DNA lõikude eraldamine, lõikude eraldamine, töötlemine in töötlemine in vitro ja vitro ja siirdamine sama või muu siirdamine sama või muu liigi liigi isendi geneetilisse struktuuri- isendi geneetilisse struktuuri kromosoomi, plasmiidi või kromosoomi, plasmiidi või viirusesse(geenide ülekanne). viirusesse(geenide ülekanne). Rekombinantne DNA DNA Rekombinantne DNA DNA molekul, milles on ühendatud molekul, milles on ühendatud eri eri liikidelt pärit DNA osad. liikidelt pärit DNA osad. Rakkudesse viiakse võõraid Rakkudesse viiakse võõraid geene viirusvektori abil, plasmiidse geenivektoriga, geene viirusvektori abil, Agrobakteriga, DNApüssiga plasmiidse geenivektoriga,
happebakter,metaan-orgaaniliseaine lagundaja tekib prügimägedes,äädikhape- bakter.Priioni teket määrab organismi enda geen, mis on meis kõigis olemas juba. AGa enamusel pole priionvalgu defektset vormi Intronid mittekodeeritav geeni osa, st.transkribeeritakse, kuid lõigatakse välja (RNA splasingu käigus). Ekson-on see osa geenist mida saab kodeerida, see kodeeritakse valguks Plasmiid-väiksemad DNA rõngad, mida kasutatakse geenivektorite loomisel. Rekombinantne DNA-nim DNA molekuli, milles on ühendatud eri liikidelt pärit DNA-fragmendid. RNA splaising protsess, mille käigus lõigatakse RNA molekulist välja intronjärjestused, tekib mRNA (järelikult kopeeritakse see eksonitelt). Valkude splaising: pärast translatsiooni korraldatakse ümber peptiidijärjestusi, ka eemaldatakse.Valk valmib lõplikult (mäletatavasti on organismi valgud enamasti veel ka kõrgemat järku struktuuritasemena).Geenitehnoloogia meetodeid:1.rakkudesse
kasutatakse kindlate fragmentide (geenide) paljundamiseks, uurimiseks ja siirdusmaterjali saamiseks. RNA splaising- RNA transkriptist eemaldatakse intronid ja liidetakse eksonid PÖÖRDTRANSKRIPTSIOON- geneetilise info ülekanne RNA-lt DNA-le. DNA süntees RNA järgi, tekib cDNA. DNA sekveneerimine- protsess, mille käigus selgitatakse DNA nukleotiidne järjestus 3. Geenivektor, selle loomise protsess, ligaas, restriktaas (ja tekkivad „kleepuvad otsad"), rekombinantne DNA. Õp lk 37 – 39. Plasmiid. Viirusvektor, plasmiidne geenivektor. - õp lk 38. Rekombinantne DNA- DNA molekul, milles ühendatud eri liikidelt pärit DNA-fragmendid. RESTRIKTAAS- ensüümid, mis lõikavad DNA molekuli kaksikahelat kindlate järjestuste kohalt. Enamik lõikab DNA mõlemat ahelat vastava järjestuse eri otstest. Kui sama restriktaasiga töödelda erinevat päritolu DNA-d, siis on tekkinud fragmentidel komplementaarsed üheahelalised (kleepuvad otsad)
transformeerida bakteri rakku. DNA replikatsioon toimub seal sõltumatult peremeesraku kromosoomi(de)st. 3. Individuaalsete rakukolooniate (kloonide) saamiseks külvatakse transformeeritud rakud välja selektiivsele (agar)söötmele. Viiruse või plasmiidi replikatsioonil tekib rohkem kui 10 identset viiruse või plasmiidi DNA molekuli. Sama koefitsendiga paljundatakse ka rekombinantset DNAd. 4. Rekombinantsete kloonide eraldamine -Selektiivsöötmel kasvatatud kloonidest eraldatakse rekombinantne DNA. Esimesena näitasid pärilikkuse funktsionaalse ühiku ühest organismist teise ülekandmise võimalikkust Stanley Cohen, Herbert Boyer ja nende kaastöölised (Stanfordi ja California Ülikoolidest) 1972 -1973. aastal DNA kloonimine võimaldab: huvipakkuvate DNA fragmentide piiramatus koguses paljundamist geeniproduktide, enamasti valkude tootmist uurida geeni struktuuri, funktsiooni Kloonimise etapid 1. ,,Reproduktiivne
2. 1. 3. a b c d e Joonis II 1. Mida tehakse punktides 1 ja 3? 1. Restriktaasiga lõigatakse DNA lahti; 3.siiratakse DNA lõik 2. Mida tehakse punktides 2 ja 4? 2. Sobiv geen lõigatakse välja; 4. Ühendatakse DNA ligaasiga 3. Milleks kasutatakse loodud geenivektorit? Et erinevaid geene erinevatele organismidele ülekanda 4. Kas loodud geenivektor on rekombinantne? Jah 5. Mis põhimõttel ühinevad ,,kleepuvad otsad"? Komplementaarsuse prentsiibil II 1. 2. 3. 4. Joonis III 1. Mida tehakse joonisel punktis 2? Geeni siirdamine mikropipetiga viljastatud munarakku 2. Mida tehakse joonisel punktis 3? Embrüo siirdamine looma emakasse 3. Kas punktis 5 olevad isendid on geneetiliselt identsed? Ei, neil on olemas ainult punktis 2 siirdatud geen 4
restriktaastehnika Rekombinantse DNA loomise restriktaastehnika Sama restriktaas tunneb ära sama järjestuse DNA eri molekulides Restriktaas "lõikab" DNA ahelad pooleks nii, et tekivad "kleepuvate" otstega DNA lõigud Eri päritolu DNA lõigud viiakse lahuses kokku; lõigud ühinevad komplementaarsuse alusel; kleepuvate otste vahele tekivad vesiniksidemed Ensüüm ligaasi abil ühendatakse eri päritolu DNA lõigud omavahel kovalentsete sidemetega kokku - tekib rekombinantne DNA molekul Geeninokaut 1. Geenivektor (vigane 5. Tekib kimäärne embrüo geen+marker) viiakse 6. See embrüo viiakse hiire embrüonaalsetesse tüvirakkudesse. hiire emakasse 2. Vektor satub ristsiirdega 7. Sünnivad kimäärsed genoomi. hiired (neid hoitakse) 3. Selektiivsöötmel jäävad 8. Järgneva ristamise
· Geenivektoriteks on o Bakteri plasmiidid o Viirused o Geene sisestatakse ka kullapüstoliga, taimedesse Agrobakteriga · Geenide ülekandmine on võimalik restriktaaside abil o Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks- need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad- ,,kleepuvad otsad" o Selliste otstega DNA juppe on komplementaarsuse tõttu võimalik liita o Erinevate DNA-de liitmisel saadakse rekombinantne DNA · Kuidas aru saada, et soovitud geen on üle kandunud? o Üle viidavale geenile on markergeen külge pandud · Näiteks kasutatakse GFP (helenduv) geeni markerina o Kui uuritava geeni lõppu, enne stopp-koodoneid, on sisetatud GFP geen, siis vastava valgu süntees ei peatu enne, kui tka GFP-valk on valmis. · Nii saab üle viidud geeni avaldumist organismis kindlaks teha · Helenduv kärss · GM-bakterid toiduainetetööstuses
segu, mida kasutati hobuste ergutamiseks. Sõna "doping" tuleneb sõnast "dop", mis kuulub ühte Kagu-Aafrika dialekti. Nii nimetasid selle suguharu liikmed uimastavat jooki, mida tarvitati stimuleerijana kombetalituste ja tantsude ajal. Kasutatavad lühendid EPO erütropoetiin ( http://www.pbs.org/wnet/secrets/features/doping-for-gold/ ) ( glükoproteiin, mis stimuleerib erütrotsüütide loomet punases luuüdis ) rEPO rekombinantne EPO ( geneetiliselt toodetud endogeense hormooni koopia ) HBOC Hemoglobiin põhised hapniku kandjad Keelatud meetodite ja ainete nimekiri ( http://www.telegraph.co.uk/sport/othersports ) 1. Keelatud ained: *S2 Hormoonid ja nendega seotud ained EPO 2. Keelatud meetodid: *M1 Organismi hapnikuga varustamist soodustavad meetodid: a. vere või erütrotsüütide ülekandmine b
daltonismi põdev mees saavad erimunakaksikud. Kui suur on tõenäosus, et üks neist kannab edasi daltonismi ja teine põeb lihasdüstroofiat? 0.125 Geenide aheldumine Geenide kalduvus koos päranduda, kui nad on üksteisele kromosoomis lähedal. Tõenäosus, et geenid ristsiirduvad koos, on seda suurem, mida lähemal nad üksteisele on. Sentimorgan (cM) või genetic map unit (m. u.) 1 ristsiirde tulemus 100st on rekombinantne Rekombinantsussagedus (recombinant frequency, RF) 1 cM = 1% NB! Ei ületa kunagi 50% Ülesanne! Põselohkusid ja attached kõrvalestasid määravad geenid on üksteisest 2 cM kaugusel. Nii ema kui isa on mõlema tunnuse suhtes heterosügoodid. Milline on tõenäosus, et neil sünnib põselohkude, kuid normaalsete kõrvalestadega tütar? 0.0025 Aitäh, et kuulasite ja kaasa töötasite (loodetavasti)!
Lammas Dolly oli esimene edukas tuumkloonitud imetaja. Mida nimetatakse geenivektoriks ja kuidas seda tehakse ? Geenivektor on siiratav geen ühendatud sellisesse DNA- või RNA-kompleksi, mis saab siseneda rakku ja integreeruda selle genoomi. Plasmiidi ja DNAd töödeldakse sama restriktaasiga, et lõigata need katki samasuguse nukleotiidjärjestuse kohalt. Saadud DNA lõik liidetakse plasmiidiga ligaasi abil ning rekombinantne plasmiidne geenivektor on loodud. Mille poolest erineb embrüonaalkloonimine tuumkloonimisest ja mis tekitas tugeva eetilise vastuseisu tuumkloonimisele ? Embrüonaalkloonimine seisneb embrüote lõhestamises. See on loomuliku protsessi tehnoloogiline teisend ning kõik lõigustusrakud on võimelised arenema normaalseks tervikorganismiks. Tuumkloonimine seisneb somaatilise keharaku tuuma viimises munarakku, mille oma tuum on eemaldatud
tuvastamiseks ( DNA sõrmejälgede meetod ). Mis tahes transgeense organismi loomisel kasutadakse rekombinatse DNA loomise restritaas tehnikat. Restriktaas on ensüüm bakterites mis kaitseb neid viiruste eest. Ta lõikab viiruse genoomi (DNA) lõikudeks. Sama restriktaasi saab kasutada üldse DNA lõikamiseks. Tekivad kleepuvate otstega DNA lõigud. Need viiakse lahusesse, kus nad ühinevad komplement taarse alusel A=T; G=C. Ligaas on ensüüm, mis ühendab eri päritolu lõigud. Tulemuseks on rekombinantne DNA. Pöördtranskriptaas on ensüüm, mis leiab kasutamist siis kui mRNA pealt sünteesitakse komplementaas cDNA-d. G-moode loomisel kasutadakse kõige enam eesmärgiks rekombinantse viimine nendesse. Pakterid, viirused ja pärmseened paljunevad kiiresti. Neil on kerge tungida peremeesrakku. Selliseid DNA konstrukte e konstrueeritud DNA-sid nim geeni vektoriteks e siirdajateks. Nendest esimesed loodi 1970 aastatel.
Selline replikon viiakse sobivasse peremeesrakku ja paljundatakse seal. Varasemal ajal mõeldi kloonimise all just seda meetodit. Rakuline kloonimine koosneb neljast põhietapist: 1. Rekombinantsete DNA molekulide konstrueerimine in vitro Meile huvipakkuva geeni fragment, e. insert (võõr-DNA), sisestatakse ligeerimisel isereplitseeruva geneetilise elemendi (replikoni), enamasti plasmiidi või viiruse DNA genoomi e. vektorisse. 2. Transformatsioon. Selle tulemusel saadakse uus rekombinantne DNA molekul, mis on võimeline sisenema (näit. viirusena) või mida on võimalik sisestada e. transformeerida bakteri rakku. DNA repli-katsioon toimub seal sõltumatult peremeesraku kromosoomi(de)st. 3. Selektiivne paljundamine. Individuaalsete rakukolooniate (kloonide) saamiseks külvatakse transformeeritud rakud välja selektiivsele (agar)söötmele. Viiruse või plasmiidi replikatsioonil tekib rohkem kui 1012 identset viiruse või plasmiidi DNA molekuli.
2)Puudulik soojusregulatsioon (00008), mis on seotud haigusega, millest annab tunnistust normaalsest kõrgem kehatemperatuur. 3) Akuutne valu(00132), mis on seotud bioloogilise (infektsioon) kahjuteguriga, millest annab tunnistust enesele keskendumus. Profülaktika Tõhusa vaktsiini väljatöötamist on takistanud piiratud teadmised viiruse bioloogiast ja immunoloogiast, samuti vähesed kogemused immuunkomprimeeritute vaktsineerimisel. Praeguseks on välja töötatud rekombinantne EBV kapsiidi valku glükoproteiini 350 sisaldav vaktsiin, millega korraldatud uuringud on näidanud vaktsiini ohutust ja immunogeensust. Küll ei hoia vaktsiin ära haigestumust, kuid leevendab haiguse kliinilisi sümptomeid (22). Hiljuti Grimmi jt läbiviidud prospektiivne uuring USA üliõpilastel näitas, et glükoproteiin 350 vastaste antikehade hulk seerumis korreleerus pöördvõrdeliselt haiguskulu raskusega (4).See tulemus toetab veelgi uuringus
nimetatakse restriktsiooni aladeks. Selliseid ensüüme on leitud bakteritest kaitsmaks neid kahjulike viiruste eest. DNA kloneerimine baseerub restriktaaside avastamisel. DNA järjestuse äratundmine varieerub erinevate restriktaaside vahel, lõigates tekivad eri pikkusega “kleepuvad” üleulatuvad osad. “Kleepuvad” üleulatuvad osad võivad olla nii peaahelal kui “komplementaarsel” ahelal. Selliste otstega DNA ahelaid on komplementaarsuse tõttu võimalik mugavalt liita, tekib rekombinantne DNA. Restriktaasid on ensüümid, mis katkestavad hüdrolüüsi fosfordiester sidemel, tunnevad ära 6 järjestust iga restriktaas tunneb erineva. DNA kloneerimise etapid. Peremeesorganismi ja kloonimisvektori valik Vektor-DNA ettevalmistamine Kloonitava DNA ettevalmistamine Rekombinantse DNA sünteesimine ligatsiooni abil Rekombinantse DNA sisendamine peremeesorganismi Rekombinantide selekteerimine Rekombinantide analüüsimine Etapp 1
Edasi oma töös kasutan 6-nda kolooniat. Lisaülesanded: 2.1) Võrdle antud transformatsiooni protokolli (mis on kasutusel GTI Molekulaarbioloogia laboratooriumis) DNA kokaraamatus tooduga. Millised on erinevused? Me teeme transformatsiooni 37 kraadi juures, Sambrook´i raamatus 42 kraadi juures. 2.2) Millisel juhul võib bakterikoloonia sisaldada rekombinantset plasmiid, kuid samas koloonia värvus on ikka sinine. Kuidas määrata, et selles koloonias on rekombinantne plasmiid? Bakterikoloonia võib sisaldada rekombinantset plasmiid, kuid samas koloonia värvus on ikka sinine, juhul, kui insert on väga väike ja ei muuda lugemisraami või kui järjestuses ei ole Stop-koodonit. PCR, ühe või teise praimeriga sekveneerida järjestus, restriktsiooniga on võimalik määrat ,et selles koloonias on rekombinantne plasmiid. 5 2.3) Mis juhtub, kui jätta Amp panemata? Meie bakterid on resistentsed Amp-le
GEENITEHNOLOOGIA Geenitehnoloogia molekulaargeneetika rakendusharu, DNA-fragmentide siirdamine rakkude ja organismide geneetilise informatsiooni muutmiseks või nende kasutamine pärilike haiguste diagnoosimisel ja indiviidide geneetilisel tuvastamisel. Geenitehnoloogia seisneb DNA valitud lõikude eraldamises, töötlemises in vitro ja siirdamises sama või muu liigi isendi geneetilisse struktuuri kromosoomi, plasmiidi või viirusesse. Rekombinantne DNA DNA molekul, milles on ühendatud eri liikidelt pärit DNA- fragmendid. Restriktaas bakteritel esinev endonukleaaside hulka kuuluv ensüüm, mis katkestab DNA kaksikahela kindla nukleotiidijärjestuse kohalt. Ligaas ensüüm, mis ühendab kovalentse sidemega DNA-fragmentide ahelate otsad. Geenides on intronid ja eksonid : · Intron lõigatakse · Ekson liidetakse Bakterid toodavad inimese valke alates 1978. aastast : · Esimene oli insuliin
Pudelikaelaefekt ja rajajaefet Evolutsiooni eesmärk on maksimaalne kohastumine ja paljunemiseelise saamine selle kaudu. Evolutsioonil on 3 peamist mehhanismi: 1.) mutatsioonid kõik järglased ei ole võrdsed e ühesugused ja mõnel on mingisugune uus tunnus. Nt: valge jänes - geenm e punktm ei avaldu gentüübis ehk välimuses - kromosoomm ¼ - ½ kromosoomist on mutateerunud , nt: Angelmanni sündroom -genoomm muutunud on kromosoomide arv, nt: Downi sündroom 2.)Rekombinantne mehhanism kohtuvad harva esinevad retsetsiivsed alleelid, nt: kuuljatel sünnib kurt laps 3.)Geenitriiv teatud geeni esinemissagedus tõuseb järsult -pudelikaelaefekt see hakkab tööle peale katastroofi või erilist sündmust kui domineerima hakkab varem vähemuses olnud geen - rajajaefekt , nt: lennuki vms kaudu satub saarele nt mingi taime seeme, mis on piisavalt domineeriv, et kohalikud liigid välja suruda. 6.Looduslik valik
panna praktikumi-eelsel päeval (kontakteeru ses suhtes juhendajaga). Lisaülesanded: 2.1) Võrdle antud transformatsiooni protokolli (mis on kasutusel GTI Molekulaarbioloogia laboratooriumis) DNA kokaraamatus tooduga. Millised on erinevused? Meie inkubeerime 5min 37 kraadi juures, kokaraamatus 1,5min 42 kraadiga. 2.2) Millisel juhul võib bakterikoloonia sisaldada rekombinantset plasmiid, kuid samas koloonia värvus on ikka sinine. Kuidas määrata, et selles koloonias on rekombinantne plasmiid? Avatud lugemisraam, stop-koodon puudub või kui initsiatsioon algab meie inserdist. Määrata saab restriktsiooniga, kui multikloneerimissaidis on restriktaas SacII. 2.3) Mis juhtub, kui jätta Amp panemata? Võivad hakata kasvama muud bakterikolooniad, mitte plasmiidi sisaldavad bakterid. Meile olulised plasmiidi sisaldavad bakterid on Amp'ile resistentsed ning suudavad selles keskkonas kasvada.
teadmiste praktilise rakendamise põhimõtete ja meetodite otsimise ja arendamisega. 44. rakutehnoloogia - biotehnoloogia haru, mis tegeleb hulkraksete organismide rakkude kultiveerimise, kloonimise, hübriidimise, tüvirakkude eraldamise ja nende diferentseerumise suunatud mõjutamisega 45. rakuteraapia (rakkravi) - kahjustunud või hävinud kudede ja elundite funktsiooni parandamine või taastamine vastavalt diferentseerunud rakumasside siirdamisega 46. rekombinantne DNA - DNA molekul, mis koosneb tehnogeneetiliste meetoditega ühendatud 47. reproduktiivne kloonimine - inimese kloonimisvõimaluste käsitlemisel kasutatav mõiste, mis tähendab tuumkloonimist uute isendite saamise eesmärgil 48. restriktaas - bakteritel esinev endonukleaaside hulka kuuluv ensüüm, mis katkestab DNA kaksikahela kindla nukleotiidijärjestuse kohalt, tekitades üheahelalised ,,kleepuvad" otsad; bakteritest on leitud palju restriktaase, millest
· Rakuteraapia kahjustunud või hävinud kudede ja elundite funktsiooni parandamine või taastamine vastavalt diferentseerunud rakumasside siirdamisega; on seotud tüvirakkude eraldamise ja kultiveerimisega. · Geenitehnoloogia molekulaargeneetika rakendusharu DNA-fragmentide (geenide) siirdamine rakkude ja organismide geneetilise informatsiooni muutmiseks või nende kasutamine pärilike haiguste diagnoosimisel ja indiviidide geneetilisel tuvastamisel. · Rekombinantne DNA DNA molekul, mis koosneb tehnogeneetiliste meetoditega ühendatud eri liikidelt pärit geenidest ning muudest järjestuslõikudest. · Transgeenne organism organism või rakk, mille genoomis sisaldub, avaldub ja pärandub järglastele teiselt liigilt pärit geen; loodud geenitehnoloogilise protseduuriga. · GMO lühend väljendist ,,geneetiliselt muundatud organism". tavakeeles populaarne väljend transgeense ehk siirdgeense organismi tähistamiseks.
kompetentse retroviirusega. Sinna saab sisestada vaid 3.5 kb DNA-d). Teine võimalus on vektori pakkimine teise viiruse valk-kesta (envelope) sisse, mis määrab seostumise ja infektsiooni spektri. Nimetatakse viiruse pseudotüüpideks.(2) Adenoviirused Nakatavad arvukalt mittejagunevaid inimese rakke. Hingamisteed, sooletrakt. Kasutatakse ulatuslikult elusvaktsiinina respiratoorsete infektsioonide korral. Adenoviiruse DNA läheb raku tuuma, kus ekspresseeritakse transgeen. Rekombinantne DNA ei integreeru raku kromosoomi ja ei püsi seetõttu rakutuumas kaua. Seetõttu tuleb adenoviirus süsteemi puhul teraapiat korrata. Adenoviirusvektorite puhul on probleemiks mõne adenoviiruse geeni ekspressioon (kuigi väga madalal tasemel), mille tõttu kujuneb välja immuunvastus ja vastavad rakud hävitatakse. Sellest on püütud erinevatel viisidel üle saada vähendades vektori koostises olevate viirusvalkude hulka.(2) AAV süsteem (Adeno-Associated Viruses)
edastamine. Intronid, eksonid, RNA splaising, pöördtranskriptsioon ja pöördtranskriptaas (õp lk 37, 40), genoomipank (lk 39). DNA sekveneerimine – mõiste. Vt esitlust Transkriptsioon (geeni struktuur) ja õpikust lk 40 ning üldist, kogu materjali esitlust (Rakendusbioloogia, lõpuosa slaidid) + vihikist tunni materjalid. 3. Geenivektor, selle loomise protsess, ligaas, restriktaas (ja tekkivad „kleepuvad otsad"), rekombinantne DNA. Õp lk 37 – 39. Plasmiid. Viirusvektor, plasmiidne geenivektor. - õp lk 38. 4. Geneetikas enimuuritud liigid (eri organismirühmadest), nende valiku kriteeriumid. (vt esitlus Geeniotehnol_enimuuritud). - Kasvaja jälgimine, bioluminestsents, inimese DNA viimine sea munarakku, mikroinjetsioon, bioplaste lagundavad bakterid, valgesilmsele äädikakärbsele punasilmsuse geen
6/42) Geenivektoriks (geenisiirdaja) nimetatakse DNA konstrukte, mis tagavad siiratava geeni sisenemise rakku, integratsiooni ja avaldumise rakus. Bakteritel leitav ensüüm lõikab plasmiidi DNA lahti kindla järjestuse kohalt, sama bakteri ensüümiga lõigatakse välja siiratava geeni sisaldav DNA fragment. Plasmiid ja DNA-fragment segatakse kokku ja nende otsad ühinevad. DNA ühendatakse ligaasiga (ensüüm) töötlemisel ning tekib rekombinantne geenivektor, mis sisaldab siiratavt geeni. 7/42) Transgeensete imetajate saamine on keerukas seetõttu, et on keeruline geenivektori viimine viljastatu munarakku, ilma munarakku kahjustamata. Samuti ei ole õnnestunud luua geenivektoreid, mis intgreeruksid genoomi DNA- sse soovitaval kohal, nad võivad kahjustada olemasolevaid geene. Siiratav geen peab olema ka varustatu koespetsiifilise promootoriga, mis tagaks geeni avaldumis täpselt sealt, mil soovitakse
genoomi DNA-fragmentide kogum; kasutatakse kindlate fragmentide (geenide) paljundamiseks, uurimiseks ja siirdamismaterjali saamiseks. 48. Ligaas ensüüm, mid ühendab kovalentse sidemega DNA-fragmentide ahelate otsad. 49. Pöördtranskriptaas (revertaas) RNAst sõltuv DNA polümeraas; ensüüm, mis sünteesib üheahelalise RNA järgi kaheahelalise DNA-koopia. On omane retroviirustele. 50. Rekombinantne DNA DNA molekul, mis koosneb tehnogeneetiliste meetoditega ühendatud eri liikidelt pärit geenidest ning muudest järjestuslõikudest. 51. Restriktaas (restriktsiooniensüüm) bakteritel esinev endonukleaaside hulka kuuluv ensüüm, mis katkestab DNA kaksikahela kindla nukleotiidijärjestuse kohalt, tekitades üheahelalised ,,kleepuvad" otsad; bakteritest on leitud palju restriktaase, millest igaüks tunneb ära oma spetsiifilise DNA-järjestuse. 52
funktsioone taastatakse tüvirakkude siirdamisega. Blastomeer totipotentne tüvirakk Embrüonaalsed tüvirakud kõik rakutüübid, aga ei tule tervikorganismi Nabaväädivere tüvirakud stimulatsiooni korral saavad areneda paljudeks koetüüpideks Täiskasvanu tüvirakud nt vereloome tüvirakud Geenitehnoloogia seidneb DNA valitud lõikude eraldamises, töötlemises in vitro ja siirdamises sama või muu liigi isendi geneetilisse struktuuri kromosoomi, plasmiidi või viirusesse. Rekombinantne DNA DNA molekul, milles on ühendatud eri liikidelt pärit DNA fragmendid. Restriktaas- omapärane ensüüm, mis lõikab dna kaksikahelat kindlate järjestuste kohalt. Bakterid sünteesivad neid, et end kaitsta end erinevate viiruste sissetungi eest need lõikavad viiruse dna tükkideks enne kui see jõuab rakku kahjustada. Ligaas ensüüm, mille toimel ühinevad ahelate otsad ka kohalentsete sidemetega ja lõpetab rekombinantse molekuli moodustumise
munarakku - tuumkloonimine 1. Võetakse munarakk ja tuumadoonori keharakk 2. Munarakul tuum eemaldatakse 3. Munarakk ja tuumadoonori keharakk liidetakse elektriimpulsiga 4. ,,Vegetatiivse" sügoodi areng kultuuris 5. Embrüosiirdamine surrogaatemale 6. Kloonitud organism on geneetiliselt identne tuumadoonoriga Rekombinantne DNA DNA molekul, milles on ühendatud eri liikidelt pärit DNA- fragmendid. Restriktaasiga lõigatakse lahti ja ligaasiga ühinevad ahelate otsad kovalentse sidemega. GMO geneetiliselt muundatud organism Transgeenne organism isendi genoomi on siirdatud võõrliigi geene Geenivektor siirdajad. Rekombinantne geenivektor sisaldab siiratavat geeni Transgeensed imetajad toodavad piimas või veres inimese ravivalke või toidulisandeid Transeegnsed taimed:
mis hoiab ära raku sisenemise mitoosifaasi. Muudab neutrofiilid liikumatuks, millest tuleneb selle põletikuvastane toime. EI KASUTATA Vinkristiin - blokeerib samuti polümerisatsiooni. Vähiravim. Taksool - jugapuu koorest, seostub mikrotuubulitega ja stabiliseerib neid, takistades depolümerisatsiooni, arestides rakutsükli mitoosifaasis. Vähiravim kemoteraapias. Peptiidid ja valgud ravimitena Hormoonid. Kui organism neid ise toota ei suuda vajalikus koguses. Võimaldas rekombinantne DNA tehnoloogia. Vajalikku valku kodeeriv inimese geen kloneeritakse ja ekspresseeritakse mõnes kiirelt kasvavas kultuuris (bakter, pärm, kasvajad). Puuduseks manustamise keerukus, kiire metabolism ja võimalik immuunvastus. Insuliin - diabeet. Seondub lihas- ja rasvarakkude insuliiniretseptoritega soodustades glükoosi omandamist ning inhibeerides glükoosi eritumist maksast. Interferoon - leukeemia vormid, B ja C hepatiit, rekombinantne 19kD valk, mida toodetakse E.coli kultuuris.
Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. Restriktaas Vektor Lõigatud DNA Restrikataas (sama) Lõigatud vektor Kleepuvad otsad ühinevad Rekombinantne plasmiid Kuidas geenid kohale viia? 1. Bakteri plasmiidiga 2. Viirustega Kui neile on soovitud geen lisatud, nime- tame teda geenivektoriks. 3. Kullapüstoliga 4. Taimedesse Agrobakteriga Kuidas kergesti aru saada, et soovitud geen on üle kandunud? Üle viidavale geenile on markergeen ka külge pandud (näiteks helenduv-GFP) Nüüd kasutataksegi GFP geeni markerina: Kui uuritava geeni lõppu, enne stopp-
Seente tuumade jagunemisviiside ebastabiilsus ja mitmekesisus võib olla põhjuseks, miks nii mõnelgi juhul pärilikkuse ‘võrku’ on ‘puust’ üpriski raske eristada. Kas ka mitokondril on olnud roll homoloogiliste kromosoomide evolutsioonis, jääb mõistatuseks. Viimasel ajal on kogunenud üha enam andmeid horisontaalse geeniülekande (HGT – horizontal gene transfer) kohta seeneriigis. Nii leivapärmseene kui ka teiste seente mitokondriaalne genoom (mtGenoom) on tugevalt rekombinantne. Geneetilisi muutusi ja rekombinatsioone on kindlaks tehtud nii kunstlikul ristamisel (Fincham, 1979), kui ka looduslikes populatsioonides (Saville, 1998). On isegi leitud, et klonaalselt paljunevatel seentel on raku tuumagenoomi muutumisele kaasnenud mtGenoomi rekombinantne (retikulaarne) muutumine (Anderson, 2001). Teadaolevalt paljunevad mitokondrid inimesel jt. imetajatel klonaalselt ning nende järgi on võimalik määrata päritolu ‘mitokondriaalsest Evast’
viiakse sobivasse peremeesrakku ja paljundatakse seal. Varasemal ajal mõeldi kloonimise all just seda meetodit. Rakuline kloonimine koosneb neljast põhietapist: 1. Rekombinantsete DNA molekulide konstrueerimine in vitro. Meile huvipakkuva geeni fragment, e. võõr-DNA, sisestatakse ligeerimisel isereplitseeruva geneetilise elemendi (replikoni), enamasti plasmiidi või viiruse DNA genoomi e. vektorisse. 2. Transformatsioon ehk sisestamine. Selle tulemusel saadakse uus rekombinantne DNA molekul, mis on võimeline sisenema (näit. viirusena) või mida on võimalik sisestada e. transformeerida bakteri rakku. DNA repli-katsioon toimub seal sõltumatult peremeesraku kromosoomi(de)st. 3. Selektiivne paljundamine. Individuaalsete rakukolooniate (kloonide) saamiseks külvatakse transformeeritud (muundatud) rakud välja selektiivsele (agar)söötmele. Viiruse või plasmiidi replikatsioonil tekib rohkem kui 1012 identset viiruse või plasmiidi DNA molekuli
tõttu võimalik mugavalt liita. Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. Restriktaas Vektor Lõigatud DNA Restrikataas (sama) Lõigatud vektor Kleepuvad otsad ühinevad Rekombinantne plasmiid Kuidas geenid kohale viia? 1. Bakteri plasmiidiga 2. Viirustega Kui neile on soovitud geen lisatud, nime- tame teda geenivektoriks. 3. Kullapüstoliga 4. Taimedesse Agrobakteriga Viirusvektor viib soovitud geeni rakku Kuidas kergesti aru saada, et soovitud geen on üle kandunud? Üle viidavale geenile on markergeen külge pandud. Näiteks kasutatakse GFP (helenduv) geeni markerina:
lipiidmembraaniga Nanopartiklid 49. Kirjeldage skemaatiliselt protsessi kuidas saab toota mingit lehmale võõrast aga terapeutiliselt inimesele olulist valku nii, et seda valku saab eraldada lehma piimast. nt saab luua transgeensed lehmad, kelle piimas on vähem laktoosi. Disainitakse ekspressioonivektor, kus teatud inimesele olulist valku kodeeriv järjestus on promootori kontrolli al, mis tavaliselt on seotud piimavalkude geenidega. Rekombinantne DNA inserteeritakse looma somaatilistesse rakkudesse. Seejärel sisestatakse see rakk doonorlooma munarakku, millel on eelnevalt tuum eemaldatud. Esimese generatsiooni loomad on heterosügoodid, neid paaritatakse ning saadakse emased loomad, kelle piim sisaldab meid huvitavad valku. Samuti võimalik transgeeni mikrosüstimine viljastatud munaraku tuuma naabrusesse. 50. Kromosoomide struktuur ja funktsioon: kromosoomide uurimismeetodid vöödistus, FISH, CGH, põhilised
teisi immuunrakke), seondudes nende pinnal olevatele CD4/CCR5 retseptoritele DNA süntees retroviiruse genoomselt RNA-lt on mitmeetapiline protsess HIV evolutsioneerub kiiresti: 1. Pöördtranskriptaas teeb DNA sünteesil palju vigu 2. Viiruse kapsiidi pakitakse 2 koopiat RNA molekuli → DNA sünteesil võib toimuda matriitsi vahetus → Tekib rekombinantne viirus, kui genoomi koopiad ei ole identsed HIV-i geenid, mis on seotud viiruse paljunemisega ja geeniregulatsiooniga gag – kapsiidivalk pol – pöödtranskriptaas ja integraas Need geenid on kõigil retroviirustel env – ümbrise glükoproteiin HIV-i genoomilt sünteesitud DNA molekuli otstes on pikad terminaalsed kordusjärjestused LTR (long terminal repeats), mille vahendusel integreerub viirus raku genoomi Retroviiruse DNA integreerumine raku genoomi
1.Filamentse faagi 1.toodab palju 1. ringikujuline DNA ahel kujuna või plasmiidina; rekombinantset DNAd 2.laseb eraldada kloonitud DNA võib käituda nii 2.kasutatakse cDNA fragmendid üheahelalisel kujul (võimalik plasmiidina, kui ka kloonimiseks sekveneerida) faagina 3.Konjugatiivsed ja 3.ei tapa bakterirakku 2.stabiilne mitte, runway tüüp 4.F-spetsiifiline rekombinantne DNA 3.Üheahelaline DNA 4.Sobib suuremate fragmentide sisseviimiseks 12. Kuidas on võimalik ligeerida sisend vektorisse õige suunaga? Kõige lihtsam on lideerida kleepuvate otstega DNA fragmentdid. DNA fragmendi paigutamiseks vektorisse õige suunaga, kasutatakse 2 piiravat restriktsiooni ensüümi DNA läbitöötamiseks, et moodustaksid erinevad otsad. Need erinevad otsad takistavad ligeerimise tagasipöördumist ja aitavad sisestada fragmendi õigel suunal
aineid aga ka jääkaineid mis peletavad loomi eemale. Lüsosoom, Golgi kompleks. 45. Restriktaasid. Omapärased ensüümid, mis lõikavad DNA kaksikahelat kindlate järjestuste kohalt nii, et tekivad kleepuvate otstega DNA lõigud. Eri päristolu lõigud viiakse lahuses kokku ja nad ühinevad komplementaarsuse alusel, kleepuvate otste vahele tekivad vesiniksidemed. Ensüüm ligaasi abil ühendat eri päritolu lõigud kovalentsete sidemetega, tekib rekombinantne DNA molekul. Bakterid kaitsevad end sedasi viiruste eest. 46. DNA kloneerimise etapid. 1)DNA lõigatakse restriktaasi abil fragmentideks ja segatakse bakterite plasmiididega, mis on lahti lõigatud sama restriktaasiga 2)Iga plasmiid ühineb võõra fragmendiga. Ligaasi toimel ühinevad ahelate otsad 3)Bakterid võtavad rekombinantsed plasmiidid endasse, saadakse kloonbakterite kogumid 4)Kolooniad eraldatakse. Siiratud fragment(DNA)
•Igapäevane kasutamine •Vertebraal fraktuuride vähenemine 48% võrra, puusaluu murdude vähenemine 56% võrra. Ibandroonhappe –Kasutamine: 1 kord kuus Kõrvaltoimed: -Seedetraktiülaosaerosioonid, haavandtõveägenemine, gastriidi ägenemine * ravim võtta tühja kõhuga, tabletti mitte närida, neelata alla rohke veega ja peale manustamist olla vähemalt 30 minutit püstises asendis -Luu –ja lihaskonna valu -Lihaskrambid -Peavalu Paratüreoidhormoon Teriparatiid Peptiidi lõik (rekombinantne PTHga) Manustatakse s.c. Toimed: –Toimib osteoblastidele ja stimuleerib luu moodustumist –Suurendab kaltsiumi imendumist toidust –ei oma teisi PTH toimeid –Takistab suure kaltsiumi koguse kaotust uriiniga. •Kõrvaltoimeted: pearinglus, segasus ja valu luudes Kaltsitoniin •Kilpnäärmehormoon –pärsib osteoklastide vahendatud resorptsiooni –Manustatakse ninaspreina –Tugev valuvaigistav toime juba olemas olevate luumurdude korral
4) Tuvastatakse isadust, kurjategijat(ü.s. tuvastatakse inimest). Transgeensete organimside loomine põhineb restriktas tehnikal(see on bakterites olev ensüüm, mis lõikab DNA tükkideks). DNA ahelate lõigud on vastavad ehk komplementaarsed. Nende otsad on kleepuvad. Eri päritolu DNA lõigud viiakse lahusesse, kus nad ühinevad põhimõttel AT, GC. Ligaas on ensüüm, mis võimaldab ühendada eri päritolu DNA lõigud. Tulemuseks on rekombinantne DNA. See on DNA konstrukt. Kasutusel on ka pöördtranskriütaas e. revertaas. Ka see on ensüüm, mis sünteesib ühe ahelalise ahela järgi. kahe ahelalise DNA koopia. Transgeene organism on GMO. Kasutatakse baktereid, viirusi, mille üheks põhiomaduseks on tungida peremeesrakkudesse ning pärmseeni, mis toituvad orgaanilisest ainest. Peale paljunevad nad väga kiiresti. GMO loomine põhineb rekombinantse DNA tehnoloogial. Siiratav geen tuleb ühendada mikro organismi
Türosiin-kinaasi inhibiitorid ja retseptori vastased antikehad Puudus: teiste retseptor kinaaside poolt vahendatud signaaliradade inhibeerimine VEGF-i inhibeerimisel põhineva teraapia efektid · Veresoonte kasvu peatumine · Olemasolevate tuumori veresoonte taandumine · Aitab vähendada/peatada tuumori kasvu ja metastaaside teket Avastin® (Bevacizumab) · VEGF-spetsiifiline MKA (1993), P. Ferrara et al., Genentech · Bevacizumab rekombinantne humaniseeritud anti-VEGF MKA · FAD heakskiit kolorektaalvähi (2006),kopsuvähi (2006), neerurakulise kartsinoomi (2009) teraapiaks kombinatsioonis kemoteraapiaga · Kõrvalmõjud: verejooks, gastrointestinaalne perforatsioon, haavaparanemise komplikatsioonid Inimese embrüonaalsete tüvirakkude Kasutamine Embrüonaalsed tüvirakud pluripotentsed embrüo varajase staadiumi blastotsüsti sisemisest rakumassist
hübridoomkloon. Pöördtranskriptaas RNAst sõltuv DNA polümeraas, ensüüm, mis sünteesib üheahelalise RNA järgi kaheahelalise DNA-koopia. Rakuteraapia ehk rakkravi on kahjustunud või hävinud kudede ja elundite funktsiooni parandamine või taastamine vastavalt diferentseerunud rakumasside siirdamisega, on seotud tüvirakkude eraldamise ja kultiveerimisega. Rekombinantne DNA DNA molekul, mis koosneb tehnogeneetiliste meetoditega ühendatud eri liikidel pärit geenidest ning muudest järjestuslõikudest. Reproduktiivne inimsese kloonimisvõimaluste käsitlemisel kasuatatav mõiste. kloonimine mis tähendab tuumkloonimist uute isendite saamise eesmärgil, sellist kloonimist vastandatakse terapeutilisele kloonimisele.
Bio- ja geenitehnoloogia eksami kordamisküsimused 1. Mis on rekombinantne DNA tehnoloogia, selle ajalugu, meetodid ja rakendused. Rekombinantse DNA tehnoloogia on tehnoloogia, mis võimaldab DNA'd sünteesida ja manipuleerida mittelooduslikul teel. Mikroobe on kasutatud toiduproduktide tootmiseks nagu leib, juust ja alkohol. Tuhandeid aastaid on kasutatud selektiivset ristamist nii taimede kui loomade puhul. 20ndal sajandil hakkasid teadlased ära kasutama bakterite loomulikku ainevahetust tootmaks tööstuslikul skaalal butanooli, atsetooni, antibiootikume
fragmente. Bakteritel on vaja mehhanismi, kuidas eristada üksteisest oma enda DNA'd ja võõr-DNA'd, selle jaoks ongi olemas restriktaasid. Seega on erinevatel bakteriliikidel on restriktaaside äratundmisjärjestused erinevad. Kui on meil restriktaasi poolt läbi lõigatud DNA lõik katseklaasis ja lisada sinna teine DNA ja lisada ensüüm ligaas, mis uuesti moodustab fofodiestersidemed. Moodustub uus DNA molekul rekombinantne DNA. 22/10/09 Restriktaaside abil on niisiis võimalik DNA'd lahti lõigata ning DNA fragmente on katseklaasis võimalik ensüüm ligaasi abil kokku liita. Ligaas ei liida kokku kõikki molekule, seega pole see protsess 100%lise efektiivsusega. Kui sobiv molekul tekib, siis peab olema võimalus selle paljundamiseks. Bakteri rakkudes esinevad kromosoomi kõrval veel ühed DNA molekulid, mille suurus on oluliselt väiksem kui kromosoomil plasmiidid.
baktereid võõraste DNAde eest. 41. DNA kloneerimise etapid 1. Peremeesorganismi ja kloonimisvektori valik. 2. Vektor DNA ettevalmistamine. 3. Kloonitava DNA ettevalmistamine. 4. Rekombinantse DNA sünteesimine ligatsiooni abil. 5. Rekombinantse DNA sisestamine peremeesorganismi → hakkab seal paljunema. 6. Rekombinantide selekteerimine (need, mille rakud on vastu võtnud + paljundanud) 7. Rekombinantide analüüsimine Rekombinantne DNA – DNA molekul, mis on kunstlikult kokku pandud mitest erinevast DNA fragmendist, mis pärinevad sageli erinevatest organismides. Selle DNA tegemise eesmärgiks luua DNA molekul, mida vabas looduses ei leidu ja millel on mingid uued omadused. Selle kombineerumine on võimalik, kuna kõikidel organismidel on DNA keemiline struktuur täpselt sama ja nende DNA erineb vaid nukleotiidse järjestuse poolest. 42. Mis on cDNA?
See seostub operaatoriga, blokeerides ekspressiooni (ja Trp sünteesi). 36. Cis-elemendid, trans-faktorid Cis-acting elemendid – DNA järjestused, mis mõjutavad oma läheduses paikneva geeni ekspressiooni. Eri geenidel eri kombinatsioonid cis-elementidest Trans-acting faktorid - transkriptsioonifaktorite seostudes teiste geenide cis-elementidega reguleerivad nende geenide ekspressiooni 37. Rekombinantse DNA metoodika alused Rekombinantne DNA on soovikohaselt muudetud DNA järjestus. Rekombinantse DNA same restrikaaside abil. Metoodika alused: - E.coli rakkude transformatsioon võõrDNA-ga (ehk võõr-DNA viimine E.coli rakkudesse) – plasmiidid - DNA molekulide lõikamine ja ühendamine - restriktaasid, ligaas - analüüsimeetodid võõrDNA jälgimiseks - elektroforees, hübridiseerimine 38. Restriktaasid
Fluorestsentsmikroskoobis on valgusallikaks elavhôbedalamp, mis annab lühilainelist kiirgust (paljudel lainepikkustel). 51. Täispikkade genoomide sekveneerimine, miks see on oluline? Et mõista erinevate geenide omadusi ja mõista paremini haiguseid ning töötada ravimeid välja. Küsimus on idee järgi sama, mis punkt 55. 52. Kuidas konstrueerida üht transgeenset looma? Transgeensete loomade konstrueerimisel on 2 metoodilist lähenemist. Enamasti süstitakse rekombinantne DNA viljastatud munarakku. Süstitav DNA võib olla kas lineaarne või rõngasmolekul. Lineaarne DNA integreerub genoomi ligi 5 korda efektiivsemalt kui tsirkulaarne DNA. Tavaliselt süstitakse ühte munarakku sadu kuni tuhandeid rekombinantse DNA molekule. Sisseviidud DNA integreerub genoomi suvalistesse kohtadesse. Teiseks transgeensete loomade konstrueerimise võimaluseks on embrüode nakatamine retroviiruste baasil konstrueeritud rekombinantsete DNA molekulidega. 53
jooksul; Erinevate serotüüpide vahel on see vaid 0,01% Rekombinatsioon toimub RNA sünteesi käigus (enamasti negatiivsete ahelate sünteesi jooksul) nn. Copy-choice mehhanismi abil: RNA polümeraas koos sünteesitava ahelaga eraldub maatritsilt; Sünteesitav ahel paardub järgnevalt teise RNA molekuliga; Süntees jätkub uuel maatritsil. Protsessi tulemuseks on rekombinantne RNA molekul. Teiseks geneetiliseks variatsioonide tekitamise mehhanismiks on picornaviirustel RNA polümeraasi poolt tekitatud vead ( üks viga 10 000 nukleotiidi kohta). Virionide moodustumine Protomeer - Mitme subühikulised valgud sisaldavad kahte või enamat mittekovalentselt seotud polüpeptiidi, mis võivad olla nii identsed kui ka erinevad. Kui vähemalt kaks ahelat mitmesubühikulises valgus on identsed, on
POWERPOINT: regulatsioon 32. Lac ja Trp operonid, nende reguleerimise sarnasused ja erinevused POWERPOINT: regulatsioon 33. Cis-elemendid, trans-faktorid POWERPOINT: regulatsioon 34. DNA-valk interaktsioonid regulatsioon toimib läbi paljude cis-acting elementide ja trans-acting faktorite vaheliste seoste. mitte-kovalentsed POWERPOINT: regulatsioon 35. Rekombinantse DNA metoodika alused POWERPOINT: rekombinantne DNA 36. Restriktaasid Restriktaasid- restriktaasid on ensüümid, mia lõikavad DNA katki. On olemas järjestusspetsiifilised restriktaasid ja restriktaasid, mis lõikavad DNA ahelat suvalistest kohtadest. Restriktaasidel on omadus lõikata DNA topeltahel läbi kindlas piirkonnas (lõikepiirkond- ingl. k. cleavage site), mille määrab ära antud piirkonna DNA nukleiinhappeline-järjestus (äratundmis- järjestused; ingl. k
DNA fragmendid. Metoodika 1.Sama restriktaas (restriktsiooniesüüm) tunneb ära sama järjestuse DNA erimolekulides. 2.Restriktaas „lõikab“ DNA ahelad pooleks nii,et tekivad „kleepuvate“ otstega DNA lõigud. 3.Eri päritolu DNA lõigud viiakse lahuses kokku; ühinevad komplementaarsuse alusel; „kleepuvate“ otste vahele tekivad vesiniksidemed. 4. Ensüüm ligaasi abil ühendatakse eri päritolu DNA lõigud omavahel kovalentsete sidemetega kokku- tekib rekombinantne DNA molekul. Restriktaasid. Restriktaasid on ensüümid, mia lõigavad katki DNA´d. On järjestusspetsiifilised ristriktaasid ja need restriktaasid, mis lõigavd DNA ahelat suvalistes kohtades. Restriktaasidel on omadus lôigata DNA topeltahel läbi kindlas piirkonnas (lôikepiirkond- ingl. k. cleavage site), mille määrab ära antud piirkonna DNA nukleiinhappeline-järjestus (äratundmis-järjestused; ingl. k. recognition sequences- koosnevad 4-8
POWERPOINT: regulatsioon 32. Lac ja Trp operonid, nende reguleerimise sarnasused ja erinevused POWERPOINT: regulatsioon 33. Cis-elemendid, trans-faktorid POWERPOINT: regulatsioon 34. DNA-valk interaktsioonid · regulatsioon toimib läbi paljude cis-acting elementide ja trans-acting faktorite vaheliste seoste. · mitte-kovalentsed POWERPOINT: regulatsioon 35. Rekombinantse DNA metoodika alused POWERPOINT: rekombinantne DNA 36. Restriktaasid Restriktaasid- restriktaasid on ensüümid, mia lõikavad DNA katki. On olemas järjestusspetsiifilised restriktaasid ja restriktaasid, mis lõikavad DNA ahelat suvalistest kohtadest. Restriktaasidel on omadus lõikata DNA topeltahel läbi kindlas piirkonnas (lõikepiirkond- ingl. k. cleavage site), mille määrab ära antud piirkonna DNA nukleiinhappeline-järjestus (äratundmis- järjestused; ingl. k
Trans-acting faktorid - transkriptsioonifaktorite seostudes teiste geenide cis-elementidega reguleerivad nende geenide ekspressiooni 37. DNA-valk interaktsioonid • regulatsioon toimib läbi paljude cis-acting elementide ja trans-acting faktorite vaheliste seoste. mitte-kovalentsed DNAga seostumiseks võib valgul olla vajalik seostuda enne teise valguga (valk-valk interaktsioon) 38. Rekombinantse DNA metoodika alused Rekombinantne DNA on soovikohaselt muudetud DNA järjestus. Metoodika alused: - E.coli rakkude transformatsioon võõrDNA-ga (ehk võõr-DNA viimine E.coli rakkudesse) – plasmiidid - DNA molekulide lõikamine ja ühendamine - restriktaasid, ligaas - analüüsimeetodid võõrDNA jälgimiseks - elektroforees, hübridiseerimine 39. Restriktaasid Restriktaasid- restriktaasid on ensüümid, mia lõikavad kindla DNA järjestuse(äratundmiskoht) katki
Eri geenidel eri kombinatsioonid cis-elementidest Trans-acting faktorid - transkriptsioonifaktorite seostudes teiste geenide cis-elementidega reguleerivad nende geenide ekspressiooni 37. DNA-valk interaktsioonid · regulatsioon toimib läbi paljude cis-acting elementide ja trans-acting faktorite vaheliste seoste. mitte-kovalentsed DNAga seostumiseks võib valgul olla vajalik seostuda enne teise valguga (valk-valk interaktsioon) 38. Rekombinantse DNA metoodika alused Rekombinantne DNA on soovikohaselt muudetud DNA järjestus. Metoodika alused: - E.coli rakkude transformatsioon võõrDNA-ga (ehk võõr-DNA viimine E.coli rakkudesse) plasmiidid - DNA molekulide lõikamine ja ühendamine - restriktaasid, ligaas - analüüsimeetodid võõrDNA jälgimiseks - elektroforees, hübridiseerimine 39. Restriktaasid Restriktaasid- restriktaasid on ensüümid, mia lõikavad kindla DNA järjestuse(äratundmiskoht) katki
annaabi.ee 
