DNA replikatsioon (0)

DNA  replikatsioon
1.
Alternatiivsed mudelid
2.
Poolkonservatiivne:  Meselson­Stahli katsed
3.
DNA süntees ja  elongatsioon
4.
DNA polümeraasid
5.
Replikatsiooni algus ja  initsiatsioon
6.
Prokarüootne/eukarüootne mudel (tsirkulaarne/lineaarne  kromosoom )
7.
Telomeeride replikatsioon
 
 
Replikatsiooni alternatiivsed mudelid
 
 
Ultratsentrifuugimine gradiendis
 
 
1958:  Matthew  Meselson ja Frank Stahli katse, milles näidati, et
repliktsioon on poolkonservatiivne
 
 
1955:  Arthur  Kornberg
Töötas E. coli’ga. 
Avastas DNA sünteesi mehhanismi in  vitro
Vajalik neli komponenti:
1.
dNTPs: dATP, dTTP, dGTP, dCTP
(deoxyribonukleosiid 5’­trifosfosfaadid)
(suhkur­alus + 3 fosfaati)
2.
DNA  matriits
3.
DNA polümeraas I (Kornbergi ensüüm)
(DNA polymeraas II ja III avastati veidi hiljem)
4.
Mg 2+ (optimeerib polümeraasi aktiivsuse)
1959 : Arthur Kornberg (Stanford  University ) ja Severo Ochoa (NYU)
 
 
DNA süntees:
1.
DNA polümeraas  I katalüüsib fosfodiester sideme moodustumist 
deoksüriboosi 3’­OH (viimasel nukleotiidil) ja dNTP 5’­ fosfaadi  vahel
•
Energia saadakse kahe fosfaatrühma vabanemisel
2.
DNA polümeraas I “leiab ülesse” õige komplementaarse dNTP kogu 
elongatsiooni vältel
•
kiirus ≤ 800 dNTP/sekundis
•
Madal vale paardumiste määr
3.
Sünteesi suund alati 5’         3’
 
 
DNA elongatsioon:
 
 
DNA elongatsioon:
 
 
Polümeraasid
Polümeraas Polümerisatsioon (5’­3’) Eksonuklaas (3’­5’)
Eksonukleaas (5’­3’)
Koopiad
I
ja
ja
ja
400
II
ja
ja
ei
?
III
ja
ja
ei
10­20
•Polümeraas I ja III replikatsioon 5’        3’
•Polümeraas II roll ei ole päris selge
•3’   5’ eksonukleaas = võime  nukleotiide  eemaldada 3’ otsast
•Oluline korrektuuri lugemises ( proofreading) 
•Ilma selleta vigade määr ( mutatsioonid ) 1 x 10­6
•Koos korrektuuriga 1 x 10­9 (1000­kordne efekt) 
•5’  3’ eksonukleaasne aktiivsus replikatsiooni repareerimises 
 
 
Replikatsiooni algus (prokarüoodil):

Algab kaksikahela denaturatsioonist, nii saab alguse lämmastikalauste 
ekspositsioon

Replikatsioon kahes suunas  
~245 bp  E. coli
 
 
Initsiatsioon:

Üheahelalisi DNA lõike nimetatakse matriitsideks

Güraas on ensüüm ( topoisomeraas ), mis vabastab superspiralisatsiooni

Initseeriv valk ja DNA  helikaas  seonduvad DNAga replikatsiooni kahvlis ja 
toimub lahtikeerdumine. Energia tuleb ATPst. ATP hüdrolüüs põhjustab 
konformatsioonilisi muutusi helikaasis

DNA primaas seob järgnevalt helikaasi, nii et moodustub primosoom

Primaas sünteesib väikese, 10­12 RNA, millele DNA polümeraas hakkab 
sünteesima juurde nukleotiide

Polümeraas III lisab nukleotiide 5’    3’ suunas mõlemal  ahelal , alustades 
RNA praimerist

RNA  praimer  hiljem eemaldatakse ja asendatakse DNA polümeraasiga. 
Vahemik siilitakse ligaasi poolt.

Üheahelaine DNA stabiliseeritakse kogu protsessi vältel spetsiaalse valguga
 
 
Replikatsiooni mudel E. coli 
 
 
Replikatsioon on juhtahelal pidev, vastasahelal katkendlik
Replikatsiooni kahvlis despiraliseerumine ühesuunaline
Ahelad  on vastaspolaarsed, DNA polümeraas töötab aga vaid 5’  3’ suunas
See probleem on lahendatud eri  ahelatel  erinevalt.
 Juhtahel       toimub 5’ 3’ suunas nii nagu liigub repl.
                                 kahvel, on pidev nõuab üht RNA praimerit
Alanev ahel  sünteesib vastaspoolele, on fragmentidena
                                 süntees ja iga fragmendi jaoks oma praimer
 
 
Superspiraliseerunud DNA despiraliseeritakse güraasi ja helikaasiga:
5’
SSB valk
Okazaki  Fragment  ATP
1
Polümeraas III
2
Helikaas 
3
+
Alanev ahel
Initsiaator valk
3’
aluspaarid
primaas
PolümeraasIII
5’
RNA primer asendatakse polümeraas I
Ja vahe siilitakse ligaasiga 
5’ → 3’
Juhtahel
RNA Praimer
3’
 
 
DNA  ligaas  ühendab Okazaki fragmendid fosfodiester sidemega
 
 
E.coli kromosoomis DNA replikatsioon
 
 
Peter J.  Russell , iGenetics:  Copyright  © Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.
JÄTK:
 
 
Peter J. Russell, iGenetics: Copyright © Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.
Tsirkulaarse kromosoomi replikatsioon 
E. coli :
1.
Kaks repl. Kahvlit moodustavad 
teeta sarnase struktuur (θ) 
2.
Moodustuvad positiivsed 
superspiraalid
3.
Topoisomeraasid vabastavad 
superspiraalid, nii et DNA saab 
edasi lahkneda
 
 
Süntees  viirustel
1.
Katkemine, moodustub 5’ ots kui 
praimer
2.
Võib  alata  ükskõik kuskohast 
genoomis, võimaldab palju 
sünteese kiiresti
3.
Viiruse kokkupanekul lõigatakse 
individuaalsed  kromosoomid  ja 
pakitakse
 
 
DNA replikatsioon eukarüootidel
Kopeeritakse rakutsükli S faasis
Põhilised kontrollpunktid:
1.
Raku oma suurus ja sobiv keskkond.
2.
Rakk ei lähe mitoosi enne kui kogu genoom replitseerunud
3.
Kromosoomid peavad olema seotud käävi tuubulitega
4.
Proliferatsioni kontroll tsükliinide ja tsükliin­sõltuvate kinaasidega (Cdks)
 
 
Ensüümid:
Imetajate rakkudes 5 DNA polümeraasi
•
Polümeraas α : tuumas, DNA replikatsioon, ei korrigeeri
•
Polümeraas β :  tuumas, DNA  reparatsioon , ei korrigeeri
•
Polümeraas γ : mitokondrid, DNA repl., korrigeerib
•
Polümeraas δ : tuumas, DNA repl., korrigeerib
•
Polümeraas ε : tuumas, DNA reparatsioon, korrektuur
1.
Erinevad polümeraasid tuumas ja mitokondrites
2.
Mõned korrigeerivad, osa vaid reparatsiooniks
 
 

Iga eukarüootne kromosoom sisaldab ühte kaheahelalist DNA molekuli

Keskmselt ~108  aluspaari

Replikatsiooni kiirus korral 2 kb/ minutis  nõuaks inimesekromosoomi 
replikatsiooniks ~35 päeva. See oleks väga pikk

Seepärast initseeeritakse replikatsioon paljudes saitides üheaegselt
Kiirus rakuspetsiifiline!
 
 
Lineaarsete kromosoomide otsad ( telomeerid )
DNA polümeraas/ligaas ei tööta kromosoomide otstes, kui RNA  eemaldatud . 
Seepärast iga paljunemistsükli järel kromosoom lühem
1.
Telomeerid on tandem kordused
2.
Telomeraas, mis on komplementaarne kordusega (RNA valk kompleks) seob 
terminaalsed järjestused ja katalüüsib uued järjestused otsa
3.
Kui seda ei toimu, siis kromosoomid lühenevad ja sellega piiratakse 
rakkude jagunemist. Üks vorm apoptoosiks
 
 
Telomeeri süntees
 
 
Peter J. Russell, iGenetics: Copyright © Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.

Document Outline

• Slide 1
• Slide 2
• Slide 3
• Slide 4
• Slide 5
• Slide 6
• Slide 7
• Slide 8
• Slide 9
• Slide 10
• Slide 11
• Slide 12
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• Slide 18
• Slide 19
• Slide 20
• Slide 21
• Slide 22
• Slide 23
• Slide 24