Et uuritavat ainet läbi kolonni transportida ja, et erinevad molekulmassiga ained saaksid üksteisest eralduda, voolutatakse ehk elueeritakse kolonni sobivat vesilahusega ja kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on kaks olulist parameetrid: 1) kolonni vaba mahtu Vv (=Vxmin) ehk eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu. 2) maksimaalset elueerimismahtu Vxmax ehk eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid, mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad. Liikuvusteguriga Rf iseloomustatakse aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja, mille elueerimismaht on kolonnis kindlaks määratud. Kromatogramm on eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vaheline sõltuvus. 2. Töö käik 1.3 Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine Kontrollisin kolonni vertikaalsust
Kui segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena, st neil on minimaalne elueerimismaht Vx min, mis võrdub kolonni vaba mahuga. Vxmin= Vv Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aeglaselt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vx max, mis on lähedane antud kolonni kogumahule. Vxmax= Vt Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui kolonni läbinud vedeliku maht ületab kolonni kogumahu. Teades geelimaatriksi mahtu Vg, võib Vxmax arvutada: Vxmax= Vt-Vg Geelkromatograafiat iseloomustavad kaks olulist suurust: · Vv(=Vxmin)- vaba maht e. eluaadi maht, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu · Vxmax- maksimaalne elueerimismaht, eluaadi maht, mille juures väljuvad need
Igat uuritavas segus sisalduvat ainet iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx (see arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Vx eluaadi maht, mille uures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Vxmin ehk minimaalne elueerimismaht = Vv kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitvatesse geeli pooridesse, väljuvad nad segust esimesena. Vxmax ehk maksimaalne elueerimismaht = Vt - aine molekulid difundeeruvad täielikult geeli pooridesse ja liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt. Vxmax = Vt Vg Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx vaadeldavas keskkonnason kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf: Rf = Vx - Vxmin / Vxmax - Vxmin Töö käik: Kolonn ja selle ettevalmistamine:
Vt=Vv+Vs+Vg Igat uuritavas segus sisalduvat ainet iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx (see arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Vx eluaadi maht, mille uures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Vxmin ehk minimaalne elueerimismaht = Vv kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitvatesse geeli pooridesse, väljuvad nad segust esimesena. Vxmax ehk maksimaalne elueerimismaht = Vt - aine molekulid difundeeruvad täielikult geeli pooridesse ja liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt. Vxmax = Vt Vg Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx vaadeldavas keskkonnason kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf: Rf = Vx - Vxmin / Vxmax - Vxmin Töö käik Kolonn ja selle ettevalmistamine:
See on eluaadi maht, mis on kogutud kuni aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni. Kui segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena, neil on minimaalne elueerimismaht Vxmin, mis võrdub kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et difundeeruda täielikult geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aeglaselt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on lähedane antud kolonni kogumahule. Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui kolonni läbinud vedeliku maht ületab kolonni kogumahu. Teades geelimaatriksi mahtu Vg, võib Vxmax arvutada: Vxmax = Vt - Vg Geelkromatograafiat iseloomustavad kaks olulist parameetrit: Vv(=Vxmin)- vaba maht e eluaadi maht, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu; Vxmax - maksimaalne elueerimismaht, eluaadi maht, mille juures väljuvad need
kolonnist fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Need molekulid, mis on liiga suured, et mahtuda geeli pooridesse, väljuvad kolonnist esimesena ja seda iseloomustatakse minimaalse elueerimismahuga Vxmin. Vxmin on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga: Vxmin=Vv Ained, mis täielikult difundeeruvad geeli pooridesse (väiksema molekulmassiga), liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on lähedane suurus kolonni kogumahule Vt. Protsessi saab lõppenuks lugeda, kui Vxmax=Vt (kolonnist väljuva eluaadi maht on ligikaudu võrdne kolonni kogumahuga). Kui on teada geelimaatriksi maht Vg, siis saab maksimaalse elueerimismahu Vxmax arvutada nii: Vxmax=Vt-Vg. Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx on vaadeldavad kolonnis kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf
fraktsioonide kaupa. Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimismaht V x. Kui segus leidub molekule, mis ei mahu geeli pooridesse, siis need väljuvad kolonnist esimesena, minimaalse elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdub kolonni vaba mahuga. Vxmin = VV. Geeli pooridesse difundeeruvad täielikult ained, mille molekulmass on väike, nad liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on arvuliselt lähedane kolonni kogumahule Vt. Seega võib kromatograafilise protsessi lugeda lõpetatuks, kui kolonnist väljunud vedeliku üldmaht võrdub ligikaudu kolonni kogumahuga. Kromatogrammiks nimetatakse eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust. Kromatografeerimissüsteem koosneb kolonnist, eluendi reservuaarist ja automaatsest fraktsioonikogurist. Selles praktikumis kasutatakse klaaskolonne,
kontsentratsioon on maksimnaalne.
Kõige väiksem elueerimismaht on kõige suuremates molekulides, mis ei mahu geeli
pooridesse, ja siis väljuvad esimesena. Vxmin on võrdne kolonni granulitevahelise mahuga.
Vxmin = Vv
Kõige suurem elueerimismaht on ainetes, mille molekulmass nii väike, täielikult
difundeeruda geeli pooridess. Need liikuvad kolonnis kõige aeglasem. VxmaxVt
Vxmax võiks leida kui on teada Vg. Vxmax=Vt Vg
Rf liikuvstegur . Rf= Vx Vxmin / Vxmax -Vxmin
0
arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Vx eluaadi maht, mille uures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Vxmin - ehk minimaalne elueerimismaht, mis on võrdne kolonni vaba mahuga Vv kolonni vaba maht ( kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitvatesse geeli pooridesse, väljuvad nad segust esimesena.) Vxmax - maksimaalne elueerimismaht (aine molekulid difundeeruvad täielikult geeli pooridesse ja liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt.)Vxmax = Vt Vg Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx vaadeldavas keskkonnason kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf Rf = Kromotogramm-kromotograafia protsessi visuaalne väljund, see on graafiline sõltuvust
vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Liiga suured molekulid ei mahu graanulitesse ja väljuvad kolonnist esimesena, st nad on minimaalse elueerimismahuga ja on võrdsed graanulitevahelise vedeliku mahuga. Vxmin = Vv Väiksed molekulid suudavad difundeeruda geeli pooridesse ja liiguvad kolonnis kõige aeglasemini. Nad on maksimaalse elueerimismahuga on arvväärtuselt lähedased kolonni kogumahule. Vxmax = Vt Seda saab arvutada ka geelimaatriksi mahu abil Vxmax = Vt - Vg Aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda geeli pooridesse ja mille elueerimismaht on antud kolonnis kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf. Rf = (Vx Vxmin)/(Vxmax Vxmin) , kus 0 < Rf < 1 Fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nimetatakse kromatogrammi
mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist kõige kiiremini, st minimaalse elueerimismahuga Vxmin, Vxmin= Vv. Küllalt väikse molekulmassiga ained, mis täielikult difundeerub geeli pooridesse, liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, Vxmax Vt. Geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kahte olulist parameetrit: kolonni vaba mahtu Vv ehk eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu, maksimaalset elueerimismahtu Vxmax, ehk eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid, mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad. Liikuvusteguriga Rf iseloomustatakse aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda geeli
fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena, st minimaale elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga. Ained mille molekulmass on küllalt väike, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse, liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule Vt. Vxmax = Vt - Vg Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx on kindlaks määratus, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf. Rf = Vx Vxmin / Vxmax - Vxmin Töö käik · Kontrollitakse kolonni vertikaalsust · kolonni täidis: Sephadex G-75, tegur k = 0,1 · geelisamba kõrgus l = 31,4 cm · diameeter d = 1,6 cm
mis on kogutud kuni aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni.) Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena. Neil on minimaalne elueerimismaht (Vxmin = kolonni vaba maht). Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et difundeerude täielikult geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aeglaselt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga (Vxmax = Vt- Vg). Kui aine molekulid mahuvad geeli pooridesse sisenema, siis iseloomustatakse nende liikumist kolonnis liikuvusteguriga Rf: V x - v xmin R f = max V x - V xmin Fraktsioonide arvutamine: r = 2,2/2=1,1 cm h = 31,5 cm Geeli maht: Vt = Sp*h = r2*h = *(1,1)2*31,5 =119,68 cm3 k = 0,1 Vg = k*Vt = 0,1*119,68 = 11,9 cm3 Vxmax = Vt Vg = 119,68 11,9 = 107,7 cm3 Fraktsioonide teoreetiline arv: n = Vxmax/2 =107,7/2 = 53
elueerimismaht ehk väljumismaht Vx (eluaadi maht, mis on kogutud kuni aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni.) Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena. Neil on minimaalne elueerimismaht (Vxmin = kolonni vaba maht). Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et difundeerude täielikult geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aeglaselt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga (Vxmax = Vt-Vg). Kui aine molekulid mahuvad geeli pooridesse sisenema, siis iseloomustatakse nende liikumist kolonnis liikuvusteguriga Rf: V x - v xmin R f = max V x - V xmin TÖÖ KÄIK, ARVUTUSED, TABELID, GRAAFIKUD Fraktsioonide arvutamine: r = 2,3/2=1,15 cm h = 29,5 cm Geeli maht: Vt = Sp*h = r2*h = *(1,15)2*29,5 =122,56 cm3 k = 0,1 Vg = k*Vt = 0,1*122,56 = 12,256 cm3 Vxmax = Vt Vg = 122,56 12,256 = 110,30 cm3 Fraktsioonide teoreetiline arv: n = Vxmax/2 =110,3/2 = 55,15
arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Vx – eluaadi maht, mille uures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Vxmin - ehk minimaalne elueerimismaht, mis on võrdne kolonni vaba mahuga Vv –kolonni vaba maht ( kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitvatesse geeli pooridesse, väljuvad nad segust esimesena.) Vxmax - maksimaalne elueerimismaht (aine molekulid difundeeruvad täielikult geeli pooridesse ja liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt.)Vxmax = Vt – Vg Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht. Vx vaadeldavas keskkonnason kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf V x −V min x Rf = V max−V min x x
pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena (kõige kiiremini), st minimaalse elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga Vv. Vxmin = Vv Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse, liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga V xmax, milline on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule V t. Vxmax = Vt. Kromatografeerimise protsess on lõppenud, kui kolonnist väljunud vedeliku (eluaadi) üldmaht võrdub ligikaudu kolonni kogumahuga. Kui geelimaatriksi maht Vg on teada, siis vib arvutada maksimaalse elueerimismahu Vxmax = Vt Vg Kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kolonni vaba mahtu Vv (= Vxmin) ja maksimaalset elueerimismahtu Vxmax. Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse
jne. Vx- eluendi maht, mille juures väljuv fraktsioon on maximaalne. Liiga suured molekulid, mis ei mahu geeli pooridesse, väljuvad kolonnist kõige kiiremini, st et neil on minimaalne elueerimismaht V x min , see on võrdne vaba vedeliku mahuga. Vx min= Vv Need ained, mis on liiga väikse molekulmassiga, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aegaselt ja väljuvad kõige hiljem, need väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, milline on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule Vt. Seega Vx=Vt Juhul kui Vg on teada saab leida Vxmax i Vxmax= Vt-Vg Rf = (Vx-Vx min)/(Vxmax Vx min) kus Rf on liikuvustegur, mille väärtused jäävad vahemikku 0-1 Eluaadi frkatsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nimetatakse kromatograammiks. Antud ttöös koosasin käsitsi. Tüüpiline kromatografeerimissüsteem koosneb kolonnist, eluendi reservuaarist ja
kolonnist väljumiseni. Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse siis väljuvad nad kolonnist kõige esimestena ja neil on minimaalne elueerimismaht, mis võrdub kolonni vaba mahuga ja tähistatakse Vxmin Vxmin=Vv Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et difundeeruda täielikult geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aeglaselt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax. Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui kolonni läbinud vedeliku maht ületav kolonni kogumahtu. Seega iseloomustavad mistahes geelkromatograafia kolonni kaks olulist suurust: Vv=Vxmin- vaba maht, mis on eluaadi maht, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu. Vxmax-maksimaalne elueerimismaht, mis on eluaadi maht, mille juures väljuvad need molekulid, mis on võimelised graanilitesse täielikult sisenema.
ained saaksid üksteisest eralduda, voolutatakse kolonni sobiva vesilahusega. Kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Molekulid, mis ei mahu geeli pooridesse väjuvad kõige esimesena, st minimaalse elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdne kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv Ained, mis mahuvad geeli pooridesse, liigavad kõige aeglasemalt ja väjuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, milline on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule. Et täidis väja ei voolaks, on kolonni alumine ots täidetud klaasvillaga. Eluendi lisamine kolonni ja eluaadi fraktsioonide kogumine toimub käsitsi. Ainehulkade kindlakstegemiseks kogutud fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrit. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine 1. Kontrollitakse, et kolonn oleks vertikaalne. 2
Uuritavas segus sisalduva aine x väljumis- ehk elueerimismaht Vx on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Suured molekulid, mis ei mahu geeli pooridesse, väljuvad kolonnist esimesena ja on võrdsed kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv Väikese molekulmassiga ained liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax. Maksimaalne elueerimismaht on võrdne kolonni kogumahuga Vt. Vxmax ~ Vt Liikuvustegur Rf iseloomustab aineid, mis on võimelikud difundeeruda geeli pooridesse. min Vx - Vx R f = max min Vx - V x Kromatogramm on eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vaheline graafiline sõltuvus. Töö käik Kolonni iseloomustramine ja ettevalmistamine:
Uuritavas segus
sisalduva aine elueerimismaht Vx on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub
fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne.
Lühima ajaga väljuvad kolonnist molekulid, mis on liiga suured mahtumaks pooridesse. Nad
väljuvad minimaalse elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdne kolonni graanulitevahelise
vedeliku mahuga:
Vxmin=Vv.
Kõige aeglasemalt ja maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, väljuvad molekulid, mis on
küllalt väikesed, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse.
Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui kolonni läbinud vedeliku üldmaht ületab
kolonni kogumahu:
Vxmax>Vt.
Vxmax saab ka arvutada, teades geelimaatriksi mahtu:
Vxmax=Vt Vg
Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille
elueerimismaht Vx on kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf: ,kus (0
vesilahusega ning kogutakse eluaati kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Töö käik Ettevalmistus · Töös kasutasin geeli Sephadex G-75 ning tema fraktsioneerimispiirkond on 3000-80000D, k = 0,1 · Täidise kõrguseks mõõtsin L = 32cm ja läbimõõduks d = 1,7cm -> r = 0,85cm · Arvutasin täidise kogumahu: Vt = L·r2= 32 · 0,852 = 72,63cm3 · Arvutasin geelmaatriksi mahu: Vg = k·Vt = 72,63 · 0,1 = 7,263cm3 ja maksimaalse eludeerimismahu Vxmax = Vt Vg = 72,63 7,273 =65,357 cm3 · Arvutasin fraktsioonide üldarvu teades, et ühe fraktsiooni maht on 2ml. n = Vxmax/2 = 65,357 / 2 33 · Nummerdasin katseklaasid Praktiline töö · Avasin kolonni väljavooluava ja täidise kohal olev voolutuslahus hakkas aeglaselt tilkuma keeduklaasi. · Reguleerisin kolonni voolutuskiiruseks ligikaudu 1ml/min · Kui vedeliku tase langes geeli pinnani sulgesin kiiresti väljavooluava.
fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrit. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine · Kontrollitakse, et kolonn oleks vertikaalne. · Märgitakse üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex'i mark ja seda iseloomustav tegur k. · Mõõdetakse geelisamba kõrgus L ja ja diameeter d. · Arvutatakse täidise kogumaht Vt · Arvutatakse geelimaatriksi maht Vg = k · Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax=Vt - Vg · Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vxmax / 2. · Statiivi pannakse vajalik kogus kalibreeritud ja nummerdatud katseklaase. · Märgitakse üles voolutuslahus ja varustatakse end sobiva pipetiga, millega saab lahust kolonni lisada. · Varutakse väike keeduklaas, kuhu lastakse alguses täidise pinnal olev eluent. Segu komponentide lahutamine.
mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Kui segus on molekulid, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis see aine väljub kolonnist esimesena ning see aine väljuvad minimaalse elueerimismahuga (Vmin), mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga. Vx min = Vv Aine, mis jõuab kolonnist viimasena, väljub maksimaalse elueerimismahuga(Vxmax). Selle aine molekulid on küllaltki väiksed, et täielikult difundeeruda geeli pooridess ning liiguvad aeglasem, kui teiste ainete molekulid. See maht on peaaegu võrdne kasutava kolonni kogumahuga(Vt). Vx max Vt Kui geelimaatriksi maht Vg on teada, siis vib maksimaalse elueerimismahu Vxmax ka arvutada. Vxmax = Vt Vg Seega kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kahte
sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Uuritavas segus sisalduva aine
elueerimismaht Vx on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine
kontsentratsioon on maksimaalne.
Lühima ajaga väljuvad kolonnist molekulid, mis on liiga suured mahtumaks pooridesse. Nad väljuvad
minimaalse elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdne kolonni graanulitevahelise vedeliku mahuga: Vxmin=Vv.
Kõige aeglasemalt ja maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, väljuvad molekulid, mis on küllalt väikesed, et
täielikult difundeeruda geeli pooridesse.
Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui kolonni läbinud vedeliku üldmaht ületab kolonni
kogumahu: Vxmax Vt.
Vxmax saab ka arvutada, teades geelimaatriksi mahtu: Vxmax=Vt Vg
Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht
Vx on kindlaks määratud, iseloomustatakse liikumisteguriga f: , (0
See on eluaadi maht, mis on kogutud kuni aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni. Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena, st neil on minimaalne elueerimismaht V xmin, mis võrdub kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv Ained, mille molekulid on piisavalt väiksed, et mahtuda täielikult geeli pooridesse väljumad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on ligilähedane kolonni kogumahule Vxmax Vt . Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui kolonni läbinud vedelikku maht ületab kolonni kogumahtu. Töö käik. Kolonni tätmine ja iseloomustamine Geel: Sefadex 6-50 Täidetud kolonnile arvutatakse geelisamba kõrguse ja diameetri alusel täidise kogumaht Vt Geelisamba kõrgus = 31cm Sissediameeter = 2,0 cm Vt = r2h = 3,14*12*31= 97,34 cm3 Vastavalt kolonni täitematerjalli iseloomustava teguri k väärtusele leitakse geelimatriksi maht Vg k = 0.1
Ainet iseloomustavad: Elueerimismaht ehk väljumismaht Vx. Ehk siis eluaadi maht, mis on kogutud kuni aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni. Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured, mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena. Tegemist on minimaalse elueerimismahuga Vxmin, kusjuures Vxmin=Vv. Ained, mis difundeeruvad täielikult geeli pooridesse liiguvad aeglaselt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on lähedane antud kolonni kogu mahule. Vxmax= Vt-Vg. Molekule, mis mahuvad geeli pooridesse sisenema, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf, mis arvutatakse vastavalt valemile. Töö käik: Mõõtsin ära kolonni kõrguse ja diameetri, et arvutada fraktsioonide üldarvu. Kolonni kõrguseks mõõtsin ma 31,4cm ja diameetriks1,8cm. k oli antud ja see oli 0,1. Vastavalt valemitele arvutasin: 2 1,8 Vt = * * 31,4 = 79,86cm 3 2 V g = k * Vt = 7,986
kolonnist väljumiseni. Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse siis väljuvad nad kolonnist kõige esimestena ja neil on minimaalne elueerimismaht, mis võrdub kolonni vaba mahuga ja tähistatakse Vxmin vxmin=Vv Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et difundeeruda täielikult geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aeglaselt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax. Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui kolonni läbinud vedeliku maht ületav kolonni kogumahtu. Seega iseloomustavad mistahes geelkromatograafia kolonni kaks olulist suurust: Vv=Vxmin- vaba maht, mis on eluaadi maht, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu. Vxmax-maksimaalne elueerimismaht, mis on eluaadi maht, mille juures väljuvad need molekulid, mis on võimelised graanilitesse täielikult sisenema.
mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Kui segus on molekulid, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis see aine väljub kolonnist esimesena ning see aine väljuvad minimaalse elueerimismahuga (Vmin), mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga. Vx min = Vv Aine, mis jõuab kolonnist viimasena, väljub maksimaalse elueerimismahuga(Vxmax). Selle aine molekulid on küllaltki väiksed, et täielikult difundeeruda geeli pooridess ning liiguvad aeglasem, kui teiste ainete molekulid. See maht on peaaegu võrdne kasutava kolonni kogumahuga(Vt). Vx max Vt Kui geelimaatriksi maht Vg on teada, siis vib maksimaalse elueerimismahu Vxmax ka arvutada. Vxmax = Vt Vg Seega kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kahte
o Märkisin ülesse kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex'i margi Sephadex G-75 ja seda iseloomustava teguri k=0,1. o Mõõtsin geelisamba (täidise) kõrguse l=32 cm ja diameetri d=1,6 cm, kasutades sobivat joonlauda. o Arvutasin täidise kogumahu Vt = Vv + Vs + Vg = PI*(d/2)2*l = 64 cm2. o Arvutasin geelmaatriksi mahu Vg = k*Vt = 0,1*6,4= 6,4 cm2 ja sellest lähutvalt kolonni iseloomustava maksimaalse elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 64cm2 6,4 cm2 = 57,6 cm2. o Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n= Vxmax/2 = 57,6/2 =~29. o Katseklaasistatiivile asetasin fraktsioonide arvule (29) vastava hulga kindla mahu järgi (2 ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdasin. o Kolonni lähedusse paigutasin voolutuslahuse (eluendi) pudeli ning märkisin
kolonni kogumahu: Vx max Vt Vx max saab ka arvutada, teades geelimaatriksi mahtu: Vx max=Vt Vg 1 Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx on kindlaks määratud, iseloomustatakse liikumisteguriga: Töö käik Kõigepealt mõõdeti täidise kõrgus L ja diameeter d, millest lähtudes arvutati täidise kogumaht Vt. Siis arvutati geelimaatriksi maht Vg = k Vt ning Vxmax = Vt Vg. Fraktsioonide üldarvu leidmiseks (kui ühe fraktsiooni maht on 2 ml): n = Vxmax / 2 Vastavalt leitud fraktsioonide arvule võeti kalibreeritud katseklaasid ning nummerdati. Avati kolonni väljavooluava ning vedelikku koguti väiksesse keeduklaasi, kuni vedeliku tase oli jõudnud täidise pinnani. Kolonni väljavooluava suleti. 0,5 ml automaatpipetiga sisestati kolonni uuritav proov, avati kolonni väljavool ning esialgu väljuvat eluaati koguti väiksesse mõõtsilindrisse
ained saaksid üksteisest eralduda, voolutatakse kolonni sobiva vesilahusega. Kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Molekulid, mis ei mahu geeli pooridesse väjuvad kõige esimesena, st minimaalse elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdne kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv Ained, mis mahuvad geeli pooridesse, liigavad kõige aeglasemalt ja väjuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, milline on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule. Et täidis väja ei voolaks, on kolonni alumine ots täidetud klaasvillaga. Eluendi lisamine kolonni ja eluaadi fraktsioonide kogumine toimub käsitsi. Ainehulkade kindlakstegemiseks kogutud fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrit. Töö käik Kontrollisin kolonni vertikaalsust. Tegin vastavaid mõõtmisi (kõrgus L ja diameeter d) ja kirjutasin endale Sephadex'i mark ja seda iseloomustav tegur k.
kolonnist väljuvas fraktsioonis on vastava aine kontsentratsioon maksimaalne MINIMAALNE ELUEERIMISMAHT (Vxmin ): - kui segus on molekule, mis on liiga suured, et mahtuda kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena ehk kõige kiiremini - võrdne graanulitevahelise vedeliku mahuga Vxmin = Vv MAKSIMAALNE ELUEERIMISMAHT (Vxmax): - Ained, mille molekulmass on väiksem, difundeeruvad täielikult geeli pooridesse ning liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt - on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule Vt. Kromatografeerimise protsess on lõpetatud, kui kolonnist väljunud vedeliku (eluaadi) üldmaht võrdub ligikaudu kolonni kogumahuga. Kui geelimaatriksi maht Vg on teada, siis võib maksimaalse elueerimismahu ka arvutada
See on eluaadi maht, mis on kogutud kuni aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni. Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena, st neil on minimaalne elueerimismaht Vxmin, mis võrdub kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv Ained, mille molekulid on piisavalt väiksed, et mahtuda täielikult geeli pooridesse väljumad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on ligilähedane kolonni kogumahule Vxmax Vt . Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui kolonni läbinud vedelikku maht ületab kolonni kogumahtu. Töö käik. Kolonni tätmine ja iseloomustamine Täidetud kolonnile arvutatakse geelisamba kõrguse ja diameetri alusel täidise kogumaht Vt Geelisamba kõrgus = 31cm Sissediameeter = 1,8cm Vt = r2h = 3,14*0,92*31= 78,85 cm3 Vastavalt kolonni täitematerjalli iseloomustava teguri k väärtusele leitakse geelimatriksi maht V g k = 0.1 Vg = k*Vt = 0,1* 78,85 = 7, 885 cm3
lainepikkusel. Lainepikkused, millel mõõtmine läbi viiakse, sõltuvad uuritavate ainesegude koostisest ja need soovitab praktikumi juhendaja. Absorptsiooni mõõdetakse spektrofotomeetritel. Koostage kromatogramm, mille y-teljel on optiline tihedus ja x+teljel eluaadi maht, märkides ära Vminx, Vx ja Vmaxx asukohad. Dekstraansinine müoglobiin DNP-aspartaat Vxmin =21 ml Vx= 33 ml Vxmax= 73ml Vx - Vxmin 33-21 Rf = = = 0,230 73-21 Vxmax - Vxmin Järeldused Katse õnnetus enam-vähem. Erinevus teoreetilise ja saadud Vxmax-i vahel võis olla tingitud kolonni mahu määramises (kõrgus ja sisediameetri mõõtmisel)
Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud: 1) Vv kolonni vaba maht ehk graanulitevahelise vedeliku maht. Kolonni vaba maht on võrdeline minimaalse elueerimismahuga Vxmin (väljub kolonnist esimesena). 2) VS graanulitesisese vedeliku maht 3) Vg geelimaterjali ehk maatriksi maht 4) Vt täidise kogumaht ehk üldmaht. On arvväärtuselt lähedane maksimaalse elueerimismahuga Vxmax. Töö käik Kolonni iseloomustamine Kasutusel on geelkromatograafia kolonn nr 3 (aknast kõige kaugemal). Kolonni täidiseks oleva Sephadex'i mark G-75 k = 0,1 Fraktsioneerimispiirkond: 3000 80000 D Materjal: dekstraan Täidise kõrgus L = 33 cm Täidise diameeter d = 1,8 cm ; r = 0,9 cm Täidise kogumaht Vt = r 2 L = 0,9 2 33 = 83,98cm3 Geelmaatriksi maht Vg = k Vt = 0,1 83,98 = 8, 40cm3 Maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt - Vg = 83,98 - 8, 40 = 75,58cm3
1 V (ml) A B C C. Kõige esimesena väljus kolonnist dekstraansinine, kõige suurema molekulmassi tõttu. järgmisena väljus müglobiin millel on väiksem molekulmass kui dekstraansinisel, kuid suurem kui D-aspartaadil. Viimasena väljuski kõige väiksema molekulmassiga D-aspartaat. Vxmin=Vv=> 27,45 ml Vx=> 41,45 ml Vxmax= 67,45 ml D. Arvutuslik Vxmax=> 64,38 cm3 ja viimasena väljunud komponendi Vxmax=> 67,45 ml, mis pole väga trastiliselt erinev. E. Rf = (Vx – Vx min) / (Vx max – Vx min) Rf = (41,45-27,45)/(67,45-27,45)= 0,35
Ainete kindlakstegemiseks eluaadi fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrit. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine · Kolonn asetataksse statiivile vertikaalselt · Kolonni täidise mark ja seda iseloomustav tegur k märgitakse üles. · Mõõdetakse geeli kõrgus L ja diameeter d. · Arvutatakse geeli kogumaht Vt. · Arvutatakse geelmaatriksi maht Vg ja kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax. · Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, võttes ühe fraktsiooni mahuks 2 ml. · Katseklaasistatiivi asetatakse arvule n vastav katseklaaside hulk, nummerdatakse. · Valmistatakse ette voolutuslahus ja leitakse sobiv pipett lahuse kolonni viimiseks. · Varutakse väike keeduklaas, kuhu kogutakse geeli pinnal olev eluent. Segu komponentide lahutamine · Avatakse kolonni väljavooluava ning kogutakse täidise kohal olev eluent keeduklaasi.
D. Viimasena väljunud komponendi elueerimismahtu võrreldakse arvutusliku Vx;max väärtusega. Arvutuslikult sain, et Vx;max=95.4ml. Katse tulemusel sain aga 90 ml. On näha, et need on natukene erinevad. Arvatavasti on põhjus ebatäpses fraktsioonide kogumises või viimaste fraktsioonide kogumatajätmises,kuna silmaga vaadates enam värvi ei paistnud. E.Leian liikuvusteguri Rf väärtuse segus sisaldunud valkude jaoks, kasutades Rf arvutusvalemis kolonni arvutuslikku Vxmax väärtust. Rf=(Vx-Vxmin)/(Vxmax-Vxmin)= (56ml-32ml)/(95.4ml-32ml)=24ml/63.4=0.38. Juhendis on antud müoglobiini liikuvusteguriks Rf=0.55, kuid selles näites oli kasutatud ka teist marki Sephandex geeli.
maksimaalne. Kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena (kõige kiiremini), st minimaalse elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga. Vx min = Vv Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse, liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, milline on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule Vt. 48 Seega võib kromatografeerimise protsessi lugeda lõpetatuks, kui kolonnist väljunud vedeliku (eluaadi) üldmaht võrdub ligikaudu kolonni kogumahuga. Vxmax Vt Kui geelimaatriksi maht Vg on teada, siis vib maksimaalse elueerimismahu Vxmax ka arvutada. Vx max = Vt Vg
Kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena (kõige kiiremini), st minimaalse elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga. Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse, liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, 15 milline on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule Vt. 7. Mis on liikuvustegur Rf ja kuidas seda geelkromatograafia meetodi puhul arvutatakse? Millised on Rf piirväärtused? Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx vaadeldavas kolonnis on kindlaks määratud, iseloomustatakse
esimene aine maksimaalse kontsentratsiooniga Maksimaalne lähedane kolonni mahule ning maht, mille juures viimane aine väljub maksimaalse kontsentratsiooniga. 7. Mis on liikuvustegur Rf ja kuidas seda geelkromatograafia meetodi puhul arvutatakse? Millised on Rf piirväärtused? Liikuvustegur näitab aine liikumist kolonnis võrreldes teiste ainete liikumiskiirustega. Piirväärtused 0 ja 1. Rf = Vx Vxmin / Vxmax Vxmin 8. Mida mõistetakse neelduvuse ehk optilise tiheduse (A ehk D) all? Optiline tihedus näitab lahuse kontsentratsiooni, sest võrdleb proovile suunatava valguse intensiivust proovi läbiva valguse intensiivsusega. Mida kontsentreeritum on uuritav lahus, seda enam valgus seal neeldub. 9. Millistest teguritest sõltub teatava lainepikkuse juures mõõdetud optilise tiheduse väärtus (avaldis vastavalt Beer'i seadusele)?
annaabi.ee 
