0,454 0,363 0,270 0,220 0,164 3 tükki jäi vahele Fraktsioonide analüüsimine Koostage kromatogramm, mille y-teljel on optiline tihedus ja x+teljel eluaadi maht, märkides ära Vminx, Vx ja Vmaxx asukohad. Vmin=36ml Vx= 48 ml Vmax= 98ml Dekstraansinine Müoglobiin DNP-aspartaat Vx - Vxmin 48 - 36 Rf = = = 0,21 Vxmax - Vxmin 98 36 Järeldus: Segus sisaldunud komponendid väljusid sellises järjekorras, nende molekulmassi tõttu.
o eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis antud
geeli pooridesse ei mahu
· maksimaalset elueerimismahtu , s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid,
mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad
LIIKUVUSTEGUR (Rf): ---> Rf arvväärtused jäävad vahemikku 0...1 (0
Etüülbenseen 136 860 1,4-dimetüülbenseen e p- 138,4 869 ksüleen 1,2-dimetüülbenseen e o- 144 895 ksüleen Isopropüülbenseen 152 927 3. Leida ainete protsentuaalne sisaldus segus (normalisatsiooni meetod) 4 3 tundmatu aine segu kromatogramm (esimene) ja alkaanide segu kromatogramm (teine): 5 Väljumisaeg %-line sisaldus Retensiooniinde Keemistempera ks tuur 6,774 26.838% 766,79 110,6°C 9,649 36.245 895,07 144°C 10,295 36.918% 930,48 152°C Arvutused:
elueerimistmaht. Ained, mis täielikult difundeeruvad geeli pooridesse, väljuvad kolonnist kõige aeglasemalt ja maksimaalse elueerimismahuga. See on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule. Seega saab protsessi lugeda lõppenuks, kui kolonnist väljunud vedeliku maht võrdub ligikaudu kolonni kogumahuga. Eluaadi fraktsioonides sisladuva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vaheline graafiline sõltuvus on kromatogramm. Tüüpiline kromatografeerimissüsteem:kolonn, eluendi reservuaar ja automaatne fraktsioonikogur. Kolonni ülaosa on suletud korgiga, mida läbib klaastoru, mis ühendatakse kolonnist kõrgeval asetseva eluendi reservuaariga siis algab kolonni väljavoolukraani avamisel kohe eluendi kogumine. Meie töös kasutame: klaaskolonn, mis on eelnevalt täidetud pundunud dekstraangeeliga Sephadex. Kolonn on kinnitatud statiivi külge ja selle alumine osa on täidetud klaasvillaga.Täidise kõrgus
Lõpuks kui kõik värvilisi fraktsioone enam ei tule võib võib prooide kogumise lõpetada. Tulemused ja nende interpreteerimine A. Täidise mark ja materjal=> Sephadex, 675 Täidist iseloomustav pundumistegur=> 0,1 Täidise kõrgus=> 12,5 cm Täidise sisediameeter=> 2,7 cm Täidise kogumaht=> 71.53 cm3 Maksimaalne elueerimismaht=> 64,38 cm3 Fraktsioonide üldarv=> 32,19 B. Kromatogramm A- Müoglobiin B- D-aspartaat C- dekstraansinine V A B C 15,45 0 0 0 17,45 -0,0251 -0,0313 -0,0139 19,45 -0,0271 -0,033 -0,0164 21,45 -0,0168 -0,0225 -0,0055 23,45 0,0718 0,061 0,0783 25,45 0,03087 0,2615 0,2761 27,45 0,03448 0,2845 0,299 29,45 0,1667 0,1349 0,1509 31,45 0,0651 0,0401 0,0522
difundeerumiseks, siis need molekulid liiguvad kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga, mis vastab peaaegu kasutatava kolonni kogumahule. Vx max = Vt Maksimaalse elueerimismahu saab arvutada, kui geelimaatriks on teada: Vx max = Vt - Vg Liikuvustegurit Rf kasutatakse nende ainete iseloomustamiseks, mis suudavad geeli pooridesse difundeeruda ja mille elueerimismaht on kindlaks määratud. Rf = Vx - Vx min / Vx max - Vx min Kromatogramm graafiline sõltuvus aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahel Töö käik Esmalt märkida üles vajalikud andmed ning teha arvutused Täidise mark: Sephadex G75 Täidist iseloomustav pundumistegur k= 0,1 Geelisamba kõrgus L= 25,5 cm Kolonni sisediameeter d= 1,6 cm r= 0,8 cm Voolutuslahuse koostis: 0,15M NaCl Proovi koostis: Dextrane blue 6mg/ml, Müoglobiin 6mg/ml, DNP-aspartaat 0,3mg/ml Arvutasin välja: Vt = r2 * L= 3,14 * 0,64 * 25,5 = 51,27 cm3
· Aine kontsentratsiooni väljendatakse optilise tiheduse väärtusena, mis mõõdetakse vastaval lainepikkusel spektrofotomeetris. · Spektrofotomeetris mõõdetakse segude optilist tihedust järgmistel lainepikkustel: sinised segud 670 nm, kollased segud 410 nm ja pruunikad segud 370 nm. · Täiesti värvusetute fraktsioonide optilised tihedused võrduvad 0-ga ja neid pole vaja mõõta. · Saadud tulemustest koostatakse katseandmete tabel ja selle alusel kromatogramm. Kolonni iseloomustavad parameetrid · Geel: Sephadex G 75 , fraktsioneermispiirkond 3000 80000 Daltonit · Geeli pundumistegur: k = 0,1 · Täidise kõrgus L = 31.5 cm · Kolonni sisediameeter: d = 2,1 cm Proovi komponendid · Dekstraalsinine (6mg/ml) · Müoglobiin (6mg/ml) · DNP aspartaat (0,6 mg/ml) Mõõtmis- ja arvutamistulemused 1. Kolonni täidise maht Vt 2. Geelmaatriksi maht Vg 3. Kolonni maksimaalne elueerimismaht Vx,max 4
ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel · absorptsiooni mõõdetakse spektrofotomeetril · värviliste segude puhu mõõdetakse vaid selliste fraktsioonide absorptsiooni, milles võib täheldada vähimatki värvust · koostatakse 3-veeruline katseandmete tabel, mille alusel tehakse kromatogramm 3. Tulemused A. kolonni iseloomustavad parameetrid Täidise materjal ja mark: Dekstraan, Sephadex G-75 Pundumistegur: k = 0,1 Täidise kõrgus ja kolonni sisediameeter: L = 26,3; d = 1,8 Täidise kogumaht: Vt = 66,93 Geelmaatriksi maht: Vg = k*Vt = 0,1*66,93 = 6,69 Arvutatud maksimaalne elueerimismaht: Vxmax = Vt Vg = 66,93 6,69 = 60,24 Arvutatud fraktsioonide üldarv: n = Vxmax / 2 = 60,24 / 2 = 30,12 (30 fraktsiooni) B. Mõõtmistulemuste tabel ja kromatogramm
kolonni kogumahu:
Vxmax>Vt.
Vxmax saab ka arvutada, teades geelimaatriksi mahtu:
Vxmax=Vt Vg
Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille
elueerimismaht Vx on kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf: ,kus (0
Tulemused ja nende interpreteerimine A. täidise materjal Sephadex G75 k = 0,1 täidise kõrgus L = 24 cm, kolonni sisediameeter d = 2 cm Täidise kogumaht Vt = ·(d:2)2·L = 3,14· (2:1)2·24 = 75,40 cm3 = 75,40 ml kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht V xmax = Vt Vg = 75,407,54= =67,86 ml Fraktsioonide üldarv n = Vxmax/2 = 67,86/2 = 33,93 B. Mõõtmistulemuste tabeli alusel koostatud kromatogramm Kromatogramm 0.67 0.6 0.44 Optiline tihedus, A 0.1 0.07 10 20 30 40 50 60 70 80 -0.4 Eluaadi maht, V, ml
1) kolonni vaba mahtu Vv (=Vxmin) ehk eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu. 2) maksimaalset elueerimismahtu Vxmax ehk eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid, mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad. Liikuvusteguriga Rf iseloomustatakse aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja, mille elueerimismaht on kolonnis kindlaks määratud. Kromatogramm on eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vaheline sõltuvus. 2. Töö käik 1.3 Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine Kontrollisin kolonni vertikaalsust. Märkisin üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex'i margi ja seda iseloomustava teguri k. Sephadex'i mark: G-75 k = 0,1 Mõõtsin geelisamba ehk täidise kõrguse L ja diameetri d, kasutades sobivat joonlauda. L = 17,6 cm d = 3 cm
GK Tundmatu segu analüüs gaasikromatograafia abil Õpperühm: LAAB32 Töö teostaja: Õppejõud: Töö teostatud: 27.10.2020 1 Töö eesmärk Tundmatu segu kvalitatiivne ja kvantitatiivne analüüs gaasikromatograafia abil. 2 Töö käik OSA 1 – Alkaanide (C6 – C12) segu analüüs Viia läbi kromatograafiline analüüs alkaanide seguga. Teades kandegaasi joonkiirus, arvutada t0. Printida välja saadud kromatogramm ja määrata iga alkaani retentsiooniaeg ning arvutada parandatud retensiooniaeg. OSA 2 – Tundmatu segu analüüs ja idintifitseerimine (kvalitatiivne analüüs) Kasutades samu lahutustingimusi viia läbi analüüs tundmatu seguga (teha 3 paralleeli). Tarkvaraabil määrata piigide retentsiooniaeg, pindala (A) ja piigi laius nulljoone juures. Arvutada keskmine väärtus, standardhälve ja suhteline standardhälve retentsiooniaja ja pindala väärtusele. Kasutades alkaanide ja segu
võrdne kolonni kogumahuga). Kui on teada geelimaatriksi maht Vg, siis saab maksimaalse elueerimismahu Vxmax arvutada nii: Vxmax=Vt-Vg. Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx on vaadeldavad kolonnis kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf. Valem on selline: Rf=Vx-Vxmin/Vxmax-Vxmin, kusjuures Rf väärtused peavad jääma vahemikku 0...1. Kromatogramm on eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelise sõltuvuse graafik. Ainete väljumismahtusid näitavad nende fraktsioonide elueerimismahud, milles vastava aine kontsentratsioon on kõige kõrgem. Kromatogrammil on see ,,tipule" vastav maht. Praktikumis kasutatakse klaaskolonne, mis on juba eelnevalt täidetud pundunud dekstraangeeliga Sephadex. Väiksema poorsusega, st tihedamad, Sephadex'i margid on
A. Kasutatud kolonni iseloomustavad parameetrid: täidise materjal - dekstraangeel ja mark Sephadex G-75, k = 0,1 - täidist iseloomustav pundumistegur, täidise kõrgus l = 32 cm ja kolonni sisediameeter d = 1,6 cm, arvutatud täidise kogumaht Vt = 64 cm2, arvutatud maksimaalne elueerimismaht Vxmax = 57,6 cm2, arvutuslik fraktsioonide üldarv n = 29. B. Mõõtmistulemuste tabel ja selle alusel koostatud kromatogramm, st graafiline sõltuvus. Mõõtmistulemuste tabel: Fraktsiooni nr. Elueerimismaht Optiline tihedus, A V, mL Ühendatud fraktsioon 18 0 1 20 0,141 2 22 0,388 3 24 0,064
0,029 Fraktsioonide analüüs Antud töös väljendatakse aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Lainepikkused, millel mõõtmine läbi viiakse, sõltuvad uuritavate ainesegude koostisest ja need soovitab praktikumi juhendaja. Absorptsiooni mõõdetakse spektrofotomeetritel. Koostage kromatogramm, mille y-teljel on optiline tihedus ja x+teljel eluaadi maht, märkides ära Vminx, Vx ja Vmaxx asukohad. Dekstraansinine müoglobiin DNP-aspartaat Vxmin =21 ml Vx= 33 ml Vxmax= 73ml Vx - Vxmin 33-21 Rf = = = 0,230 73-21 Vxmax - Vxmin Järeldused Katse õnnetus enam-vähem
5 0.245 23 65.5 0.293 24 67.5 0.298 25 69.5 0.225 26 71.5 0.136 27 73.5 0.083 28 75.5 0.047 29 77.5 0.026 9. Koostan kromatogramm Sinine graafiku osa kajastab dekstraansinise kontsentratsiooni muutumist, kollane müoglobiini kontsentratsiooni muutumist ja punane DNP-aspartaadi kontsentratsiooni muutumist. Roheline osa graafikust on need proovid, milles uuritavaid aineid ei olnud. Dekstraansinine vüljuv kõige esimesena, kuna see on polüsahhariid ja selle molekulmass on , teisena väljub müoglobiin (molekulmass 16800), kolmandana DNP-aspartaat (molekulmass ~300). 10. Arvutan müoglobiini väärtust:
16 53,5 0,485 360 24 69,5 0,267 25 71,5 0,575 26 73,5 1,028 27 75,5 1,424 28 77,5 1,536 29 79,5 1,317 30 81,5 0,917 31 83,5 0,542 32 85,5 0,275 33 87,5 0,147 Kromatogramm Vxmin Vx Vxmax Vxmin on eluaadi maht, kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni. Vx on eluaadi maht kuni valgu kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni ja Vxmax on eluaadi kogumaht kuni DNA-aspartaadi kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni. Leian liikuvusteguri Rf . V x - v xmin R f = max V x - V xmin 45,5 - 27,5 Rf = = 0,36 77,5 - 27,5 Järeldus:
34 93 0,1918 35 95 0,1342 36 97 0,1223 3 0,8 43 0,7 0,6 83 0,5 0,4 0,3 29 0,2 0,1 0 0 20 40 60 80 100 120 Kromatogramm Järeldused Uuritava segu komponentidest oli kõige suurema molekulmassiga dekstraansinine, mis väljus minimaalse elueerumismahuga. Väikseima molekulmassiga DNP-aspartaat, mis difundeerus geeli pooridesse ning väljus seetõttu maksimaalse elueerimismahuga. Vxmin = 29 ml Vx = 43 ml Vxmax = 83 ml Arvutuste teel saadud Vxmax väärtus oli 83,6 langeb põhimõtteliselt kokku katse tulemusel saadud väärtusega. Järelikult töö on õnnestunud.
Õppejõud: Töö teostatud: Töö kaitstud: 1 Töö eesmärk Tundmatu orgaaniliste ainete segu kvalitatiivne ja kvantitatiivne analüüs gaasi- vedelikkromatograafilisel meetodil. 2 Töö käik Koos praktikumi juhendajaga tutvusime kromatograafi tarkvaraga ja seadistasime vastavalt töötingimustele (split ratio). Kontrollisime aparatuuri valmisolekut tööks. Esimesena analüüsitakse alkaanide (C6 C10) segu. Saadud kromatogramm printisime välja ja määrasime iga alkaani retensiooniaeg. Tarkvaras muutsime seadistused ja tegime sama analüüsi kolm korda (3 paralleeli) tundmatu seguga. Prinditus saadud tulemuse abil määrasime piikide retentsiooniaeg, pindala (A) ja piigi laius nulljoone juures. 3 Tulemused Inertgaasi retentsiooniaeg to = L/µ t0 = 30 m / 45 cm/sek = 3000 cm / 45 cm/sek = 66,667 sek 1,111 min. Alkaanide retensiooniaja ja parandatud retentsiooniaja arvutamine: Retentsiooniaeg tR = to + t'R
Mina kasutasin dekstraani geeli Sefadex G-50, ning kolonni, mis lahutas segusid aeglasemalt ja mitte nii hästi. erineva molekulmassiga ainete üksteisest eraldamise eesmärgil koguti kolonnist väljuvat lahust kindla mahuga fraktsioonidena, ehk siis 2 ml kaupa ja nendes sisalduva aine kontsentratsiooni määramiseks kasutasin optilise tiheduse määramist. Fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nimetatakse kromatogrammiks, antud töös kromatogramm koostatud käsitsi. Kolonnis oli näha kolme värvi(sinine, pruun, kollane), see tähendas, et segus oli 3 erinevat ainet ja need lahutusid üksteisest erineva kiirusega. Fraktsioone tuli kokku 50 ja aega kulus antud töö tegemiseks umbes 3 tundi, koos optiliste tiheduste mõõtmistega. Antud töös nägin, kuidas ainete segu lahutamine sõltub kolonni omadustest, näiteks milline geel seal sees on. Tallinna Tehnikaülikool Biokeemia praktikum
22 61,5 0,4464 23 63,5 0,1631 24 65,5 0,0533 25 67,5 0 Tulemused Kolonni parameetrid · Täidis: Sephadex G-75 · Pundumistegur: k = 0,1 · Täidise kõrgus: L = 32cm ja diameeter: d = 1,7cm · Täidise kogumaht: Vt = 72,63cm3 · Maksimaalne elueerimismaht: Vxmax = 65,357cm3 · Fraktsioonide arv n = 25 Kromatogramm · Teades, et komponentideks olid: 1. Dekstraansinisest 3mg/ml, Mr = 2 · 106 2. Müoglobiinist 6mg/ml, Mr = 1,7 · 104 3. DNP aspartaadist 0,3mg/ml Kuna sinine desktraansinine voolas läbi kolonni kõige kiiremini võib järeldada, et tema molekulmass on suurim. Kahjuks ma DNP aspartaadi molekulmassi ei tea, mistõttu on keeruline oletada, kumb väljus kolonnist enne, kes müoglobiin või DNP aspartaat.
Selleks süstitakse vedelikkromatograafi uuritav proov ning standardlahused. Edasi võrreldakse kromatogrammil proovi ja standardlahuste retentsiooniaegu. Retentsiooniaeg on aeg, mis on vajalik ½ aine koguse elueerimiseks kolonnist. Ainete retentsiooniajad on põhimõtteliselt individuaalsed, s.t. et piigi retentsiooniaja järgi saab kindlaks teha aine, mis sellele piigile vastab (joon. 1). Joon. 1. Tüüpiline kromatogramm Saasteainete kvantitatiivne määramine: Saasteainete kvantitatiivse sisalduse määramiseks kasutatakse välisstandardmeetodeid, kus kaliibrimine teostatakse välisstandardlahustega. Selleks süstitakse kolm standardlahust erineva saasteaine kontsentratsiooniga, kusjuures suurim kontsentratsioon ei tohiks ületada väiksemat üle kolme korra. Tulemuste põhjal tehakse graafik, mille Y-teljele kantakse standardlahuste kontsentratsioon ja X-teljele piikide kõrgused või pindalad
29 360 82 0,436 30 360 84 0,244 31 360 86 0,151 32 360 88 0,116 33 360 90 0,1005 34 360 92 0,093 Kromatogramm Graafikult: Aine 1=Vxmin=30ml Aine 2=Vx=42 ml Aine 3=Vxmax=78 ml Rf= (Vx-Vxmin)/(Vxmax-Vxmin)= (42-30)/(78-30)=12/48=0,25 Kokkuvõte Geelkromatograafia on meetod, mis võimaldab lahutada mitmekomponentseid segusid. Geeli poorid on samades mõõtmetes makromolekulidega. Mina kasutasin dekstraani geeli Sefadex G-75, ning kolonni, mis lahutas segusid küllaltki kiiresti ja korralikult. Erineva molekulmassiga ainete üksteisest eraldamise eesmärgil koguti kolonnist väljuvat
pooridesse, ja siis väljuvad esimesena. Vxmin on võrdne kolonni granulitevahelise mahuga.
Vxmin = Vv
Kõige suurem elueerimismaht on ainetes, mille molekulmass nii väike, täielikult
difundeeruda geeli pooridess. Need liikuvad kolonnis kõige aeglasem. VxmaxVt
Vxmax võiks leida kui on teada Vg. Vxmax=Vt Vg
Rf liikuvstegur . Rf= Vx Vxmin / Vxmax -Vxmin
0
30 82,5 1,444 Vxmax 31 84,5 1,319 32 86,5 1,044 33 88,5 0,62 34 90,5 0,322 35 92,5 0,135 36 94,5 0,054 Kromatogramm: Tulemused ja nende interpreteerimine: Arvutan kogu eluaadi mahu: 22,5 + 2*36 = 94,5 ml. Erinevate värvustega fraktsioonide optilistes tiheduste on nii tõusu kui langust. See näitab ,et aine konsentratsioon kolonnist väljumisel tõuseb, kuni saavutab haripunkti ja langeb ehk lahkub kolonnist. Esimesena väljus kolonnist dekstraansinine, see tähendab et tal esines kõige suurem molekulaarmass. Järgmisena lahkus müoglobiin ja viimasena DNP-aspartaat, mis sisenes
28. 76,65 0,9561 29. 78,65 0,7461 30. 80,65 0,5105 31. 82,65 0,3212 32. 84,65 0,1836 33. 86,65 0,0924 Kromatogramm 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 Kontsentratsioon, A 0.8 0.6 0.4 0.2 0 20.65 30.65 40.65 50.65 60.65 70.65 80.65 90.65 Eluaadi maht, ml
22 0,176 64 23 0,0358 66 Oma vihikusse olin ma praktikumi ajal nii kirjutanud. Fr 15 ja 16 paistsid olevat värvusetud ning ma ei hakanud neid mõõtma. Mõõtmisi min tehes ma ei mõelnud, milline võiks mu kromatogramm välja näha. Pidasin tähtsaks, et saan kätte Vx , Vx, Vxmax. Vx Vxmin=Vv=24 ml. Eluaadi kogumaht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga Vxmax fraktsiooni väljumiseni. Vxmin Dekstraansinise elueerumismaht on võrdne kolonni vaba mahuga, kuna tema molekulmass on 200 kDa ning ta ei mahu geeli pooridesse ja liigub pooridevahelisel alal, kuivõrd antud geeli
1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 Optiline tihedus (A) 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Eluaadi maht (V,ml) Graafik 1. Kromatogramm Järeldus Kromatogrammi pealt on näha kolm tippu, mis seletab ainete kolonnist väljumise järjekorda. Esimesena väljus kõige suurema molekulmassiga aine – dekstraansinine, seejärel müoglobiin ning siis väikseima molekulmassiga aine – DNP-aspartaat. Dekstraansinise molekulid ei mahtunud kolonni täitva geeli pooridesse. Müoglobiini molekulid difuneerusid geeli pooridesse rohkem ning DNP-aspartaadi molekulid difundeerusid geeli pooridesse täielikult.
kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv Väikese molekulmassiga ained liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax. Maksimaalne elueerimismaht on võrdne kolonni kogumahuga Vt. Vxmax ~ Vt Liikuvustegur Rf iseloomustab aineid, mis on võimelikud difundeeruda geeli pooridesse. min Vx - Vx R f = max min Vx - V x Kromatogramm on eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vaheline graafiline sõltuvus. Töö käik Kolonni iseloomustramine ja ettevalmistamine: · Kontrollin kolonni vertikalsust. On vertikaalne. · Märgin üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex'i mark ja seda iseloomustav tegur k , mille väärtus sõltub kasutatava geeli pundumisastmest. Sephadex G-75, pundumistegur k= 0,1.
Optiline tihedus näitab lahuse kontsentratsiooni, sest võrdleb proovile suunatava valguse intensiivust proovi läbiva valguse intensiivsusega. Mida kontsentreeritum on uuritav lahus, seda enam valgus seal neeldub. 9. Millistest teguritest sõltub teatava lainepikkuse juures mõõdetud optilise tiheduse väärtus (avaldis vastavalt Beer'i seadusele)? A = l c (küveti pikkus, lahuse kontsentratsioon, uuritava aine ekstinktsioonitegur antud lainepikkusel) 10. Mis on kromatogramm ja millist informatsiooni see annab uuritava segu koostisekohta? Kromatogramm on aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vaheline graafiline sõltuvus. Sealt on näha iga aine elueerimismahud ning ainete kontsentratsiooniline jaotus lahuses. 1. Millistesse gruppidesse võib karotenoidid jaotada ja mille poolest need grupid erinevad? Karoteenid hapnikku mittesisaldavad ühendid, mis koosnevad ainult süsinikust ja vesinikust Ksantofüllid sisaldavad hapnikku. (Luteiin, zeaksantiin) 2
Tekib tasakaal liikuvas ja liikumatus faasis olevate molekulide vahel. Järgmisena transporditakse esimese taldriku liikuva faasi sisu teise taldrikusse ja esimese taldriku liikuva faasi ruumi täidab puhas liikuv faas. Tekib uus tasakaal. Kolmandana transporditakse teise taldriku liikuvas faasis sisalduvad komponendid kolmanda taldriku liikuvasse faasi ja esimese taldriku liikuva faasi vastav sisu transporditakse teise taldriku liikuva faasi ruumi. 4. Kuidas tekib kromatogramm? Kromatogramm - signaali intensiivsus vs aeg. 5. Kromatograafilise piigi kuju Kromatograafiline piik kirjeldab analüüdi kontsentratsiooni väärtuse jaotust tsooni tsentri suhtes. Ideaalis on piigi kuju sümmeetriline ja kirjeldatav Gausse funktsiooniga. Reaalsetes eksperimentides on aine piik sageli asümmeetriline. 6. Aine tsooni laiust määratavad faktorid Aine tsooni laiust määratavad faktorid - molekulide erinevad teepikkused kolonnis; tsooni
31 85 0,705 32 87 0,305 33 89 0,121 34 91 0,064 35 93 0,029 36 95 0 37 97 0 Kromatogramm Kromatogrammi järeldused Kõige kiiremini elueerunud aine, dekstraansinise elueerumisprofiil on kujutatud sinisega. Dekstraansinine väljub esimesena, sest selle molekulid on liiga suured, et mahtuda geeli pooridesse. Minimaalne elueerimismaht ehk maht, mille juures väljub dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktisioon, on 29 ml. Järgmiseks on punasega kujutatud müoglobiini elueerumisprofiil. Tegu on geeli pooridesse osaliselt difundeeruvate molekulidega
muutustega (tagajärg). · Arvutitoksikoloogia (Ränimeetod) Hääletu kevad Rachel Carson, 1962 Esimene bioloogilise mitmekordistumise käsitlus ja teavitamine üldsusele Toksiliste ainete keemiline määramine Spektrofotomeetria, fluorimeetria, vedelikkromatograaf HPLC, gaaskromatograaf GC, mass- spektromeeter MS A 16 prioriteetse PAH-I kromatogramm Fen BaA + Chr Anaphtene +F B(b)F B(k)F Flo B(a)P B(ghi)P N Anaphtylene P D(ah)A I(123)P S Vesi Vesi/heljum 1:5000 Heljum PAHid ahvena lihastes ja PAHide akumulatsiooni suhe ahvena organismi ja sette vahel
Tulemused ja nende interpreteerimine: Kolonni iseloomustavad parameetrid. Täidise mark ja materjal: Sephadeks G-75 Pundumistegur k: k=0,1 Täidise kõrgus: 32,7 cm Kolonni sisediameeter: 2,2 cm Täidise kogumaht : 124, 26 Maksimaalne elueerimismaht : 111,834 Fraktsioonide üldarv: 55,917 56 Uuritav lahus oli D. Kromatogramm. Kõige esimesena väljus kolonnist dekstraansinine , selle osakesed olid väga suured ja ei mahtunud geeli pooridesse. Dektraansinine on nendest kolmest ainest kõige väiksema molekulmassiga. Dekstraansinise kontsentratsioon uuritavas lahuses oli kõige väiksem. Teisena väljus kolonnist müoglobiin , mille osakesed difundeerusid geeli pooridesse osaliselt. Müoglobiini kontsentratsioon uuritavas lahuses oli kõige suurem.
● Ioonide sisaldus analüüsitud proovis. Vase, hõbeda, elavhõbeda, tsingi, kaltsiumi, naatriumi, kaaliumi, ammooniumi, plii ioonide määramine. ● Anioonide määramine (fluoriidid, kloriidid, bromiidid, jodiidid) 39.Kromatograafia definitsioon Kromatograafia - ainete segu komponentideks lahutamine. Teostatakse kolonnis, mis on täidetud statsionaarse faasiga ja läbi mille voolab mobiilne faas. 41. Kuidas tekib kromatogramm? 42. Kromatograafilise piigi kuju 43. Aine tsooni laiust määratavad faktorid 45. Palun defineerige: retentsiooniaeg, retentsiooniruumala, surnud aeg 46. Mida näitab asümmeetriafaktor? 47. Protsessi lahutuvus (definitsioon, valem) 48. Mahtuvusfaktor (definitsioon, valem) Mahtuvusfaktor näitab kui tugevasti analüüt interakteerub statsionaarse faasiga. 49. Selektiivsus (definitsioon, valem)
81. Absoluutse ja suhtelise meetodi võrdlus. Tooge näiteid! 82. Kalibreerimisgraafiku ja lisamismeetodi võrdlus. 83. Titrimeetria põhimõte. Titrimeetria-kvantitatiivse koostise määramine ehk mahtanalüüs. 84. Võrrelge omavahel titrimeetrilist ja gravimeetrilist analüüsi. 85. Kromatograafia põhimõte. Kromatograafia on sisuliselt meetodite grupp segudes ainete eraldamiseks uksteisest. Kromatograafia on enam-vahem koige voimsam segude analuusimise vahend, mis olemas on. 86. Mis on kromatogramm ja kuidas saab leida aine hulka kromatogrammilt? Kromatogramm on kromatograafi registreerimisseadme väljund graafiliselt paberil või numbrilisel kujul ja näitab kromatograafiliselt lahutatud komponentide suhtelist sisaldust proovis. Piigi asukoht kromatogrammil näitab aine kolonnist väljumise aega ja piigi suurus näitab, kui palju komponenti proovis on. 87. Kuidas saaks kasutada kromatograafilist meetodit? Pinnanähtused ja adsorptsioon 88. Kolloidsüsteemide jaotus. 89
kolonnis üksteisest kuna nad interakteeruvad erineval määral liikuva ja liikumatu faasiga ). Ained eraldatakse nende adsorptsiooni- või jaotusomaduste erinevuste järgi. Moodsad seadmed lisaks eraldamisele ka detekteerivad eraldatud ained ja mõõdavad nende sisalduse proovis, seega on tegemist mitte lihtsalt eraldmise vaid täieliku määramise meetodiga. Kromatograafia on enam-vähem kõige võimsam segude analüüsimise vahend, mis olemas on. 79. Mis on kromatogramm ja kuidas saab leida aine hulka kromatogrammilt? Kromatogramm on kromatograafi registreerimisseadme väljund graafiliselt paberil või numbrilisel kujul ja näitab kromatograafiliselt lahutatud komponentide suhtelist sisaldust proovis. Kromatograafilise kolonni väljundis registreeritakse detektori signaal. See signaal töödeldakse registraatoris ja tulemus esitatakse tavaliselt komponentide kontsentratsiooni ajalisele muutusele vastavate kolmnurgasarnaste piikidena (dc/dt)
intervallide tagant, analüüsi lõppedes on olemas igale ainele vastavad massispektris, mida võrreldakse kataloogis olevatega. Puudus: kõrge hind MS-le, kataloogide ebatäielikkus. Kahemõõtmeline (2D) kromatograafia Täielik GC (2D comprehensive GC), esimesest kolonnist väljuv effluent suunatakse perioodiliselt teise kolonni, mis on ühendatud läbi modulaatori (mehhaanilised klapid, sorptsioon/desorptsioon via temperatuur). Saadakse pikk ühemõõtmeline kromatogramm, organiseeritakse 2D pildiks. Kasutatakse keeruliste seguse analüüsiks. Esimese kolonni aeglahutus võrdub teise kolonni lahutusajaga. Rõhu ühikud Briti ja meetrilistes süsteemides 1 atm 760 mm Hg 1 at - 1 kg/cm^2 Pa=N/m^2 1 bar=0,987 atm=1,02 at=10^5 Pa=14,5 psi 1 pound=0,453 kg 1000 psi = 70 bar, 100 bar=1450 psi atm=psi/14,5 Elektroforeesi nähtus ja kapillaarelektroforees Laetud osakeste liikumine elektrivälja mõjul. Lahutumine põhineb
63. Tahkefaasiekstraktsiooni põhimõte. Kasutatakse Proovide kontsentreerimiseks ja puhastamiseks 64. Titrimeetria põhimõte. Kvantitatiivse koostise määramine ehk mahtanalüüs 65. Võrrelge omavahel titrimeetrilist ja gravimeetrilist analüüsi. Gravimeetriline analüüs - sademe tekke mõõtmine 66. Kromatograafia põhimõte. Kromatograafiat kasutatakse ainete puhtuse kontrollis, keskkonnareostuste määramisel, keemiliste protsesside kontrolliks jne. 67. Mis on kromatogramm ja kuidas saab leida aine hulka kromatogrammilt? Kromatograafi detektori signaali regisreerimisseadme väljud graafiliselt paberil või numbrilisel kujul. Tabaliselt registreeritakse kolonnist väljumisel komponentide kontsentratsiooni ajalisele muutusele vastavavad piigid 68. Kuidas saaks kasutada kromatograafilist meetodit? Analüüs – segudest komponentide eemaldamine nende tuvastamiseks, prooviks on väikesed kogused
· Kromatograaf kompleksne seade, mida kasutatakse ainete segu kromatograafiliseks lahutamiseks koos tulemuste registreerimisega. · Kromatografeerimine ainete lahutamise protsess mingi kromatograafilise meetodi abil. · Kromatograafiline kolonn metallist, klaasist või kvartsklaasist kolonn, milles on liikumatu faas ja milles toimub segu komponentide lahutumine. · Kromatogramm kromatografeerimisprotsessi visuaalne väljund, reeglina kolonnist väljuvate komponentide kontsentratsioonide ja retentsiooniaja vaheline sõltuvus; geelkromatograafias ainete kontsentratsioonide ja eluaadi mahu vaheline sõltuvus. · Liikumatu faas ehk statsionaarne faas kromatograafilise kolonni tahke peeneteraline täidis või täidisele (kandjale) kantud vedelik
tea. Sel juhul identifitseeritakse aine retentsiooniaja järgi eelnevalt peab vastava aine I don't want to know the answers, I don't need to understand retentsiooniaeg teada (määratakse tunnusaine abil). Massispektromeetriline detektor võimaldab sageli aineid identifitseerida ka ilma tunnusaineta. Kui kolonni otsa on ühendatud detektor, mis on tundlik lahutatavate ainete suhtes, siis saab detektori signaali ajas registreerida: saadakse kromatogramm. Igale individuaalsele ainele vastab maksimum piik. Õnnestunud kromatografeerimise korral on kõikide analüütide piigid üksteisest lahus. See "lahkusaamine" ongi sageli üks põhilisi probleeme kromatograafia juures. Enamus detektoreid on identifitseerimist mitte võimaldavad, st nende abil näeb, et tekkis piik, s.t. kolonnist väljus aine, aga ei ole võimalik saada infot, mis aine see on. Sellisel juhul identifitseeritakse aine retentsiooniaja tR järgi
ühel plaadil. Kui proovid on identsed, on laikude valiums ühesugune ja neil on võrdsed Rf väärtused. Segu kui tegu on sama ainega, siis peab kromatogrammil ilmuma vaid üks laik. Kromat-seks tuleb valida selliseid tingimused (sorbendi materjal ja eluendi koostis) et Rf väärtus erineks nullist (aine ei lahku stardijoonelt) ja ühest (aine liigub frondijooneni). Lisanditel ja põhiainel peavad olema erinevad Rf väärtused. KROMATOGRAMMI ANALÜÜS. Kromatogramm kõver, mis moodustab rea piike nii palju pike, kui palju oli uuritavaid aineid. Esimene piik on liikumatu faasiga mitteseondunud aine piik. Retensiooniaeg (tR) aeg, mis kuulub proovi viimisest kolonni kuni piigi maximum kromatogrammil ilmumiseni. Sõltub liikuva faasi liikumiskiirusest. Surnud aeg (t0) aeg, mil proov oli kolonnis lahustutuna liikuvas faasis kuid pole sorbeerunud liikumatule faasile. Korrigeeritud aeg (t`R = tR t0)
Absorptsioonspektroskoopia baseerub Lambert'i ja Beer'i seadustele, mida kirjeldavate võrrandite kombineerimisel on saadud järgmine võrrand: I = Io 10 - c l , kus I proovi läbinud valguse intensiivsus, Io langeva valguse intensiivsus. Selle võrrandi teisendamise ja logaritmimise teel on saadud Lambert-Beer'i võrrand üldtuntud kujul: 16 A = log Io / I = l c 10. Mis on kromatogramm ja millist informatsiooni see annab uuritava segu koostise kohta? Eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nimetatakse kromatogrammiks 2.2 KAROTENOIDIDE IDENTIFITSEERIMINE JA SISALDUSE MÄÄRAMINE 1. Millistesse gruppidesse võib karotenoidid jaotada ja mille poolest need grupid erinevad? Karoteenid - hapnikku mittesisaldavad molekulid, koosnevad süsinikust ja vesinikust;
kolonnist läbi liikuvad molekulid absorbeeruvad-desorbeeruvad või adsorbeeruvad- desorbeeruvad. Mobiilne faas – vedelik (eluent) või gaas (kandegaas), mis läbi kolonni voolates uuritavaid aineid edasi kannab. Retentsiooniaeg – aeg, mis kulub aine sisestamisest tema piigi maksimumi väljumiseni kromatogrammil Kui kolonni otsa ühendatud detector, mis on tundlik lahustatavate ainete suhtes, siis saab detektori signaali ajas registreerida: saadakse kromatogramm. Igale individuaalsele ainele vastab maksimum – piik. Õnnestunud kromatografeerimise korral on kõikide analüütide piigid üksteisest lahus. Meetodid: mobiilse faasi järgi: vedelik-kromatograafia; gaasikromatograafia. vastasmõju järgi: adsorptsioonkromatograafia; jaotuskromatograafia; ioonkromatograafia: … tehnilise teostuse järgi: kolonnkromatograafia; planaarkromatograafia Meetod komponentide eraldamiseks ainete segust. Kromatograafilise analüüsi jaoks
erineval määral liikuva ja liikumatu faasiga) Ained eraldatakse nende adsorptsiooni- või jaotusomaduste erinevuste järgi Moodsad seadmed lisaks eraldamisele ka detekteerivad eraldatud ained ja mõõdavad nende sisalduse proovis, seega on tegemist mitte lihtsalt eraldmise vaid täieliku määramise meetodiga Kromatograafia on enam-vähem kõige võimsam segude analüüsimise vahend, mis olemas on 100. Mis on kromatogramm ja kuidas saab leida aine hulka kromatogrammilt? 101. Kuidas saaks kasutada kromatograafilist meetodit? Pinnanähtused ja adsorptsioon 102. Kolloidsüsteemide jaotus. 103. Kolloidsüsteemide tekke tingimused. 104. Koagulatsioon. 105. Valguse hajumine disperssetes süsteemides. 106. Mitselli ehitus. 107. Pindaktiivsed ained ja nende struktuur. 108. Pindpinevus. 109. Mis faktoridest sõltub pindpinevus? 110. Mis on adsorbtsioon? Kuidas seda liigitatakse? 111. Gibbsi adsorptsioonivōrrand
lahutatakse kolonnis üksteisest kuna nad interakteeruvad erineval määral liikuva ja liikumatu faasiga ). Ained eraldatakse nende adsorptsiooni- või jaotusomaduste erinevuste järgi. Moodsad seadmed lisaks eraldamisele ka detekteerivad eraldatud ained ja mõõdavad nende sisalduse proovis, seega on tegemist mitte lihtsalt eraldmise vaid täieliku määramise meetodiga. Kromatograafia on enam-vähem kõige võimsam segude analüüsimise vahend, mis olemas on. 86. Mis on kromatogramm ja kuidas saab leida aine hulka kromatogrammilt? Kromatogramm on kromatograafi registreerimisseadme väljund graafiliselt paberil või numbrilisel kujul ja näitab kromatograafiliselt lahutatud komponentide suhtelist sisaldust proovis. Kromatograafilise kolonni väljundis registreeritakse detektori signaal. See signaal töödeldakse registraatoris ja tulemus esitatakse tavaliselt komponentide kontsentratsiooni ajalisele muutusele vastavate kolmnurgasarnaste piikidena (dc/dt). Ainete
annaabi.ee 
