PCR viiakse läbi biokeemilise reaktsioonina ja selle puhul ei vajata elusorganisme DNA kopeerimiseks. Reaktsioon pôhineb ensüümi- DNA-polümeraas kasutamisel, mis katalüüsib DNA komplementaarse ahela sünteesi. PCR on DNA-molekuli paljundamine kunstlikes tingimustes. Reaktsiooni läbiviimiseks on vajalik teada uuritava DNA lôigu otste nukleotiidset järjestust. Reaktsiooni käivitamiseks kasutatakse kahte oligonukleotiidset (väiksest arvust nukleotiididest koosnevat- 8..30) praimerit (ingl. k. primer), mis kumbki vastavad ühe komplementaarse DNA ahela alguse nukleotiidsele järjestusele ja talitlevad kui ensüümi substraat, kuna neil on vabad otsad uute nukleotiidide sidumiseks. PCR pôhietapid on järgmised: 1) topeltahelalise DNA denaturatsioon kaheks üksikahelaks kôrge temperatuuriga (90-95 °C; 40-60 sek); 2) praimerite hübridiseerimine e. "istutatamine" kummalegi üksikahelale, milleks temperatuur viiakse alla ca 50 °C juurde 30 sekundiks;
Transkriptsioon- RNA molekuli süntees DNA info põhjal. DNA ahelale sünteesitakse komplementaarne RNA üksikahel, mida nimetatakse transkriptiks. RNA- üksikahelaline polünukleotiidide ahel. Suhkruks on riboos. Alusteks adeiin, guaniin, tsütosiin ja uratsiil. RNA molekulide tüübid: mRNA- kodeerib valke (translatsioon) tRNA- transpordi RNA rRNA- ribosoomide koostises snRNA- väikesed tuuma RNAd, osalevad nitronite splaissimisel. RNA sünteesiks ei ole vaja praimerit. Iga RNA molekuli süntees algab uue molekuli sünteesiga päris algusest. RNA polümeraas- ensüüm, mis sünteesib DNA ahelale komplementaarse RNA ahela. Pöördtranskriptsioon e. revertaas- ensüüm, mis sünteesib RNA ahelale komplementaarse DNA ahela. Vajab praimerit. Promootor- DNA järjestus, millele RNA polümeraas seondub. Selle abil saab reguleerida geeni ekspressiooni. Konstitutiivne promootor- ekspressioon toimub kogu aeg igas taime osas.
3) Võimaldavad lineaarsete DNA molekulide otste replitseerumist, ilma et DNA molekulid kaotaksid replikatsiooni käigus otstest geneetilist materjali. 48. Nukleiinhapete sünteesi suund ja nukleiinhapete sünteesi läbiviivad ensüümid. Nukleiinhappe ahel kasvab 5'->3' suunas. Nukleiinhapete sünteesi läbiviivad polümeraasid: 1) DNA polümeraas ensüüm, mis sünteesib DNA ahelale komplementaarse DNA ahela. Toimub replikatsioon. Vajab praimerit. 2) RNA polümeraas ensüüm, mis sünteesib DNA ahelale komplementaarse RNA ahela. Toimub transkriptsioon. Ei vaja praimerit. 3) Pöördtranskriptaas ehk revertaas - Sünteesib RNA ahelale komplementaarse DNA ahela. Vajab praimerit. 49. DNA replikatsiooni kolm mudelit konservatiivne, dispersiivne ja semikonservatiivne. Milline neist mudelitest leidis eksperimentaalselt kinnitust? Konservatiivne - algselt kaksikheeliksilt sünteesitakse uus kaksikheeliks
Üheahelaine DNA stabiliseeritakse kogu protsessi vältel spetsiaalse valguga Replikatsiooni mudel E. coli Replikatsioon on juhtahelal pidev, vastasahelal katkendlik Replikatsiooni kahvlis despiraliseerumine ühesuunaline Ahelad on vastaspolaarsed, DNA polümeraas töötab aga vaid 5' 3' suunas See probleem on lahendatud eri ahelatel erinevalt. Juhtahel toimub 5' 3' suunas nii nagu liigub repl. kahvel, on pidev nõuab üht RNA praimerit Alanev ahel sünteesib vastaspoolele, on fragmentidena süntees ja iga fragmendi jaoks oma praimer Superspiraliseerunud DNA despiraliseeritakse güraasi ja helikaasiga: 5' SSB valk Okazaki Fragment 1 ATP Polümeraas III 2 Helikaas Alanev ahel 3 +
ilma et molekulid otstest geneetilist materjali kaotaks. 48. Nukleiinhapete sünteesi suund ja nukleiinhapete sünteesi läbiviivad ensüümid. DNA ahel kasvab 5'3' suunas. Matriitsina käituvad mõlemad DNA ahelad; tulemusena saadakse kaksikheeliksid, millest kummaski on üks uus ja üks vana ahel. Sünteesi läbi viivaid ensüüme on kolm: 1) DNA polümeraas. Sünteesiv DNA ahelale komplementaarse ahela. Sünteesiks on vja praimerit (= lühike DNA või RNA ahel, mis onmatriitsahelaga paardunud). 2) RNA polümeraas. Sünteesib DNA ahelale komplementaarse RNA ahela. Praimerit pole vaja. Transkriptsiooni initsiatsiooniks seondub RNA polümeraas spetsiifiliselt promootorjärjestusega. 3) Pöördtranskriptaas e revertaas. Sünteesib RNA ahelale komplementaarse DNA ahela. Sünteesiks vaja praimerit. 49. DNA replikatsiooni kolm mudelit konservatiivne, dispersiivne ja semikonservatiivne.
käigus otstest geneetilist materjali. 48. Nukleiinhapete sünteesi suund ja nukleiinhapete sünteesi läbiviivad ensüümid. DNA ahel kasvab 5’3’ suunas. Sünteesitavasse DNA ahelasse lülituvad nukleotiidi, mille lämmastikalused on komplementaarsed matriitsahela nukleotiidide lämmastikalusega. Ensüümid: DNA polümeraas – sünteesib DNA ahela komplementaarse ahela; vajab sünteesil praimerit (lühike DNA v RNA ahel, mis on paardunud matriitsahelaga), RNA polümeraas – sünteesib DNA ahelale komplementaarse RNA ahela; transkriptsiooni initsiatsiooniks seondub RNA polümeraas spetsiifiliselt promootorjärjestusega ning seejärel katkevad promootorpiirkonnas DNA ahelate vahelised vesiniksidemed. Ei vaja initsiatsiooniks praimerit, pöördtranskriptaas ehk revertaas – sünteesib RNA ahelale
hiljem kinnitust, et see on õige). Dispersiivne: Mõlema DNA tütarahelad koosnevad uutest ja vanadest DNA segmentidest. 50. DNA replikatsiooni initsiatsiooni mehhanism. DNA helikaas katalüüsib kaksikahela eraldumist, nii et tekib üksikahel. Replikatsioon saab toimuma hakata kindlatest piirkondadest – ori-regioonid. Seejärel on vaja sünteesida praimer, mida teeb kas primaas või RNA polümeraas. Praimerit on vaja, sest DNA polümeraas saab sünteesida ainult olemasolevat ahelat - praimer on selleks algeks. Praimeri külge kinnitub DNA polümeraas. 51. Erinevate DNA polümeraaside funktsioonid bakterites. Mis mehhanismidega on tagatud DNA replikatsiooni täpsus? Pol I ja Pol II – DNA reparatsioon Pol III – põhiline süntees Pol IV ja Pol V – DNA süntees, kui Pol III töö on vea tõttu blokeerunud.
- 15-30 nukleotiidi pikk üheahelaline DNA lõik; vajalik komplementaarsuse tõttu saavad seonduda uuritava DNA molekulile ja selle tähistada 19. Mille poolest erineb multiplex PCR tavalisest PCR-ist?-sama PCR ajal kasutatakse mitut praimerite paari, mitme erineva mikroobi tuvastamiseks samast DNA proovist 20. Mille poolest erineb real-time PCR tavalisest PCR-ist?- võimaldab hinnata algmaterjali kogust, nt. DNA koopia arvu meid huvitavas lookuses. Kasutatakse veel kolmandat praimerit, mille ühes otsas on fluorestsents märgis ja teises nn summutaja. On võimalik kasutada ka kaheahelalise DNA-ga seonduvaid värve. 21. Kuidas on võimalik PCR-iga paljundatud DNAt visualiseerida?- agaroos sulatatakse puhvris->geeli valades pannakse paika geelikamm->tardunud geeli korral kamm eemaldatakse->tekkinud süvenditesse valatakse DNA->Geel valatakse puhvriga üle->DNA koos glütserooli sisaldava värvainega pannakse süvendi põhja-> DNA on negat
uuritava DNA kogust. 11 B: PCR (1) Kõigepealt lahjenda plasmiidset DNA-d (~100 ng/l) 50-100 korda. Lahjendus teha TE-s. Ei lahjendanud. (2) Koosta 100 l PCR reaktsioonisegu ehk nn. "master-mix" (üks segu ~10 üliõpilase peale) järgnevatest komponentidest: 62 l H2O 10 l 10x Taq polümeraasi puhvrit 8 l 25 mM MgCl2 10 l 2 mM dNTP 5 l mõlemat nii T3 ja T7 praimerit (100 ng/l) ja viimasena lisa 1 l (5 ühikut) Taq polümeraasi (hoida jääl). Seejärel kanna saadud kogus 9-10 l kaupa kümnesse PCRi mikrotuubi laiali. (3) Lisa PCR tuubi 1 l (1-2 ng) lahjendatud DNA-d. (4) Paiguta tuubid PCRi masinasse ja vali profiil (denaturatsioon 95 oC 30s, hübridisatsioon ehk annealing 50 oC 30s ja ekstensioon 72 oC 1 min; 20 tsüklit). Alusta PCR'i. Tegime 15 tsüklit. (5) Samal ajal valmista 1,2% geel. 40 ml TBE puhvri kohta on vaja kaaluda 0,6 g agaroosi.
48. Nukleiinhapete sünteesi suund ja nukleiinhapete sünteesi läbiviivad ensüümid. · Nukleiinhappeid sünteesitakse 5' -> 3' suunas. Fosfodiesterside moodustub ahela viimase nukleotiidi 3'-OH rühma ja lisanduva nukleotiidi 5' süsinikuga seotud fosfaadi vahele. · Ensüümid, mis viivad läbi nukleiinhapete sünteesi: DNA polümeraas sünteesib ühele DNA ahelale komplementaarse DNA ahela; vajab praimerit, mis on paardunud matriitsahelaga (praimer lühike oligonukleotiid DNA või RNA ahel) RNA polümeraas sünteesib DNA ahelale komplementaarse RNA; seondub spets. promootorjärjestusega ; praimerit pole vaja Pöördtranskriptaas ehk revertaas sünteesib RNA ahelale komplementaarse DNA; vajab sünteesil praimerit · Muud ensüümid: DNA helikaas katalüüsib DNA ahelate üksteisest eraldumist
mille abil on võimalik määrata inserdi suurust ja kui võimalik standard DNA, mille abil saab määrata uuritava DNA kogust. 9 B: PCR (1) Kõigepealt lahjenda plasmiidset DNA-d (~100 ng/l) 50-100 korda. Lahjendus teha TE-s. (2) Koosta 100 l PCR reaktsioonisegu ehk nn. "master-mix" (üks segu ~10 üliõpilase peale) järgnevatest komponentidest: 62 l H2O 10 l 10x Taq polümeraasi puhvrit 8 l 25 mM MgCl2 10 l 2 mM dNTP 5 l mõlemat nii T3 ja T7 praimerit (100 ng/l) ja viimasena lisa 1 l (5 ühikut) Taq polümeraasi (hoida jääl). Seejärel kanna saadud kogus 9-10 l kaupa kümnesse PCRi mikrotuubi laiali. (3) Lisa PCR tuubi 1 l (1-2 ng) lahjendatud DNA-d. (4) Paiguta tuubid PCRi masinasse ja vali profiil (denaturatsioon 95 oC 30s, hübridisatsioon ehk annealing 50 oC 30s ja ekstensioon 72 oC 1 min; 20 tsüklit). Alusta PCR'i. (5) Samal ajal valmista ...% geel. 40 ml TBE puhvri kohta on vaja kaaluda ... g agaroosi. Valmistamist
Telomeerid: · Takistavad DNA molekulide otste lagundamist nukleaasi poolt · Takistavad erinevate DNA molekulide otste kleepumist · Võimaldavad lineaarsete DNA molekulide otste replitseerumist ilma, et DNA molekulid kaotaksid otstest geneetilist materjali. 48. Nukleiinhapete sünteesi suund ja nukleiinhapete sünteesi läbiviivad ensüümid. Sünteesitakse 5'otsast 3' otsa suunas. DNA polümeraas DNA ahelale komplementaarse ahela, vajab sünteesil praimerit, milleks on lühike DNA või RNA ahel, mis on paardunud matriitsahelaga. RNA polümeraas sünteesib DNA ahelale komplementaarse RNA ahela, transkriptsiooni initsiatsiooniks seondub RNA polümeraas spetsiifiliselt promootorjärjestusega. Pöördtranskriptaas ehk revertaas sünteesib RNA ahelale komplementaarse DNA ahela. 49. DNA replikatsiooni kolm mudelit konservatiivne, dispersiivne ja semikonservatiivne
45. Polümeraasi ahelreaktsioon Viimase mõnekümne aasta üks olulisemaid läbimurdeid DNA analüüsi valdkonnas. Töötas välja Kary Mullis 1983. Lühidalt võimaldab PCR ka väga väikest kogust DNA'd paljudnda mitme suurusjärgu võrra. Paljundatakse pikast DNA molekulist korduvalt ainult mingit konkreetset lõiku. Taoline DNA paljundamine tänu erilistele praimeritele → pikemat tüüpi DNA fragmendid. Kasutatakse kokku kahte praimerit (täpsemalt kahte eri järjestusega praimerit, mõlemat lisatakse reaktsioonisegusse väga suurtes kogustes), mille järjestus ja seondumiskohad DNA ahelale on meile teada. Nendest praimeritest üks seondub DNA kaksikheeliksi ühele ahelale ja teine praimer teisele praimerile, nõnda piiritledes ära selle DNA lõigu, mida tahad paljundada. PCR käigus viiakse DNA süntees läbi keskmiselt 20-40 korda järjest. Iga sünteesireaktsioon moodustab ühe “PCR tsükli”. Tsükkel koosneb sisuliselt
µl 2,0 µl 10x polümeraasi puhvrit loob sobiva keskkonna, et polümeraas töötaks 2,0µl 25mM MgCl2 on polümeraasi ko-faktoriks, seega (lõppkontsentratsioon 2,5mM) mõjutab reaktsiooni spetsiifilisust 2,4µl 2mM dNTP et segus oleks vabu nukleotiide (lõppkontsentratsioon 240µM) 1,0µl Pärisuunalist praimerit Polümeraasi seondumiseks 5´ (lõppkontsentratsioon 0,5µM) poolele 1,0µl Vastassuunalist praimerit Polümeraasi seondumisesk 3´ (lõppkontsentratsioon 0,5µM) poolele 0,2µl template-DNA sisaldab regiooni, mida tahetakse (lõppkontsentratsioon praimerite abil amplifitseerida 0,25ng/µl) 0,1µl HotFIRE Pol Polümeraas (0,5U) Termostabiilne polümeraas,
DNA replikatsiooni käigus lülitatakse kasvavasse DNA ahelasse inimesel 3000 nukleotiidi minutis, bakteril 30000 nukleotiidi minutis. · Replikatsioonil käituvad matriitsina mõlemad DNA ahelad ning replikatsiooni lõppproduktideks on kaksikheeliksid, milles üks ahel on uus ja teine vana (semikonservatiivne mudel). DNA replikatsiooni initsiatsioon · spetsiifiliste initsiatsiooni regioonide ori regioonide olemasoluga. vajalik DNA ahelate lokaalne lahtikeerdumine ning praimeri süntees (praimerit on vaja selleks, et sünteesitaval polünukleotiidahelal oleks vaba 3'-OH ots, kuhu DNA polümeraas saab liita nukleotiide). · Vajalik ka AT-rikas regioon ja teatud DNA järjestused Replikatsioon toimub interfaasis Praimer - uue ahela algus · Lühike oligonukleotiidi (DNA või RNA) järjestus, mis on komplementaarne DNA järjestusega. · Vajalik DNA ahela sünteesi alustamiseks, sest polümeraasil on vaja vaba 3'-OH otsa. DNA helikaas - Eraldab DNA ahelad teineteisest.
temperatuuride muutmisel. Selleks on PCR-masin, millesse asetatakse 0,2 ml-sed tuubid DNA-proovidega ja käivitatakse programm, mis automaatselt kuumutab-jahutab kindlal temperatuuril kindlate ajavahemike järel. (PCR) vajalikud komponendid (joonis 5.2.2.4.): DNA proov, mida uuritakse; DNA-plümeraas, täpsemalt on see kuumaveebakteri nimest tulenev Taq-polümeraas; Nukleotiidid – A, G, C, T, mida läheb DNA molekuli sünteesiks vaja; 2 praimerit (tavaliselt 15–25 nukleotiidi pikkused DNA lõigud ), millest üks on komplementaarne uuritava DNA-lõigu ühe otsaga ja teine on komplementaarne teise otsaga; puhverlahus, mis on keskkonnaks. PCR ETAPID 1) tuubis oleva dna denatureerimine. Temperatuur tõstetakse 90–95 °C juurde, mille käigus DNA biheeliks laguneb kaheks üksikahelaks - denatureerub. 2) Praimerite seondumine DNA ahelatega. Temperatuur langetatakse 50–70 °C juurde.
48. Nukleiinhapete sünteesi suund ja nukleiinhapete sünteesi läbiviivad ensüümid. DNA ahel kasvab 5´→ 3´suunas. Sünteesitavasse DNA ahelasse lülituvad nukleotiidid, mille lämmastikalused on komplementaarsed matriitsahela nukleotiidide lämmastikalustega. DNA replikatsioonil käituvad matriitsina mõlemad DNA ahelad; saadakse kaksikheeliksid, milles üks ahel on uus ja teine vana DNA polümeraas – sünteesib DNA ahelale komplementaarse ahela. vajab sünteesil praimerit. RNA polümeraas – sünteesib DNA ahelale komplementaarse RNA ahela; transkriptsiooni initsiatsiooniks seondub RNApolümeraas spetsiifiliselt promootorjärjestusega. Pöördtranskriptaas e. revertaas – sünteesib RNA ahelale komplementaarse DNA ahela; vajab sünteesil praimerit. 49. DNA replikatsiooni kolm mudelit – konservatiivne, dispersiivne ja semikonservatiivne. Milline neist mudelitest leidis eksperimentaalselt kinnitust?
Mis on replikatsioon? Replikatsioon on DNA kahekordistumine enne raku jagunemist. tulemusena saadakse ühest DNA molekulist kaks ühesuguse nukleotiidse järjestusega DNA molekuli. Replikatsiooni etapid: 1. Ensüüm helikaas lõhub vesiniksidemed lämmastikaluste vahel ja keerab kaksikspiraali lahti Praimer - lühike (DNA või RNA) järjestus, mis on komplementaarne DNA järjestusega. 2. Ensüüm DNA-polümeraas seondub DNA ahelaga (vajab töö alustamiseks praimerit, millele saab lisadavesimese nukleotiidi) -> sünteesib mõlema DNA ahelaga komplementaarsed uued DNA ahelad Okazaki fragmendid - lühikesed DNA jupid, millest pannakse kokku ahel, mis on komplementaarne DNA replikatsioonil mahajäävale ahelale DNA ligaas - ensüüm, mis liidab DNA ahelate otsad (Okazaki fragmendid) 3. Replikatsioon lõpeb, kui mõlemalt DNA-ahelalt on sünteesitud uus DNA molekul 4. Repiklatsiooni käigus tekkinud vigade parandamine
praimeri ja matriitsi olemasolul. Esmalt DNA helikaas lahutab kaheahelaline DNA. Praimer on vaba 3’OH rühmaga nukleotiidjärjestus, millelt alustatakse matriitsahela alusel DNA süntees. 3’OH otsa lisatakse sünteesil desoksüribonukleotiidid (5’fosfaat). 3’OH ja 5’ fosfaadi vahele tekib fosfodiesterside. Süntees toimub 5’-3’ suunas. DNA replikatsioon on kahesuunaline. Ühelt ahelalt toimub pidev süntees st juhtiv ahel (süntees toimub 5’3’ suunas, vaja ühekordselt praimerit). Mahajääv ahel sünteesitakse Okazaki fragmentidena, mis omavahel (ükiskahelalisi katkeid) liidab DNA ligaas (3’- 5’ suunas). Vajatakse iga fragmendi sünteesiks uuesti praimerit, mille DNA praimaas sünteesib matriitsahela alusel (praimeriteks sünteesitakse lühikesed RNA fragmendid). Hiljem kõrvaldatakse RNA praimerid ja asendatakse DNA lõikudega. Replikon - üks replikatsiooni ühik, peab sisaldama replikatsiooni alguse ja lõpu signaale. Algus on ORI sait, lõpp
Samas pikendatakse replikatsioonikahvlis mõlemat DNA ahelt. 5'® 3' suunas kasvava DNA ahela puhul toimub pidev DNA süntees. Seda DNA ahelat nimetatakse juhtivaks ahelaks (leading strand). Teise ahela puhul, mis pikeneb 3' ® 5' suunas, toimub tegelikult samuti 5'® 3' suunaline süntees, kuid katkendlikult, lühikeste fragmentidena, mida nimetatakse Okazaki fragmentideks. Seda DNA ahelat nimetatakse mahajäävaks ahelaks (lagging strand). DNA sünteesi alustamiseks on vaja vaba 3'-OH otsaga praimerit. Juhtiva ahela süntees vajab praimerit ainult replikatsiooni alguspunktis Okazaki fragmentide puhul on iga fragmendi sünteesiks vaja uut praimerit. Okazaki fragmentide sünteesi initsiatsiooniks on vaja valkkompleksi, mida nimetatakse praimosoomiks. Praimosoom koosneb DNA helikaasist ja primaasist. Praimosoom liigub mööda DNA molekuli, kasutades ATP energiat. DNA helikaas keerab lahti DNA kaksikahela ja DNA primaas sünteesib praimeri. RNA praimeritelt jätkab sünteesi DNA polümeraas III
snRNA-de sünteesi. RNA pIII koosneb 17-st subühikust ning katalüüsib tRNA, osade snRNA-de ja 5SrRNA sünteesi. Prokarüootides: RNA polümeraas ensüüm, mis sünteesib DNA ahelale komplementaarse RNA ahela. Toimub transkriptsioon. Transkriptsiooni initsiatsiooniks seondub RNA polümeraas spetsiifiliselt promootorjärjestusega ning seejärel katkevad promootrorpiirkonnas DNA ahelate vahelised vesiniksidemed. Ei vaja initsiatsiooniks praimerit. 7. TBP on esimene valk, mis "istub" TATAbox promootorile, TATA-siduv proteiin. Temal on oluline roll RNAPolII-katalüüsitud snRNAde geenide transkriptsioonis. TBP seondub DNA väiksese valku, rikub DNA normaalse dupleksi struktuuri, koolutades/väänates DNAd oluliselt. 9. eIF1 (15 kDa) koos eIF1A-ga (16 kDa) on vajalik 43S-i skaneerimiseks mRNA-l. eIF2 (koosneb 3 valgust: a - 35 kDa, b - 38 kDa ja g -52 kDa). a alaühiku fosforüleerimine
antigeen olemas. hemaglutiniini inhibitsioon – antikeha uuring, gripiviirus, paragripp, adenoviirus – seerumist 2x lahjendused, igasse 4 hemaglutineerivat antigeeni ühikut, lisame erütrotsüüdid. 19. Molekulaarbioloogilised uurimismeetodid (PCR) PCR – tundlik ja efektiivne. Mullis. 1 päevaga tulemused, lihtne, algmaterjali vaja vähe – koguaeg 2kordistub, pole vaja radioaktiivseid elemente (nt blottimisel on vaja). Vaja 2 praimerit, Taq polümeraasi. Töötsükkel: kokku 25-30x 1. DNA denaturatsioon – 92 kraadi 2. praimeri seondumine – 50 kraadi 3. Taq polümeraasi tööks – elongatsioon – 72 kraadi. Jäämäe konseptsioon: jäämäe alumine osa – ei märka mitte midagi, subkliiniline, haigusnähud puuduvad, neid põhjustavad defektsed viirused. jäämäe pealne osa – ilmekad haigustunnused, loomad paranevad ise multisüsteemsed haigused – põhjustavad varieeruvat pilti.
chain reaction) kasutamine. PCR viiakse labi biokeemilise reaktsioonina ja selle puhul ei vajata elusorganisme DNA kopeerimiseks. Reaktsioon pohineb ensuumi DNA-polumeraas kasutamisel, mis kataluusib DNA komplementaarse ahela sunteesi. PCR on DNA-molekuli paljundamine kunstlikes tingimustes. Reaktsiooni labiviimiseks on vajalik teada uuritava DNA loigu otste nukleotiidset jarjestust. Reaktsiooni kaivitamiseks kasutatakse kahte oligonukleotiidset vaiksest arvust (8..30) nukleotiidist koosnevat praimerit (ingl. k. primer), mis kumbki vastavad uhe komplementaarse DNA ahela alguse nukleotiidsele jarjestusele ja talitlevad kui ensuumi substraat, kuna neil on vabad otsad uute nukleotiidide sidumiseks. PCR pohietapid on jargmised: 1) topeltahelalise DNA denaturatsioon kaheks uksikahelaks korge temperatuuriga (90-95 °C; 40-60 sek); 2) praimerite hubridiseerimine e "istutatamine" kummalegi uksikahelale, milleks viiakse temperatuur alla ca 50 °C juurde 30 sekundiks;
suunas: lisades nukleotiide DNA ahela 3' otsale. DNA polümeraas DNA polümeraasid moodustavad ensüümiperekonna, mis viivad läbi igat DNA replikatsiooni.[3] DNA polümeraas saab lisada vabu nukleotiide ainult sünteesitava ahela 3' otsa, selle tõttu toimub uue ahela pikendamine 5'-3' suunas. Ükski teadaolev DNA polümeraas ei ole võimeline alustama täiesti uue ahela sünteesi, vajatakse vaba 3'-OH rühmaga praimerit, millele esimene nukleotiid liita. Praimerid koosnevad RNA ja/või DNA aluspaaridest. DNA replikatsiooni puhul on kaks esimest aluspaari alati RNAd ning neid sünteesib ensüüm nimega praimaas. Ensüümi nimega helikaas vajatakse kaheahelalise DNA struktuuri lahtikeerdumiseks üheahelaliseks. Lahtikeerdumine on vajalik, et replikatsioon saaks alata mõlemalt ahelalt. Paljudel DNA polümeraasidel on vigadeparanduse funktsioon, mida nimetatakse proofreadinguks
avalduvad geenid, näiteks: loote elundkondade väljaarenemine. 4)Geenid, mis ei avaldu mitte kunagi evolutsioonis, kaotanud oma tähtsuse. Geenide aktiivsust reguleerivad : struktuurgeenid, mis määravad raku ehituses ja ainevahetuses osalevate valkude, tRNA ja rRNA sünteesi, ning regulaatorgeenid kontrollivad struktuurgeenide avaldumist. toimub 5’-3’ viib läbi RNA polümeraas - prokarüootidel abifaktor σ ei vaja praimerit süntees algab promootorilt ... - kindel DNA signaaljärjestus, seonduvad regulaatorvalgud ... lõppeb terminaatorini jõudmisel - DNA järjestus, kus RNA pol vabastab sünteesitud RNA Initsiatsioon (RNA pol seondub DNA promootorile ning algab transkript), pärast seda vabastatkse promootor ning algab elongatsioon (sünteesimine), terminatsioon (elongatsiooni lõppemiseks on vajalik terminatsiooni signaal, lõpuks lõpetatakse süntees)
3)Rakkude mingil kindlal elutegevuse etapil avalduvad geenid, näiteks: loote elundkondade väljaarenemine. 4)Geenid, mis ei avaldu mitte kunagi evolutsioonis, kaotanud oma tähtsuse. Geenide aktiivsust reguleerivad : struktuurgeenid, mis määravad raku ehituses ja ainevahetuses osalevate valkude, tRNA ja rRNA sünteesi, ning regulaatorgeenid kontrollivad struktuurgeenide avaldumist. toimub 5'-3' viib läbi RNA polümeraas - prokarüootidel abifaktor ei vaja praimerit süntees algab promootorilt ... - kindel DNA signaaljärjestus, seonduvad regulaatorvalgud ... lõppeb terminaatorini jõudmisel - DNA järjestus, kus RNA pol vabastab sünteesitud RNA Initsiatsioon (RNA pol seondub DNA promootorile ning algab transkript), pärast seda vabastatkse promootor ning algab elongatsioon (sünteesimine), terminatsioon (elongatsiooni lõppemiseks on vajalik terminatsiooni signaal, lõpuks lõpetatakse süntees)
muutuv nähtus. See on oluline platsenta kasvus, arengus ja toitainete transpordis. Kaarel Krjutškov 1. Millised on FACSi eelised võrreldes käsitsi pipeteerimise ees, kui uuritakse transkriptoomi ühe raku tasandil? FACSi eelistatakse, kui on vaja väga kõrge kvaliteeti saavutada puhastamisel, kui rakk ekspresseerib väga madalal tasemel uuritavat markerit. 2. Miks kasutatakse UMI-t ning ankurdatud polü-T praimerit? UMI – unique molecular identifier – märgistatud järjestus ja 5’ positsioon mRNAl moodustavad UMI. Ehk UMId märgistavad transkriptid ning võimaldab neid kvantitatiivselt detekteerida. polüT praimereid kasutatakse polüadenüleeritud mRNA pöördtranskriptsiooniks ja cDNA sünteesiks. Sünteesitud cDNA 3’ otsa lisatakse polüA saba terminaalse desoksünukleotidüül transferaasi vahendusel, et varustada cDNA mõlemad otsad
põhikomponente selleks vajatakse, millised on PCRi põhietapid? Reaktsioon pôhineb ensüümi- DNA-polümeraas kasutamisel, mis katalüüsib DNA komplementaarse ahela sünteesi. PCR on DNA-molekuli paljundamine kunstlikes tingimustes. Reaktsiooni läbiviimiseks on vajalik teada uuritava DNA lôigu otste nukleotiidset järjestust. Reaktsiooni käivitamiseks kasutatakse kahte oligonukleotiidset (väiksest arvust nukleotiididest koosnevat- 8..30) praimerit (ingl. k. primer), mis kumbki vastavad ühe komplementaarse DNA ahela alguse nukleotiidsele järjestusele ja talitlevad kui ensüümi substraat, kuna neil on vabad otsad uute nukleotiidide sidumiseks. PCR põhietapid on järgmised: 1) topeltahelalise DNA denaturatsioon kaheks üksikahelaks kôrge temperatuuriga (90-95 °C; 40-60 sek); 2) praimerite hübridiseerimine e. "istutatamine" kummalegi üksikahelale, milleks temperatuur
11) PCR viiakse läbi biokeemilise reaktsioonina ja selle puhul ei vajata elusorganisme DNA kopeerimiseks. Reaktsioon pôhineb ensüümi- DNA-polümeraas kasutamisel, mis katalüüsib DNA komplementaarse ahela sünteesi. PCR on DNA- molekuli paljundamine kunstlikes tingimustes. Reaktsiooni läbiviimiseks on vajalik teada uuritava DNA lôigu otste nukleotiidset järjestust. Reaktsiooni käivitamiseks kasutatakse kahte oligonukleotiidset (väiksest arvust nukleotiididest koosnevat- 8..30) praimerit (ingl. k. primer), mis kumbki vastavad ühe komplementaarse DNA ahela alguse nukleotiidsele järjestusele ja talitlevad kui ensüümi substraat, kuna neil on vabad otsad uute nukleotiidide sidumiseks. PCR pôhietapid on järgmised: 1) topeltahelalise DNA denaturatsioon kaheks üksikahelaks kôrge temperatuuriga (90-95 °C; 40-60 sek); 2) praimerite hübridiseerimine e. "istutatamine" kummalegi üksikahelale, milleks temperatuur viiakse alla ca 50 °C juurde 30 sekundiks;
PCR viiakse läbi biokeemilise reaktsioonina ja selle puhul ei vajata elusorganisme DNA kopeerimiseks. Reaktsioon pôhineb ensüümi- DNA-polümeraas kasutamisel, mis katalüüsib DNA komplementaarse ahela sünteesi. PCR on DNA-molekuli paljundamine kunstlikes tingimustes. Reaktsiooni läbiviimiseks on vajalik teada uuritava DNA lõigu otste nukleotiidset järjestust. Reaktsiooni käivitamiseks kasutatakse kahte oligonukleotiidset (väiksest arvust nukleotiididest koosnevat (8..30) praimerit (ingl. k. primer), mis kumbki vastavad ühe komplementaarse DNA ahela alguse nukleotiidsele järjestusele ja talitlevad kui ensüümi substraat, kuna neil on vabad otsad uute nukleotiidide sidumiseks. PCR pôhietapid on järgmised: 1) topeltahelalise DNA denaturatsioon kaheks üksikahelaks kôrge temperatuuriga (90-95 °C; 40-60 sek); 2) praimerite hübridiseerimine e. "istutatamine" kummalegi üksikahelale, milleks
21. Töö käik: 1. Pipeteerisin kokku PCRi reaktsioonisegu (20μl): 11,3 μl vett 2 μl 10x polümeraasi puhvrit – tagab vajalikud reaktsioonitingimused, nagu pH, soolade kontsentratsioon jt μl 25 mM MgCl2 (lõppkonts. 2,5 mM) – Mg2+ ioonid on vajalikud polümeraasi töötamiseks 2,4 μl 2 mM dNTP (lõppkonts. 240 μM) – sisaldab 4 liiki nukleotiide 1 μl 10 μM Reverse ja 1 μl 10 μM Forward praimerit (lõppkonts. 0,5 μM) – komplimentaarsed vastassuunaliste ahelate otsadele 0,2 μl 25 ng/μl template-DNAd (lõppkonts. 0,25 ng/μl) – sisaldab DNA osa, mida on vaja paljundama 0,1 μl 5 U/μl HotFIRE Pol Polümeraasi (lõppkonts. 0,5 U/μl) – katalüüsib PCRi, peab säilitama oma aktiivsust kõrgel temperatuuril. Taq polümeraasid ei oma proof-
Replikatsioon algab korraga mõlemas suunas ning kestab kuni valmib terve uus kromosoom Initatsioonvalgud- tunnevad origin-punkti Topoisomeraas-avab konformatsiooni Helikaas- lahutab kaksikahela (lõhub H sidemed) ja mood. Replikatsioonikahvli Single Strand Binding Protein (SSB valgud)- kaitsevad avatud ahelat Primaasid- algatavad sünteesi DNA polümeraas III- vastavalt komplementaarusele sünteesib matriitsahelat 5´3´ RNA polümeraas- sünteesib mahajäävale ahelale praimeri. Praimerit pikedab DNA polümeraas III- tekivad Okazaki fragmendid. DNA polümeraas I- lagundab RNA praimeri ja asendab DNA-ga DNA- polümeraas- viib läbi replikatsiooni Ligaas- ühendab Okazaki fragmendid Replikatsioon algab mitmes kohas, raku paljunemistsükli S-faasis suunas 3´--5` DNA- ahelad on antiparalleelsed, replikatsioon saab olla pidev ainult ühelt ahelalt(leading strand). Teiselt ahelalt Okazaki gragmentide kaupa. Vigade parandamiseks on DNApolümeraasil
Matriitssüntees – geneetilise info edasikandmine. Molekulaar-bioloogi klassikaline põhidogma väidab: ● DNA – DNA ehk DNA taastoodab ennast (replikatsioon) ● DNA – RNA ehk DNAst sünteesitakse RNA (transkriptsioon) ● RNA – valk ehk RNAst sünteesitakse valk (translatsioon) Viirustes on võimalik ka info kandumine RNAlt DNAle pöördtranskriptsioon ning RNAlt RNAle – RNA replikatsioon Info on struktuursetes ühikutes ehk geenides. On vaja alguspunkti, praimerit või promootorit – oleneb kas DNA või RNA 8. Kirjelda DNA ja RNA koostisosasid ja nende vahelisi keemilisi sidemeid, lämmastikalused, nukleosiidid, nukleotiidid DNA ja RNA on nukleotiidide polümeerid. DNA sisaldab valkude sünteesiks vajalikku informatsiooni, mis on geenides. RNA on vajalik valkude tootmiseks. DNA: lämmastikalused - A adeniin, G guaniin, C tsütosiin, T tümiin, suhkrujääk desoksüriboos, fosforhappejääk
Sünteesi viivad läbi polümeraasid. Matriitsina toimib üksikahelaline nukleiinhape. Seega peab kaksikahelaline DNA replikatsiooni initsiatsioonisaidist olema eelnevalt viidud üksikahelaliseks. DNA ahelate eraldumist teineteisest katalüüsib DNA helikaas. Nukleiinhapete sünteesi läbiviivad polümeraasid: 1. DNA polümeraas ensüüm, mis sünteesib DNA ahelale komplementaarse DNA ahela. Toimub DNA replikatsioon. Vajab sünteesil praimerit, mis on paardunud matriitsahelaga. Praimeriks on lühike oligonukleotiid (DNA või RNA ahel) 2. RNA polümeraas ensüüm, mis sünteesib DNA ahelale komplementaarse RNA ahela. Toimub transkriptsioon. Transkriptsiooni initsiatsiooniks seondub RNA polümeraas spetsiifiliselt promootorjärjestusega ning seejärel katkevad promootrorpiirkonnas DNA ahelate vahelised vesiniksidemed. Ei vaja initsiatsiooniks praimerit. 3. Pöördtranskriptaas e
Sünteesi viivad läbi polümeraasid. Matriitsina toimib üksikahelaline nukleiinhape. Seega peab kaksikahelaline DNA replikatsiooni initsiatsioonisaidist olema eelnevalt viidud üksikahelaliseks. DNA ahelate eraldumist teineteisest katalüüsib DNA helikaas. Nukleiinhapete sünteesi läbiviivad polümeraasid: 1. DNA polümeraas ensüüm, mis sünteesib DNA ahelale komplementaarse DNA ahela. Toimub DNA replikatsioon. Vajab sünteesil praimerit, mis on paardunud matriitsahelaga. Praimeriks on lühike oligonukleotiid (DNA või RNA ahel) 2. RNA polümeraas ensüüm, mis sünteesib DNA ahelale komplementaarse RNA ahela. Toimub transkriptsioon. Transkriptsiooni initsiatsiooniks seondub RNA polümeraas spetsiifiliselt promootorjärjestusega ning seejärel katkevad promootrorpiirkonnas DNA ahelate vahelised vesiniksidemed. Ei vaja initsiatsiooniks praimerit. 3. Pöördtranskriptaas e
Neil on trüptofanaasne aktiivsus, saab kindlaks teha LB söötmel tehes indooltesti. Moodustab Endo söötmel tumepunaseid kuivi kolooniaid. 14. Nimeta vähemalt 3 substraati, milledel kasvades annab E. coli positiivse vastuse? Laktoos, β-D-glükuroniidid, briljantroheline, sapisoolad. 15. Kuidas käituda siis, kui E. coli tuvastamisel indooltest annab positiivse vastuse, kuid GUR aktiivsus puudub? gusA geen on defektne. 16. Miks peab PCR-il kasutama kahte praimerit? DNA-l on kaks ahelat. 17. Miks peab PCR-il kasutama termostabiilset DNA polümeraasi? DNA denatureeritakse 94-98 kraadi juures. Tavaline polümeraas denatureerub. 18. Miks valmistatakse elektroforeesi puhul geel puhvris, mitte tavalises vees? pH stabiilsuse tagamiseks, PCR toimub ainult kindlal pH-l. 19. Kuidas eristada DNA-fragmente geelelektroforeesil? Molekulid tuleb geelis nähtavaks tuua. Agaroosi kasutatakse maatriksina. 20
kiiresti ja ei kasutanud pahupidi tehnikat. Ülejäänud harjutamisülesanned ei tekitanud mul suure reskusi, vaid ainult täpsuspipeteerimise käigus käsi hakkas värisema, aga pärast õiget asendi leidmist, edasi pipeteerimisega probleeme polnud. 2.1.1. Praktikum – PCRi teostamine Polümeraas ahel reaktsioon kasutatakse teatud DNA fragmenti paljundamiseks. Selleks, et PCRi alustada, enne on vaja disainida 2 praimerit (pärissuunalist ja vastassuunalist), mis on komplementaarsed selle fragmenti 5’-otsatega (ja ei ole kompementaarne fragmendi teise järjestusega ega omavahel ei moodusta dimeere), kuna polümeraas ei ole võimeline esimesi nukleotiide ise sunteesida. PCRi teostamiseks on vaja ette valmistada 20 µl segu, milleks on vaja pipeteerida
vastassuunas · poolkatkendlik juhtivahel kopeerub katkematult, mahajääv ahel kopeerub segmentide kaupa (Okazaki fragmendid), mis seejärel omavahel ühendatakse DNA sünteesitakse suunal 5'-3'. DNA replikatsiooniks on vaja: · sablooni ehk template · desoksünukleosiidtrifosfaate, millest DNA sünteesitakse ja millest saadakse sünteesiks vajalik energia · praimerit DNA polümeraas on võimeline sünteesi alustama ainult siis, kui umbes 10-nukleotiidiline fragment uuesti ahelast on juba olemas · sünteesiensüümi ehk DNA polümeraasi DNA polümeraasid Osad polümeraasid sünteesivad uut ahelat, osad parandavad vigu. Replikatsiooni peamised iseärasused eukarüootsetes rakkudes Palju kromosoome, mille kiireks kopeerimiseks on vajalik efektne replikatsioonisüsteem, seega on mitu
*dispersiivne-mõlemad tütarahelad sisaldavad segu vanadest ja uuesti sünteesitud lõikudest *semikonservatiivne-14 N ->kege DNA ahel ja 15N->raske DNA ahel,ühelt ahelalt toimub replikatsioon pidevalt, teiselt aga katkendlikult fragmentidena.Leidis kinnitust. 50)DNA replikatsiooni initsiatsiooni mehhanism. -limiteeritud spetsiifiliste initsiatsiooni regioonide-ori regioonide olemasoluga. -on vajalik DNA ahelate lokaalne lahtikeerdumine ning praimeri süntees. -praimerit on vaja selleks et sünteesitaval polünukleotiidahelal oleks vaba 3'OH ots kuhu DNS polümeraas saab liita nukleotiide.Praimeriks võib olla kas DNA või RNA.Praimeri sünteesib kas RNA polümeraas või primaas, DNA dupleksi avamine võib toimuda kas transkriptsiooni toimel või spetsiifiliste initsiaatorvalkude seondumise tulemusena.Kuna DNA dupleksi avamine on kergem A-T rikastes regioonides on ori regioonid alati A-T rikkad. 51)Erinevate DNA polümeraaside funktsioonid bakterites
PCR viiakse läbi biokeemilise reaktsioonina ja selle puhul ei vajata elusorganisme DNA kopeerimiseks. Reaktsioon pôhineb ensüümi- DNA-polümeraas kasutamisel, mis katalüüsib DNA komplementaarse ahela sünteesi. PCR on DNA-molekuli paljundamine kunstlikes tingimustes. Reaktsiooni läbiviimiseks on vajalik teada uuritava DNA lõigu otste nukleotiidset järjestust. Reaktsiooni käivitamiseks kasutatakse kahte oligonukleotiidset (väiksest arvust nukleotiididest koosnevat (8..30) praimerit (ingl. k. primer), mis kumbki vastavad ühe komplementaarse DNA ahela alguse nukleotiidsele järjestusele ja talitlevad kui ensüümi substraat, kuna neil on vabad otsad uute nukleotiidide sidumiseks. PCR pôhietapid on järgmised: 1) topeltahelalise DNA denaturatsioon kaheks üksikahelaks kôrge temperatuuriga (90-95 °C; 40- 60 sek); 2) praimerite hübridiseerimine e. "istutatamine" kummalegi üksikahelale, milleks temperatuur
25.Geen ja genoom. DNA järjestuse lõik, funktsionaalne ühik, mis kodeerib valku või struktuurset, katalüütilist või regulatoorset RNAd (regulatoorsed järjestused ja kodeeriv ala; kodeeriv ala eukarüootidel koosneb eksonitest ja nitronitest). Genoom on antud liigi täielik geenikogum. 26.Transkriptsioon. Ehk RNA süntees. Toimub 5´-3´suunal. Viib läbi RNA polümeraas (prokariootidel abifaktor σ). Ei vaja praimerit. Süntees algab promootorilt (kindel DNA signaaljärjestus, seostuvad regulaatorvalgud). Lõppeb terminaatorini jõudmisel (DNa järjestus, kus RNA polümeraas vabastab sünteesitud RNA). Initsiatsioon (sünteesi algus), elongatsioon (vahepealne osa), terminatsioon (lõpp). Sünteesi käigus tekib 1 viga 10000 nukleotiidi kohta. 27.mRNA struktuur prokarüootidel ja eukarüootidel. Avatud lugemisraam ehk ORF (open reading farme), valku kodeeriv osa
kopeerimiseks. Reaktsioon pôhineb ensüümi- DNA-polümeraas kasutamisel, mis katalüüsib DNA komplementaarse ahela sünteesi. PCR on DNA-molekuli paljundamine kunstlikes tingimustes. Reaktsiooni läbiviimiseks on vajalik teada uuritava DNA lôigu otste nukleotiidset järjestust. Reaktsiooni käivitamiseks kasutatakse kahte oligonukleotiidset (väiksest arvust nukleotiididest koosnevat- 8..30) praimerit (ingl. k. primer), mis kumbki vastavad ühe komplementaarse DNA ahela alguse nukleotiidsele järjestusele ja talitlevad kui ensüümi substraat, kuna neil on vabad otsad uute nukleotiidide sidumiseks. PCR pôhietapid on järgmised: 1) topeltahelalise DNA denaturatsioon kaheks üksikahelaks kôrge temperatuuriga (90-95 °C; 40-60 sek); 2) praimerite hübridiseerimine e. "istutatamine" kummalegi üksikahelale, milleks temperatuur viiakse alla ca 50 °C juurde 30 sekundiks;
alati lineaarne). Tal on endal eksonukleaalne võime. Võib ise toimida kui ensüüm. Vahe selles, et kui lahtikeerudunud matriitsile moodustub komplementaarne RNA molekul, mis saavutades teatud pikkuse (kindlaks määratud) irdub ise DNA pealt lahti. Kuidas RNA sünteesitakse? Sünteesi reguleerib iga geeni regulatoorne element. DNA keerdub geeni kohalt lahti. RNA transkribeeritakse 5' 3' suunas matriitsilt (3' 5'). Sarnane DNA sünteesiga va: NTP, mitte dNTPs ( deoksü), Ei ole vaja praimerit, Ei ole korrektuuri (proofreading), Uratsiil, mitte tümiin, RNA polümeraas. Transkriptsiooni kolm staadiumi: 1. Initsiatsioon 2. Elongatsioon 3. Terminatsioon Ühesugune pro- ja eukarüootidel. Elongatsioon on konserveerunud kogu elusas looduses. Initsiatsioon ja terminatsioon on erinevad pro-ja eukarüootidel. 1-Initsiatsioon RNA polümeraas ühineb sigma faktoriga (valk), mille järel moodustub RNA polümeraasi holoensüüm
vahendab HBsAg, sisenemismehhanism on teadmata. HBsAg seostub ka seerumi albumiinile ja teistele valkudele, mis võivad sisenemist hõlbustada. Rakku tungimisel muudetakse DNA kogu ulatuses kaheahelaliseks ringiks, viiakse tuuma. Transkriptsiooni kontrollivad hepatotsüütide transkriptsioonielemendid. DNA transkribeeritakse kahte major ja kahte minor klassi kattuvate mRNAdega. Suurim, 3500 bp, mRNA on suurem kui genoom, ta kodeerib HBc ja HBe antigeene, polümeraasi, proteiinset praimerit DNA replikatsiooniks, toimib genoomi replitseerimisel template’ina. Minor klassid kodeerivad x-proteiini, mis promob viiruse replikatsiooni transaktivaatorina ja proteiini kinaasina. Genoomi replikatsioon algab 3500 bp mRNA tootmisega, see pakitakse nukleokapsiidi, milles sisaldub RNA-sõltuv DNA polümeraas, millel on RT ja ribonukleaasi aktiivsus, aga puudub retroviiruste ensüümi integraasiaktiivsus. –DNA sünteesitakse, kasutades
Kaheahelalise DNA restriktaaside äratundmissaitidel on 2-kordne sümmeetriatelg. Sõna EcoRI tuleb E. coli (soolekepike) R liinis avastatud esimene restriktaas. c) DNA polümeraas ensüümid, mis viivad läbi DNA replikatsiooni. Polümeraas saab lisada vabu nukleotiide ainult sünteesitava ahela 3' otsa ja seepärast toimub pikendamine 5'-3' suunas. Uue ahela sünteesiks on vaja vaba 3'-OH rühmaga praimerit. 16. Mingi organismi genoom suurusega 30 000 kb (1kb = 1000 bp) sisaldab 19% T jääke. Arvutage A, C, G ja T jääkide arv selle organismi rakkude DNAs. Antud, teada: T=A = 19% C=G Genoom = 30 000kb = 3 107 bp See ülesanne on harjutustundide materjalides ;) /RL aga Lahendus: G=C = (100-2x19) / 2 = 31% 100 tuleb sellest et tervik on 100%, 19 korrutan 2'ga kuna nii T kui ka
puhvrid ja soolad. Ready-To-GoTM PCR Beads on kommertsiaalne kit (Amersham Pharmacia Biotech), mille puhul on tegemist 0,2 ml PCR katsutitega, mis sisaldavad lõppreaktsiooni mahu tingimustes (25 µl) alljärgnevaid komponente: • ~1,5 U Taq-DNA polümeraasi; • 10 mM Tris-HCL (pH 9,0); • 50 mM KCL; • 1,5 mM MgCl2; • 200 µM igat dNTP; Töö käik. 1. Lisa katsutisse, mis sisaldab PCR kuulikest, reagendid alljärgnevas järjestuses: 1.1. 2 µl praimerit ERIC1 R (5’-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3’); 1.2. 2 µl praimerit ERIC1 F (5’-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3’); 1.3. 10 µl kuumutatud bakterite suspensiooni; 1.4. Lisa steriilset destilleeritud vett kuni lõppmahuni 25 µl. 2. Sulge katsutid korgiga ja märgista 3. Sega katsutite sisu vortexil tagamaks PCR kuulikeste sulamist. Vajadusel võib kasutada steriilset pipetti. PCR kuulike peab olema täielikult sulanud! 4. PCR reaktsiooni teostamine termotsükleris
Mahajääva e viivisahela süntees toimub 200bp lõikudena (okazaki fragmendid) Repl. Algab replikatsiooni alguspunktidest (eukarüootides mitu, pro’des üksainus) 1) Helikaas liigub piki liiderahelat ja keerab II ahela katki 2) Primaas sünteesib praimeri 3) DNA polümeraas kinnitub praimerile ja lisab nukleotiide ainult ahela 3’ otsa, nad ei suuda alustada uue ahela sünteesi vabadest nukleotiididest → vajab praimerit (vaba 3’ otsaga nukleotiidide ahelat) 4) Primaas sünteesib praimeri ahela 3’ otsale 15. Miks toimub mahajääval ahelal DNA süntees katkendlikult? Sest replikatsiooni kahvel liigub 5’ →3’ suunas, polümeraas ei oska vastupidises suunas nukleotiidahelat sünteesida. Polümeraasil on vaja vaba 3’ hüdroksüülrühma, mille külge haakuda 1) Viivisahelal on ahela ühes otsas RNA praimer ja teises otsas sünteesib DNA primaas uue RNA praimeri.
32 – valk, mis suunab suure enamuse bakteri geenide avaldumist. Polümeraasis toimub struktuurne muutus töö käigus. Ühest faasist teise üleminekul on see väga oluline, Bakteri RNA polümeraas koosneb mitmest polüpeptiidist (α, 2β ja γ). Algul on avatud, hiljem suletud. RNA polümeraasi kiirus: 40-80 nukleotiidi sekundis, DNA polümeraasi kiirus: 1000 nukleotiidi sekundis RNA polümeraas teeb 1 vea 10000 kohta, DNA polümeraas 1 vea miljoni kohta RNA polümeraas ei vaja praimerit, DNA polümeraas vajab praimerit Krabi sõra struktuur – RNA polümeraas koosneb mitmetest subühikutest. Struktuur on seotud ensüümi protsessiivsuse tagamisega – arv monomeere, mis lisatakse ühe initsiatsioonisündmuse kohta. Aktiivtsenter asub sõrgade vahel. Seal toimub uue fosfodiestersideme süntees (ühelt DNA ahelalt). RNA ahelale lisatakse nukleotiide juurde. Järjestuse alusel valitakse välja komplementaarsed nukleosiidid,
Reaktsioon pôhineb ensüümi DNA-polümeraas kasutamisel, mis katalüüsib DNA komplementaarse ahela sünteesi. PCR on DNA-molekuli paljundamine kunstlikes tingimustes. Reaktsiooni läbiviimiseks on eelnevalt vajalik teada uuritava DNA lôigu otste nukleotiidset järjestust, mille alusel disainida praimerid, mis on tavaliselt kuni 30 oligonukleotiidi pikkused. PCRi käivitamiseks kasutatakse kahte oligonukleotiidset väiksest arvust (kuni 30) nukleotiidist koosnevat praimerit (ingl. k. primer), mis kumbki vastavad ühe komplemen- taarse DNA ahela alguse nukleotiidsele järjestusele ja talitlevad kui ensüümi substraat, kuna neil on vabad otsad uute nukleotiidide sidumiseks. PCR pôhietapid on järgmised (vt ka joonis): 1) topeltahelalise DNA denaturatsioon kaheks üksikahelaks kôrge temperatuuriga (90-95 °C; 40-60 sek); 2) praimerite seostamine (hübridiseerimine, anniilimine) DNA-le toimub tavaliselt temperatuuril 50-70°C (ca 30 sek);
annaabi.ee 
