmiid üle kanduda teisse rakusse.

Mis on fagemiid? Millised eelised on antud vektoritel?
Fagemiid – on plasmiid, mis sisaldab f1 filomentse faagi regiooni, mis sisaldab replikatsiooni alguspunkte .
Fagemiid
Plasmiid
M13
1.Filamentse faagi kujuna või plasmiidina; võib käituda nii plasmiidina, kui ka faagina
2.stabiilne rekombinantne DNA
3.Üheahelaline DNA
4.Sobib suuremate fragmentide sisseviimiseks
1.toodab palju rekombinantset DNAd
2.kasutatakse cDNA kloonimiseks
3.Konjugatiivsed ja mitte, runway tüüp
1. ringikujuline DNA ahel
2.laseb eraldada kloonitud DNA fragmendid üheahelalisel kujul (võimalik sekveneerida)
3.ei tapa bakterirakku
4.F-spetsiifiline

Kuidas on võimalik ligeerida sisend vektorisse õige suunaga?
Kõige lihtsam on lideerida kleepuvate otstega DNA fragmentdid. DNA fragmendi paigutamiseks vektorisse õige suunaga, kasutatakse 2 piiravat restriktsiooni ensüümi DNA läbitöötamiseks, et moodustaksid erinevad otsad. Need erinevad otsad takistavad ligeerimise tagasipöördumist ja aitavad sisestada fragmendi õigel suunal. Samas peab vektori ja sisendi läbitöötlema sama restriktaasidega, vastavalt suunale, kuidas tahetakse kloonida . Kui ei ole võimalik kasutada kahte piirkonda, siis kasutatakse defosforüleerimist.

Kuidas on võimalik ligeerida vektorisse DNA fragment, kui vektoril puuduvad restriktsiooni kohad („site“)?
Võib sünteetiliselt luua need restriktsioonikohad.
Või esineb ka meetod, mille kirjeldas Tsenq H 1999aastal. Meetod põhineb „sticky“ otste moodustumisel kasutades praimeri disaini ja lambda eksonukleaasi PCR reaktsioonis. Moodustuvad otsad on natuke pikem, kui peavad olema ning tekkinud tühiku nende vahel täidetakse Klenow fragmendi abil.
Samas kasutatakse topoisomeraaside toime; ka spetsiifilised praimerid.

Kirjelda filament bakteriofaagi M13 replikeerumist. Miks kasutatakse F-faktoriga peremees -rakke?
F-faktoriga rakud on vajalikud, kuna nendega ühineb M13 faagis olev F-piili. Nende vahel moodustub „tsütoplasmaline sildike“, mille kaudu saab võõr materjal rakku sisse sattuda.
1.Faagi DNA siseneb tsütoplasmasse. Bakteriaalsete ensüümide toimel sünteesitakse komplimentaarset DNA ahelat. DNA güraasi ja topoisomeraaside toimel muundub kaheahelaline DNA replikatiivseks DNAks (RF)
2.Moodustub ringikujuline struktuur
3.Sünteesitakse uut üheahelalist DNA
4. Viirus -partikkel liikub rakkust välja ilma selle raku lüüsita

DNA fragmenti on võimalik ligeerida „blunt-end“ või „sticky-end“ ligeerimise abil. Millised on poolt ja vastu argumendid mõlema meetodi puhul. Millised probleemid võivad esineda?
Blunt-end
+ pole vaja komplimentaarset fragmenti ligeerimiseks, kuna blunt otsad võivad teiste mistahes blunt otstega ligeerida. Vektor ise kokku ei kleepu.
-vähem efektiivne meetod ja aeglasem , kuna niisuguste otste kokku puude on juhuslik.
Sticky end
+ lihtsam ligeerida, otsad on komplimentaarsed ja kergesti leiavad teine teist ning ligeeruvad kokku
-selle meetodi puhul, pärast restriktaasidega töötlemist, vektor võib kiiresti tagasi kokku ligeerida (lahenduseks defosforüülimine, aga see võib takistada ligeerimist).
Mõlemate meetodi puhul võib esineda oht: DNA järjestuse tagasipöördumine.

Mis on cDNA? Kirjelda erinevaid meetodeid cDNA sünteesimiseks. Milliseid erinevaid tüüpi praimereid saab kasutada cDNA sünteesis? Kirjelda, mis on cDNA ja genoomse DNA kogum („library“).
cDNA on DNA, mida sünteesitakse mRNA järgi revertaasi abil (pöördtranskriptaas). cDNA sees on ainult eksonid .
cDNA library - kloonide kollektsioon vektorites, mis on saadud RNA-de koopiatest. Ideaalne kogum sisaldab kõiki ühe organismi või koe geeni. DNA kogum: sisaldab ideaalselt vähemalt iga geeni üht koopiat. cDNAd vastavad aktiisetele geenidele, mis kodeerivad valke. Võimaldab vaadata aktiivseid valke.
Genoomne DNA kogum – kõik geenid, geenipank. Saab identsifitseerida. Genoomse kogumi loomiseks, kasutatakse genoomse DNA lõikamist restriktaasiga ja selle ligeerimine vektorisse: bakteriofaagid, kosmiidid, BAC ja YAC (Võivad esineda probleemid: geeni lõikamine keskel; geen on suurem, kui vektor võib vastu võtta. Kasutatakse randoomset lõikamist; ~20kb)
Esineb mitu varianti cDNA sünteesimiseks:

cDNA sünteesitakse mRNA järgi, mille otsas on Polü-A-saba, mille praimeriks on polü-T oligonukleatiidne järjestus. Süntees toimub 5 – 3 suunas. Protsessi viib läbi revertaas dNTP olemasolul . Aluselises keskkonnas ühe ahelalise DNA ots keerab ja mängib rolli praimerina, sünteesitakse teist ahelat. Seda pööret lõikab ära S1 nukleaas. Lõpuks on kaheahelaline cDNA.

Kui esineb DNA:RNA kompleks , selle kompleksi tunneb ära ensüüm Rnase H, mis lõhustab RNA juppideks. Need juppid mängivad rolli praimeritena, mille abil sünteesitakse teist DNA ahelat, mille teostab DNA polümeraas I. Tekkinud teise ahela juppid liidab omavahel DNA ligaas .

Printsiip on sama, kui eelmisel meetodil Rnase H olemasolul, kuid lõppu lisatakse adaptor ja kasutatakse geeni spetsiifilise praimeri (4tk), mis sünteesivad kaks juppe.

Kirjelda oligonukleotiidide sünteesi kasutades tahke faasi fosforamiidit. Mis toimub erinevates sünteesi etappides? Millised monomeeride rühmad tuleb kaitsta ja miks? Kuidas ja millal kaitsvad rühmad eemaldatakse? Millises etappis on protsess äärmiselt veetundlik ja miks?

DMT rühmad lisanduvad 5-otsaga. Toimub fosfordiestersideme moodustamine, mis tekib amiidofosfiitrühmast (DMT kaitsevad OH-rühma mittespetsiifiliste reaktsioonide eest enne järgmise nukleotiidi lisandumist)

Washing=pesemie: reaktsiooni kolonni pestakse atsetonitriiliga (anhydrous), selle eemaldamiseks toimub flush argooniga.

Detrilatioon: DMT eemaldamine trikloroetaanhape (TCA) lahusega. Jääb reaktiivne OH-rühm.

Pesemine: pestakse kolonni atsetonitriiliga selleks et eemaldada trikloroetaanhappe (TCA). Atsetonitriliist vabastamiseks jälle töödeldatakse argooniga.

Aktivatsioon ja sidumine: apparaat viib ühel ajal fosforamiide ja tetrasoole sisse. Tetrasool aktiveerib fosforamiide nii, et see moodustub kovalentne side 3-fosfiite ja 5-hüdroksüülrühma vahel. See aste on väga tundlik vee suhtes.

Pesemine: argooni abil eemaldatakse tetrasoole ja fosforamiide

Capping: mitte kõik nukleosiidid on seotud esimese tsükli jooksul fosforamiiditega, neid tuleb ära viia, selleks, et takistada puuduvate nukleotiididega oligonukleotiidide moodustumist. Selle tõttu jäänud OH-rühmad kaitstake atsetüülrühmadega (püsivad lahustajate suhtes). Protsessi viiakse lisades kolonni kolonni atseetanhüdriidi ja dimetüülaminopüridiin (aktivaator).

Oksüdatsioon: mittestabiilset fosfiit-triestersidet oksüdeeritakse 0.1M iodiini abil kõrgema stabiilsuseks vievalentseks fosfiit-triestriks.
Protsessi käigus kaitstakse aluste aminorühmi: A ja C bensoüülrühmaga ning G – isobutürüülrühmaga. Neid eemaldatakse pärast sünteesi. Kaitstakse ka fosfiit-rühmi selleks, et takistada mittevajalikke reaktsioone.

Kuidas on võimalik sünteetilisi geene konstrueerida ? Kirjelda vähemalt kolme erinevat variandi.
Sünteetilise geene võib konstrueerida ligeerides omavahel eelnevalt sünteesitud oligonukleotiide, lisades fosfaatrühmi. Võib saavutada nii „blunt“ kui ka „sticky“ otsad.
Sünteetilised geenid väikestest sünteesitud oligonukleotiididest: Oligonukleotiide keemiliselt sünteesitakse (20-60mers) nii, et nende järjestused pärast annealingu moodustuksid kaksikahelat.
In vitro süntees: sünteesitud oligonukleotiidid on projekteeritud nii, et moodustada baaspaare, mille vahel on tühikud.
Suurte geenide süntees: rohkem kui 1000bp. Kogu geeni võib moodustada mitmetest oligonukleotiididest, millest 4-6 on omavahel kattuvad (overlapping).
Fill -in meetod over-lapping oligonucleotides: Kaks 60-80 mer oligonukleotiide võib sünteesida overlapping otstega.

Kirjelda detailselt, kuidas on võimalik, kasutades kahte kattuvat oligonukleotiidi ja fill-in meetodit, konstrueerida sünteetiline geen ning see kloonida, sekveneerida ja ekspresseerida E.colis. Kuidas erinevaid etappe analüüsitakse?
Oligonukleotiide sünteesitakse keemiliselt nii, et nenda otsad kattuksid omavahel. Nii need oligonukleotiidsed ahelad seovad omavahel ning kasutades DNA polümeraasi I ja Klenow fragmenti, dNTP olemasolul võib sünteesida kaksikahelat. Seda sünteetilist järjestus amplifitseeritakse PCR abil, lisades praimeri (forward ja reverse ), Mg (katalüsaator), dNTP-d, Taq polümeraasi (teostab sünteesi kõrgel temperatuuril). PCR käigus toimub ahelate denatureerimine, praimeritega seondumine ja süntees. Seda tsüklit korratakse 30 korda. Seda etappi kontrollitakse kasutades elektroforeesi. Järgmisena toimub selle järjestuse ja vajaliku vektori töötlemine. Sõltuvalt sellest, mis otsad tahetakse saada („blunt“ või „sticky“) kasutatakse vastavalt vajalikud restriktaase. Lõigatakse sama restriktaasidega nii vektorit kui ka järjestust. Puhastatakse saadu produktid. Siis ligeeritakse vektorisse saadud järjestust (takistades ise-ligeerimist, kasutades nt. defosforüülimist). Siis teostatakse vektori transformeerimine bakterirakku, kus huvipakkuva järjestuse ekspresseeritakse. Seejärel bakteriraku lõhutatakse, jäädes vektori huvipakkuva järjestusega, mille saadakse sekveneerimisele. Iga etapi kontrollitakse elektroforeesi abil, samuti igat puhastamisetappi kontrollitakse mõõdetes kontsentratsiooni.
Sekveneerimisel toimub nukleotiidse järjestuse määramine kas Sangeri või Maxam-Gilberti meetodi abil. Kas keemiliste reaktiivide või ensüümide abil. Maxam ja Gilbert: Ühe proovi kohta – 5reaktsiooni: G; G+A; T+C; C: A>C - töödeldakse reaktiividega; lõhutatakse juppideks. Saadud DNA fragmendid kantakse geeli peale. (Miinuseks: kui 3 nukleotiidi järjest, halvasti lahutuvad; raske määrata)
Sanger: kontrollitakse DNA sünteesi ensüümide abil. Dideoksünukleotiidid (OH asemel H --- seega ei ole võimalik sinna uue nukleotiidi lisada; seega süntees selle juures katkeb). Proov jaotatakse 4ks reaktsiooniks: igas reaktsioonis on kõik dNTP ning 1 ddNTP-st (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP). ddNTP ahela lisamisel süntees katkeb. Moodustuvad erineva suurusega DNA ahelad, mida lahutatakse elktroforeesi abil. Kasutatakse markeeritud praimeri või nukleotiidi selleks, et oleks võimalik visualiseerida. Ka Mg lisatakse kofaktorina.
Praegu on see protsess automatiseeritud. Kasutatakse laserdetektori, mis määrab mis nukleotiidiga on tegemist ja vastavalt sellele saadab signaali arvuti peale, kus seda visualiseeritakse eri värvuste piikidega (Iga nukleotiidile vastab oma värvus).

Kuidas on võimalik sisestada restriktsioonikohad PCR-i produkt ?
Selleks võib kasutada spetsiifilisi praimereid, mis sisaldavad restriktaasi äratundmiskohad.

Selgita RT-PCR (reverse transcription) põhimõtet.
Esimesena toimub revertaasi toimel cDNA esmase ahela süntees mRNA järgi, seda teostatakse dNTP ja oligonukleotiidset praimeri lisades puhvris, 37C juures ühe tunni jooksul. Seejärel toimub tavaline PCR.

Kirjelda meetodeid, kuidas on võimalik mõõta mRNA taset rakus? Mis on poolt ja vastu argumendid mõlema meetodi puhul? Kuidas kaardistatakse ekson -intron piire ?
Northern analysis : isoleeritakse vigastamata mRNA; lahutatakse RNA agarosgeelil suuruse järgi, kantakse üle membraani peale, kus RNA fikseerub, toimub hübridisatsioon huvipakkuva lõigu puhul komplimentaarsuse printsiibil; mitteseostunud molekulid eemaldatakse. Detekteeritakse ja analüüsitakse (autoradiogramm). Nõuab suurt RNA kogust, nõuab vigastamat RNA, madal tundlikkus, aga ainuke meetod, mis annab info nii suuruse kui ka koguse kohta (Kasulik: transkripti splaissingu variantide võrdlemisel eri kudedes).
Rnase protection : Kasutatakse mRNA hulga mõõtmiseks ja selle kaardistamiseks. Ei nõua ainult vigastamata RNA, 20-100 korda tundlikum, kui eelmine meetod.
Quantitative RT-PCR: Väga tundlik meetod, RNA peab olema puhastamata.
Transkriptsiooni koha määramiseks võib kasutada: Nuclease S1 või primer extension.
Ekson-intron piire kaardistatakse Nuclease C1 abil.

Millised on sarnasused ja erinevused Sanger ja Maxam-Gilbert meetodite vahel? Kirjelda DNA sekveneerimist Sangeri meetodi abil. Miks vahel kasutatakse dGTP analooge: dITP ja t-deaza-dGTP?
Mõlema meetodi puhul kasutatakse isotoobi visualiseerimiseks ja elektroforeesi, kus toimub lahutamine. Ning samuti mõlemate meetodi puhul tekivad erineva suurusega DNA juppid (kas lõhustamise või sünteesi tulemusena).
Dideoxy Chain Termination method ehk Sangeri sekveneerimismeetod (Joonis 5). Selles meetodis kasutatakse tavaliselt 4 reaktsiooni. Selleks võetakse üht DNA ahelat, lisatakse praimeri ja radioaktiivselt märgistatud isotoopi, selleks et hiljem visualiseerida produkti. Igasse reaktsioonisse lisatakse polümeraasi 4 dNTP ja ühe dNTP tuletisena – ddNTP, mis piirab ehk inhibeerib transkriptsiooni. ddNTP-l puudub 3’ otsa hüdroksüülrühm (esineb H) ning pärast seda, kui neid lülitakse ahela sisse süntees lõpeb. Igasse reaktsiooni pannakse erinevat ddNTP (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP). Siis saadud fragmendid kantakse geeli peale ja teostatakse elktroforeesi, saadakse „sekveneerimise treppi“, mille abil võib määrata nukleotiidset järjestust. Praegu see protsess on automaatne, mis toimub spetsiaalses masinas, kasutades fluorestsentsi värvust ja detektorit. Arvuti ise loeb järjestuse ära, visualiseerides neid piikidena, iga piik vastutab oma nukleotiidile. Mõnikord kasutatakse dGTP analoogid, kuna need on lihtsama struktuuriga.

.DOCX Laadi alla originaalfail 13 lk · .docx · 1 allalaadimist

Rekombinantsed peptiidid ja kloonimine #1

Rekombinantsed peptiidid ja kloonimine #2

Rekombinantsed peptiidid ja kloonimine #3

Rekombinantsed peptiidid ja kloonimine #4

Rekombinantsed peptiidid ja kloonimine #5

Rekombinantsed peptiidid ja kloonimine #6

Rekombinantsed peptiidid ja kloonimine #7

Rekombinantsed peptiidid ja kloonimine #8

Rekombinantsed peptiidid ja kloonimine #9

Rekombinantsed peptiidid ja kloonimine #10

Rekombinantsed peptiidid ja kloonimine #11

Rekombinantsed peptiidid ja kloonimine #12

Rekombinantsed peptiidid ja kloonimine #13

50 punkti Autor soovib selle materjali allalaadimise eest saada 50 punkti.

~ 13 lehte Lehekülgede arv dokumendis

2016-01-28 Kuupäev, millal dokument üles laeti

1 laadimist Kokku alla laetud

0 arvamust Teiste kasutajate poolt lisatud kommentaarid

leksi1992 Õppematerjali autor

Rekombinantsed peptiidid kloonimine keemia

Sarnased õppematerjalid

docx

BIO- JA GEENITEHNOLOOGIA, EKSAM

komponente. YAC on valmistatud pärmi kromosoomi spetsiifiliste piirkondade põhjal ning BAC toodetud F-plasmiidi põhjal. YAC on lineaarne fragment, kuid BAC sirkulaarne. YAC and BAC vectors are two types of artificial vector systems designed to clone large genomic DNA fragments. They have multiple applications in the preparation of genomic and cDNA libraries. 15. Kirjelda kloneerimise protseduuri. Mis on kloneerimiseks hädavajalikud komponendid ning tingimused? Geeni kloonimine (ingl. gene cloning) eeldab mitut järjestikust protseduuri, milledeks on uuritava geeni: 1) isoleerimine; 2) viimine isereplitseeruvasse geneetilisse elementi (plasmiidi või viirusgenoomi); 3) amplifikatsioon ehk paljundamine; 4) uuritava geeniga rekombinantsete kloonide selektsioon. 16. Mis on geeniraamatukogud? 1:43. Geeniraamatukogu on bakteri või faagikloonide kogumid millest iga kloon sisaldab meid huvitavast geneetilisest materjalist ühte konkreetset alamosa. 17

Geenitehnoloogia

docx

Molekulaarbioloogia protokoll

Alusta PCR'i. (5) Samal ajal valmista ...% geel. 40 ml TBE puhvri kohta on vaja kaaluda ... g agaroosi. Valmistamist vaata tööst nr 3. (6) PCRi lõppedes (<1 tund), analüüsi 1/5 saadud produktist agaroosgeelil. Selleks pipeteeri 10 l 1 x TBE foreesipuhvrit (lilla) + 2 l PCR tuubist kokku 12 l, kanda kõik geelile. Geelile lisada kindlasti molekulmassi marker ja kontroll PCR (amplifikatsioon tühjalt pBS SK+ plasmiidilt). Interpreteeri tulemus. Saadud rekombinantsed plasmiidid on valmis inserdi sekveneerimiseks T7 praimeri ja "kit"i abil (järgmises praktikumis). Restriktsiooni tulemused: Minu minipreparatsioonis tuli välja 2 inserti. Üks umbes 2,5 kb pikkune ja teine umbes 6 kb pikkune. Võib olla see on tingitud sellega, et ensüüm Cfr421 ei töötanud väga hästi. 10 Lisaülesanded: 4.1) Leia Wallace reegli abil (4x GC + 2x AT) T3 ja T7 praimerite sulamistemperatuurid. Kui

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

doc

Molekulaarbioloogia praktikumi protokoll

Valmistamist vaata tööst nr 3. (6) PCRi lõppedes (<1 tund), analüüsi 1/5 saadud produktist agaroosgeelil. Selleks pipeteeri 10 l 1 x TBE foreesipuhvrit (lilla) + 2 l PCR tuubist kokku 12 l, kanda kõik geelile. Geelile lisada kindlasti molekulmassi marker ja kontroll PCR (amplifikatsioon tühjalt pBS SK+ plasmiidilt). 12 Interpreteeri tulemus. Saadud rekombinantsed plasmiidid on valmis inserdi sekveneerimiseks T7 praimeri ja "kit"i abil (järgmises praktikumis). PCRi tulemused. Marker 100 bp pBS SK+ Kristine Arvidas Hannes Mihkel Heleen Ksenia Marko Okana Jelena Doris Mikk Anna Alex Aare Irina Inna Jana Karl Suure pildi peal insertsioon puudub, restriktsioonanalüüsiga ilmus siiski välja 800-900 nukleotiidi pikk järjestus. Lisaülesanded: 4

Molekulaarbioloogia

docx

Molekulaarbioloogia aruanne

Tallinna Tehnikaülikool Matemaatika-loodusteaduskond Geenitehnoloogia Instituut Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum YTM0012 MOLEKULAARBIOLOOGIA PRAKTIKUM Pipeteerimine Automaatpipetiga pipeteerimise põhitõed  Pipeteerimisel on kõige olulisem võtta õige suurusega pipett  Pipeteeritav vedelik peab olema homogeenne. Seintelt ja korgi küljest tuleks tilgad ja kondensaat põhja fuugida  Enne pipeteeritavasse lahusesse viimist vajuta kolb esimese astmeni alla. Pipeti tühjenemiseks on vaja vajutada kolb teise astmeni. Viskoosse lahuse pipeteerimine Vajalikud materjalid: pesuvahendi kontsentraat, vesi, pipetid koos otsikutega, falcon tuub, aukudega plaadike Töö käik: 1. Kasutades 1 ml pipetti tegin 15-ml falconisse 5,5ml 30% homogeenset pesuvahendilahust (1,65 ml peduvahendit ja 3,85

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

docx

Kordamisküsimused Geenitehnoloogia I

On DNA kloneerimise teel saadud valk. Selliseid valke saab toota nt bakterite abil või transgeensete loomade abil. Mis on cDNA? cDNA (komplimentaarne DNA) on pöördtranskriptsiooniga saadud DNA koopia. Pöörd-transkriptaas on ensüüm, mille abil sünteesitakse mRNA’lt cDNA’d. cDNA’d kasutatakse eukarüootsete geenide kloonimiseks prokarüootsetes organismides. Bakteri rakkudesse geenide viimisel peame me mRNA alusel tegema DNA. Millised on kloneeritud DNAde kasutusalad tänapäeval? Rekombinantsed valgud on meile väga praktilised, kuna saame neist toota erinevaid ravimeid nt. insuliini. Kasutatakse veel toidutööstuses ensüümid (piim, juust), keskkonnakaitses (toksiliste jääkide likvideerimine bakterite abil). Kloonitud geenid on kasulikud tegemaks uuritavast geenist kergesti hallatavaid koopiaid ja tootmaks selle põhjal vajaminevat valku. Sangeri sekveneerimise põhimõte. Kasutatakse didesoksüribonukleotiide, mis erinevad desoksüribonukleotiididest selle

Geenitehnoloogia

docx

Biotehnoloogia kontrolltööd

Kontrolltöö 1. 1. Milline järgnevatest vektorsüsteemidest kasutab peremeesrakku sisestatud DNA konstrukti tsirkulariseerimiseks cre rekombinaasi ? a) Plasmiid b) Mitte ükski c) Kosmiid d) YAC e) P1 2. Üheks väga levinud viisiks reaalaja kvantitatiivse PCR-i (qPCR-i) tegemisel on TaqMan proovide kasutamine. Millisel DNA polümeraasi omadusel, lisaks 5'-3' sünteesi aktiivsusele, põhineb antud tehnoloogia? a) DNA polümeraasi 3'-5' eksonukleaassel aktiivsusel b) DNA polümeraasi 5'-3' eksonukleaassel aktiivsusel c) DNA polümeraasi termostabiilsusel 3. Milliseid mehhanisme kasutatakse rakus geeniekspressiooni inhibeerimisel antisense DNA oligonukleotiididega? a) Moodustuva antisense oligonukleotiid/mRNA kompleksi katkilõikamine restriktsioonilise endonukleaasiga b) Translatsiooni blokeerimine oligonukleotiidi poolt c) DNA oligonukleotiid/mRNA kompleksi degradatsioon Dicer ensüümi poolt d) RNaasH vahendatud

Biotehnoloogia

pdf

Geneetika eksam

rakku, genoom integreerub peremehe genoomi ja kandub kromosoomi koostisosana tütarrakkudesse. Keskkonnatingimuste muutudes võib lüsogeenne faag minna üle lüütilisse tsüklisse, mille käigus sünteesitakse viiruse partikleid ning pannakse need kokku. Lõpuks rakk lüüsitakse ning uued virionid vabanevad keskkonda, kus nad on võimelised minema nakatama järgmisi peremeesrakke 2. Gripiviiruse muteerumine, rekombinantsed gripiviirused ja nendega seotud ohud Gripiviirus: o Pinnavalgud hemaglutiniin (H) ja neuraminidaas (N) muteeruvad kiiresti – RNA polümeraas teeb palju vigu, mida ei parandata! o Gripiviiruse genoom koosneb 8-st erinevast RNA segmendist, mis pakitakse valkkesta viiruse assambleerimisel o Geneetilise materjali segunemine võib toimuda siis, kui 2 sarnast viirust nakatavad sama rakku Rekombinantsed girpiviirused ja nendega seotud ohud:

Kategoriseerimata

docx

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum ARUANNE Ave Tüür 155356 YAGB41 Kevadsemester 2017 Tallinna Tehnikaülikool Pipeteerimine 8. veebruar I HARJUTUS Eesmärk: Õppida õigesti pipeteerima. Materjalid: Arvutused:  Pesuvahendi kontsentraat Pesuvahendit on vaja: 5,5 ×30  Vesi 100 = 1,65ml  Pipetid ja otsikud 5,5−2 ×1,55=2,4 ( ml )  15ml falkon tuub 2,4 ÷ 0,2=12  1,5 ml tuubid  PCR plaadi tükk Töö käik:  Teen 15-ml falkon tuubi 5,5ml 30% homogeenset pesuvahendilahust  Võtan kaks 1,5ml- tuubi ning pipeteerin mõlemasse 1,55ml lah

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

Rohkem sarnaseid