Polümeraasi ahelreaktsioon (0)

Polümeraasi ahelreaktsioon
PCR viiakse läbi biokeemilise reaktsioonina ja selle puhul ei vajata elusorganisme DNA kopeerimiseks. Reaktsioon pôhineb ensüümi- DNA-polümeraas kasutamisel, mis katalüüsib DNA komplementaarse ahela sünteesi. PCR on DNA-molekuli paljundamine kunstlikes tingimustes.
Reaktsiooni läbiviimiseks on vajalik teada uuritava DNA lôigu otste nukleotiidset järjestust.
Reaktsiooni käivitamiseks kasutatakse kahte oligonukleotiidset (väiksest arvust nukleotiididest koosnevat- 8..30) praimerit (ingl. k. primer), mis kumbki vastavad ühe komplementaarse DNA ahela alguse nukleotiidsele järjestusele ja talitlevad kui ensüümi substraat , kuna neil on vabad otsad uute nukleotiidide sidumiseks.
PCR pôhietapid on järgmised:

topeltahelalise DNA denaturatsioon kaheks üksikahelaks kôrge temperatuuriga (90-95 °C; 40-60 sek);

praimerite hübridiseerimine e. "istutatamine" kummalegi üksikahelale, milleks temperatuur viiakse alla ca 50 °C juurde 30 sekundiks;

komplementaarse DNA ahela süntees DNA-polümeraasi toimel (72 °C juures aeg sôltub lôigu pikkusest, kuid ca 1-3 min). Ensüüm on termostabiilne ja on isoleeritud kuumavee allikates elavatest bakteritest (näit. Thermus aquaticus ja temalt saadud ensüümi nimetatakse TaqI).
Reaktsioonis kasutatavad komponendid (maatriks DNA, praimerid, ensüüm ja vabad nukkleotiidid- viiakse kohe algselt ühte katsutisse. Kuna ahelreaktsiooni etapid toimuvad erineva temperatuuri juures, siis on kogu protsess juhitav temperatuuri abil ja vastavaid tsükleid vôib korrata kümneid kordi . Igas tsüklis DNA hulk teoreetiliselt kahekordistub. Praktiliselt hilisemates tsüklites on reaktsiooni efektiivsus väiksem, kuna ensüümi aktiivsus langeb, samuti lôpevad otsa vabad nukleotiidid . Neid juurde pole aga vôimalik lisada. Saadud koopiate arv ulatub aga 30 tsükli järel juba miljonitesse, mis on rohkem kui küll olenematra, mis eesmärgil reaktsioon läbi viidi.
PCR produkt eraldatakse lahusest elektroforeesiga agargeelis.
PCR-i saab kasutada ka diagnostilisel eesmärgil: teatud DNA vôi RNA järjestuse (viiruste vôi bakterite) avastamiseks uuritavas materjalis vôi näiteks geenidefektide avastamiseks genoomis. Tema tundlikkus on teoreetiliselt selline, et kui uuritavas materjalis on üks DNA- molekul , mille järjestus ühtub materjalile lisatava praimeriga, siis me selle ka avastame. PCR- on kôrvaletôrjumas DNA sondide meetodit geneetiliste haiguste uurimisel , viirusinfektsioonide tuvastamisel ja mikroobide tüpiseerimisel.