enda poolt toodetud restriktaaside eest. Sellega võib manipuleerida: välja lülitada kloonimisel, et oleks võimalik DNA lõikamist restriktaasiga selleks, et sinna ehitada huvipakkuva DNA järjestust. 3. Võrdle omavahel järgnevate E.Coli ensüümide omadusi. DNA polümeraas I Klenow fragment Sequenase Taq polümeraas 5' 3' DNA-sõltuv polümeraasne aktiivsus DNA polümeraasi ,,mutantne" vorm. 5' (on vaja praimeri) 3' polümeraasne aktiivsus. 3' 5' eksonukleaasne aktiivsus (DNA parandamine) DNA sünteesil 5' 3' Tömbi otste Kasutatakse Kasutatakse eksonukleaasne saamiseks. peamiselt peamiselt PCR- aktiivsus 5' 3' sekveneerimisel. 3' reaktsioonides. 3'
Replikatsioonikahvli liikumine DNA süntees alati 5’-˃ 3’ suunaline. See tähendab, et: ühte, see on liiderahelat, saab pikendada jätkuvalt teist, see on viivisahelat saab pikendada RNA primerite ja spetsiaalse ensüümi, praimaasi, abil Sünteesi tagajärjel tekivad viivisahelal lühikesed DNA fragmendid, mida nimetatakse Okazaki fragmentideks. Viivisahela sünteesimine DNA praimaas sünteesib DNA järjestuse pealt lühikese RNA praimeri DNA polümeraas jätkab DNA sünteesi - moodustub Okazaki fragment eesolev RNA praimer asendatakse DNA-ga Okazaki fragmentide katkekohad liidetakse DNA ligaasi abil Okazaki fragmentide sünteesiks on vajalik ensüüm- DNA praimaas, mis sünteesib nn. praimeri - lühikese RNA oligonukleotiidi. Praimaasi töö tulemusena moodustub DNA-RNA hübriidahel, kus uuesti sünteesitud RNA aluspaarid on seotud DNA aluspaaridega vesiniksideme kaudu.
d) cDNA klonoteegi (raamatukogu) valmistamiseks - sünteesitakse mRNA pealt DNA ja sisestatakse vektorisse 16. Mutatsioonanalüüsil allele-spetsiifilise hübridisatsiooni abil asub alleeli eristav nukleotiid alleel- spetsiifilise oligonukleotiid proovi a) Keskel b) 3' otsas c) Ühe koodoni kaugusel 3' otsast d) 5' otsas 17. Kui soovite sisestada DNA-sse teatud mutatsiooni PCR-i reaktsiooni käigus, siis millises PCR-i praimeri otsas võite antud muudatuse teha: a) Praimeri 5' otsas b) Praimeri 3' otsas 18. Milline järgnevatest komponentidest ei ole vajalik DNA sekveneerimiseks ensümaatilisel (Sanger'i) meetodil? a) Dideoksüterminaatorid b) Praimer c) DNA polümeraas d) Kõik siintoodud komponendid on vajalikud e) ATP, CTP, GTP ja TTP 19. Kuriteopaigalt avastatakse verine nuga, mille külge on kleepunud paar juuksekarva. Millist meetodit
Soodustavad teiste valkude DNA pol ligipääsemist. HDAK- deatsetülaasid. Lõikavad atsetüülrühmas lüsiini jääkide küljest ära ja pärsivad aktiivust, fosfolüreelivad histooni. Promootor- TATA elementi sis geeni ala. Koht kuhu seondub RNA polümeraas. Ülavoolu asuv ala. DNA replikatsioon-Helikaas eraldab DNA ahelad. PolIII abil kodeeritakse probleemideta juhtiv ahel 5'-3'. Mahajäävat ahelat kodeeritakse fragmentide kaupa. Kõigepealt asetab RNA primaas RNA praimeri ning DNA pol III jätkab järjestuse kodeerimist nii mitu korda seejärel DNA Pol I asendab praimerid ja DNA ligaas ühendab fragmendid. Transkriptsioon- RNA tegemine DNAlt. Selles osalevad DNA, Tfid, RNA polümeraas ja ATP. Transkriptsiooniks on vaja DNA lõiku, mis koosneb osadest ( transkriptsiooni ühik ehk ala mida transkribeeritakse, sellest ülavoolu asub TATAbox ja enhanser). Edukaks transkriptsiooniks on vaja mõndasid TF´eid
10. Millistel juhtudel on vajalik kasutada molekulaarseid meetodeid?- kui mikroskoopia võib anda valepositiivseid tulemusi- gonorröa; viiruste; aeglane bakterite kasv-mükobakterid; seroloogia võib anda valeposit.tulemusi-klamüüdia; subtüpeerimine, klassikalise meetodi mdal tundlikkus 11. Mida tähendab lühend PCR?- polymerase chain reaction e. polümeraas ahelreaktsioon 12. Nimeta PCR etapid, mitu korda harilikult neid korratakse?- DNA denaturatsioon; praimeri seostumine-annealing; DNA süntees->20-30 korda 13. Kuidas nimetatakse PCR analüüsil temperatuuriga DNA vesiniksidemete lõhkumist?- Denaturatsioon 14. Kuidas nimetatakse PCR analüüsil praimerite seondumise etappi?- annealing 15. Millist kliinilist materjali saab kasutada PCR meetodil haigustekitaja tuvastamiseks?- röga, lima, seemnevedelik (DNA) 16. Millised on etapid haigustekitaja tuvastamiseks kliinilisest materjalist PCR meetodil?-algmaterjalisd
Kui praimerid on amplifitseeritava DNA järjestuse kahelt poolt kindlaks teinud ja piiranud, sünteesib termostabiilne DNA polümeraas praimerite 3’ otsast alates mõlemale DNA üksikahela fragmendile komplementaarse fragmendi, kasutades selleks segusse lisatud nukleotiide. Näitab mis järjestus DNA-s on. DNA polümeraas pikendab olemasolevat DNA ahelat, kuid selleks et DNA polümeraas saaks DNA- le kinnituda on vaja RNA molekule (praimerid), mis on komplementaarsed DNA molekuliga. Praimeri abil toimub ka sekveneerimine, sest siis on erinevate DNA molekulide algused samad. Milline meetod on reaalaja PCR? Reaktsiooni segusse pannakse täiendav praimer, mis jääb polümeerile ette. Selle küljes on floresents. Kui polümeraas teeb praimeri katki tekib floresentsi signaal, mille järgi saab teada et toimub DNA süntees. DNA küljes on floresents, kui tuleb polümeraas lükkab ta floresentsid lahti ja tekib värv.
.. g agaroosi. Valmistamist vaata tööst nr 3. (6) PCRi lõppedes (<1 tund), analüüsi 1/5 saadud produktist agaroosgeelil. Selleks pipeteeri 10 l 1 x TBE foreesipuhvrit (lilla) + 2 l PCR tuubist kokku 12 l, kanda kõik geelile. Geelile lisada kindlasti molekulmassi marker ja kontroll PCR (amplifikatsioon tühjalt pBS SK+ plasmiidilt). Interpreteeri tulemus. Saadud rekombinantsed plasmiidid on valmis inserdi sekveneerimiseks T7 praimeri ja "kit"i abil (järgmises praktikumis). Restriktsiooni tulemused: Minu minipreparatsioonis tuli välja 2 inserti. Üks umbes 2,5 kb pikkune ja teine umbes 6 kb pikkune. Võib olla see on tingitud sellega, et ensüüm Cfr421 ei töötanud väga hästi. 10 Lisaülesanded: 4.1) Leia Wallace reegli abil (4x GC + 2x AT) T3 ja T7 praimerite sulamistemperatuurid. Kui "annealing" või hübridisatsiooni temperatuur peab praimeri sulamistemperatuurist olema ~5 oC
Mahajääv ahel on DNA kaksikheeliksi ahel, millel replikatsioonikahvel liigub 5'-3' suunas. Selle tõttu ei saa mahajäävat ahelat replikatsioonikahvli liikumise suunas pidevalt sünteesida. Mahajääv ahel sünteesitakse fragmentide kaupa. Algsele DNA ahelale liidetakse RNA praimer ning uut ahelat sünteesitakse vastupidiselt replikatsioonikahvli liikumise suunale. Praimer eemaldatakse (prokarüootides DNA polümeraas I poolt) ning RNA molekulid asendatakse DNA molekulidega. Toimub uue RNA praimeri liitumine ning järgmise fragmendi süntees. Neid lõike nimetatakse Okazaki fragmentideks ning need liidetakse DNA ligaasi poolt, et saada terviklik DNA ahel. Algsele DNA ahelale liidetakse RNA praimer ning uut ahelat sünteesitakse vastupidiselt replikatsioonikahvli liikumise suunale. RNA primer is erased by a special DNA repair enzyme (an RNAse H) that recognizes an RNA strand in an RNA/DNA helix and fragments it; this leaves gaps that are filed in by DNA polymerase and DNA ligase.
· Maksas · Südames · lihastes 12. Selgitage DNA polümeraaside rolli replikatsiooniprotsessis. Miks vajavad DNA polümeraasid toimimiseks praimereid ja mida praimerid endast kujutavad? DNA-polümeraas sünteesib mõlema DNA ahelaga komplementaarsed uued DNA ahelda, peale seda kui helikaas on DNA kaksikahel lahti keeranud. DNA primaas sünteesib replikatsiooni alguskohale praimeri. DNA polümeraas jätkab praimeri lõpust edasi, liites praimeri 3'-OH otsa järgmise nukleotiidi, selle vabasse otsa järgmise jnejne. 13. Loetlege ja kirjeldage eukarüootse mRNA transkriptsioonijärgse modifitseerimise käigus toimivaid protsesse. Millises neist osalevad ribosüümid ja mida nad endast kujutavad? Prokarüootides mRNAd ei modifitseerita translatsioon järgneb vahetult transkriptsioonile. Eukarüootides on protsessid teineteisest isoleeritud transkriptsioon tuumas ja
tänapäeva bioteaduses üks olulisemaid tehnikaid. 45. Polümeraasi ahelreaktsioon võimaldab lühikese ajaga paljundada spetsiifilist DNA-d in vitro (katseklaasis) lähtudes üliväikesest DNA kogusest. Selles kasutatakse praimerite alusel sünteesitud oligonukleotiide, mis kinnituvad DNA erinevatele piirondadele ning mille vahel sünteesitakse korduvalt samapikkuselisi DNA lõike. See koosneb kolmest etapist: a) sekveneeritav DNA denatureeritakse kuumutamisel b) DNA hübridiseeritakse praimeri üleküllusel c) DNA polümeraas muudab praimeritevahelised üksikahelalised lõigud kaksikahelalisteks. Praimeri 3´-OH ots on sünteesi algussaidiks. DNA fragmentide arv kasvab eksponentsiaalselt. Tsüklites tekib vastaalt 2, 4, 8, 16 jne ahelat. 46. Kuidas on polümeraasi ahelreaktsioon muutnud geenitehnooogiat? PCR mängib tänapäeval geenitehnoloogias olulist rolli. Seda kasutatakse laialdaselt haiguste diagnostikas, näiteks saab tuvastada HI viirust ja tsüstilist fibroosi väga
2 µl polümeraasi puhvrit, mis sisaldab erinevaid sooli 2 µl 25mM MgCl2 (Mg2+ on polümeraasi kofaktoriks, samuti praimer-DNA seondamise stabilisaatoriks) 1 µl DstFlin forward praimeri 1 µl DstRlin reverse praimeri 0,2 µl template-DNAd – L-Desmo pEGFP-C2, mis on 335 bp pikk. 0,1 µl HotFIRE Pol® polümeraasi mis on stabiilne kõrge temperatuuri juures.
,,rasked", kolmandal pooldumisel olid aga 1/4 ,,hübriidsed" ja 3/4 ,,kerged". 91. Replikatsiooni alguspunkt ja replikatsioonisilm. DNA replikatsiooni initsiatsioon on limiteeritud spetsiifiliste initsiatsiooni regioonide - ori regioonide olemasoluga. Nimetus ori tuleneb inglisekeelsest terminist "origin of replication". Replikatsiooni initsiatsiooniks on vajalik DNA ahelate lokaalne lahtikeerdumine ning praimeri süntees. Erinevate DNA molekulide replikatsiooni puhul võib praimeriks olla kas DNA või RNA, samuti valguga seondunud nukleotiid. Praimeri sünteesib kas RNA polümeraas või primaas (ingl. k. primase). DNA dupleksi avamine võib toimuda kas transkriptsiooni toimel või spetsiifiliste initsiaatorvalkude seondumise tulemusena (DnaA oriC puhul, O oril puhul). Kuna DNA dupleksi avamine on lihtsam A- T rikastest regioonidest, on ori regioonid alati A-T rikkad
Selleks pipeteeri 10 l 1 x TBE foreesipuhvrit (lilla) + 2 l PCR tuubist kokku 12 l, kanda kõik geelile. Geelile lisada kindlasti molekulmassi marker ja kontroll PCR (amplifikatsioon tühjalt pBS SK+ plasmiidilt). 12 Interpreteeri tulemus. Saadud rekombinantsed plasmiidid on valmis inserdi sekveneerimiseks T7 praimeri ja "kit"i abil (järgmises praktikumis). PCRi tulemused. Marker 100 bp pBS SK+ Kristine Arvidas Hannes Mihkel Heleen Ksenia Marko Okana Jelena Doris Mikk Anna Alex Aare Irina Inna Jana Karl Suure pildi peal insertsioon puudub, restriktsioonanalüüsiga ilmus siiski välja 800-900 nukleotiidi pikk järjestus. Lisaülesanded: 4.1) Leia Wallace reegli abil (4x GC + 2x AT) T3 ja T7 praimerite sulamistemperatuurid. Kui
põlvkonnas DNA kergest ja raskest ahelast. Sama tehti ka taimerakkude ja radioaktiivse tümidiiniga mitteradioaktiivsel söötmel teisel jaotumisel ainult 1 kromosoomidest radioaktiivne.) Dispersiivne mudel mõlemas DNA molekulis sisaldavad DNA ahelad segu vanadest ja uuesti sünteesitud lõikudest. 50. DNA replikatsiooni initsiatsiooni mehhanism. DNA replikatsioon algab ori järjestustelt, kus toimub DNA ahelate lahtikeerdumine ja praimeri süntees. Bakterkromosoomil on ainult üks alguspunkt oriC. Replikatsiooni initsiatsiooniks on vajalik DNA ahelate lokaalne lahtikeerdumine ning praimeri süntees. DNA dupleksi avamine toimub kas transkriptsiooni toimel või spetsiaalsete initsiaator valkude seondumise tulemusena. Ori regioonid on alati A-T rikkad. 51. Erinevate DNA polümeraaside funktsioonid bakterites. Mis mehhanismidega on tagatud DNA replikatsiooni täpsus?
peaksid defektsed olema mõlemad tuumorisupressorgeeni alleelid. Päritavate vähihaiguste puhul on laps vanematelt saanud enamasti ühe mutantse alleeli. Rakupopulatsioonis tekib varem või hiljem spontaanne mutatsioon ka geeni teises alleelis ning sellest rakust, milles on mutatsiooni tagajärjel geeni mõlemad alleelid defektsed, arenebki tuumor. 28. Alleelispetsiifiline PCR – kuidas kasutada mutatsiooni analüüsil? Praimeri 3’ ots on disainitud nii, et see seostuks täpselt mutatsiooni kohta. Kui ei seondu, ei ole mutatsiooni. 29. Kolm erinevat meetodit genoomis SNPde või mutatsioonide uurimiseks. Sekveneerimine, mikrokiipanalüüs, kapillaarelektroforees 30. Millest sõltub ravimi toime organismis? Tooge näiteid? Ravimi toime organismile sõltub ravimi omadustest, aga ka organismi seisundist, individuaalsest tundlikkusest, indiviidi vanusest, metabolismist ja imendumisest
suudab eemaldada viimase DNA-le lisatud nukleotiidi (eksonukleaasne aktiivsus) st valesti lisatud nukleotiid eemaldatakse ning asendatakse õigega: DNA üks parandusmehhanisme bakteris. Pärast vea eemaldamist replikatsioon jätkub. DNA polümeraas I – aeglasem, aga tal on nii 3’ 5’ kui ka 5’ 3’ eksonukleaasne aktiivsus; Replikatsiooni käigus tunneb ära RNA praimeri ja asendab selle desoksüribonukleotiididega; Parandab vead, mida ei suutnud parandada DNA polümeraas III On ka DNA polümeraas V ja IV – neil puudub 3’-5’ eksonukleaasne aktiivsus, seetõttu teevad nad palju vigu 2. PRO- JA EUKARÜOOTSE RAKU GENOOM Prokarüoodil puudub organiseeritud struktuuriga rakutuum: DNA asetseb vabalt tsütoplasmas, RNA süntees toimub DNA ja tsütoplasma kokkupuutejoonel.
Elusorganismide geneetiline informatsioon on säilitatud kaheahelalise DNA kujul. Erandi moodustavad mõned RNA viirused, mille gneetilise materjali kandjaks on RNA. RNA viiruste puhul on replikatsioon RNA kahekordistumine. Ülejäänud organismidel on replikatsioon DNA kahekordistumine. Replikatsioon on DNA süntees. DNA süntees toimub liskas replikatsioonile veel rekombinatsiooni ja reparatsiooni käigus. Teiselt poolt on replikatsioon laiem mõiste kui DNA süntees hõlmates ka RNA praimeri sünteesi, DNA ja kromosoomi struktuuri muutusi ja replikatsiooni regulatsiooni. DNA sünteesi viib läbi ensüüm - DNA- sõltuv DNA polümeraas kusjuures substraatideks on desoksü-nukleosiid 5'-trifosfaadid. 2. Transkriptsioon - RNA süntees. Transkriptsioon tähendab mahakirjutamist ja tähistab molekulaarbioloogias RNA sünteesi DNA matriitsi alusel. RNA sünteesi regulatsioon on geeni aktiivsuse regulatsiooni põhiline tase
radioaktiivselt raskemat ahelat ja teine mitte. 50. DNA replikatsiooni initsiatsiooni mehhanism. DNA replikatsioon bakterikromosoomil algab ühest punktist ja seejärel liiguvad Y-kujulised replikatsioonikahvlid mööda rõngaskromosoomi vastassuundades. Bakteritel on üks alguspunkt, eukarüootidel on mitmeid, sest kromosoomid on lineaarsed. DNA replikatsioon algab ori järjestustelt, kus toimub DNA ahelate lahtikeerdumine ja praimeri süntees. Ahel keeratakse lahti A-T rikastest regioonidest initsiaatorvalgu DnaA toimel. Valk seostub kindlatele järjestustele oriC regioonis DNA on DnaA ümber krunditud. Liituvad ka DnaB tulikaas (abiks DNA lahtikeerutamiseks), lisanfub ka güraas (et ei tekiks superspiralisatsiooni). 51. Erinevate DNA polümeraaside funktsioonid bakterites. Mis mehhanismidega on tagatud DNA replikatsiooni täpsus? Soolekepikesel on leitud 5 DNA polümeraasi:
sünteesitud oligonukleotiide, mis kinnituvad DNA erinevatele piirkondadele ning milled vahel sünteesitakse korduvalt samapikkuselisi DNA- lõike. Praimerid on alati paarikaupa, st seonduvad erinevate DNA- ahelatega. Esimeses tsüklis sünteesitakse lähtuvalt praimeritest nn pikad DNA- lõigud, mis ületavad teise vastaspraimeri seondumissaite. Teises tsüklis seondub teine vastaspraimer juba sünteesitud DNA-ahelale ning selle ahela teine ots on esimese praimeri seondumissait. Järelikult toimub edasin süntees praimerite seondumissaitide vahel ning selle tulemusel moodustuvadki sama pikkusega DNA- fragmendid. 1. Sekveneeritav DNA denatureeritakse kuumutamisel 92- 95 kraadi juures 30 sekundit 2. Denatureeritud DNA hübridiseeritakse praimeri üleküllusel, 50-60 kraadi juures 30 sekundit, sõltuvalt
Dalgarno järjestuse paardumine mRNA komplementaarse osaga. REPLIKATSIOON algab järjestusest, mida kutsutakse origin'iks, igas DNA-s on neid palju. DNA polümeraasid ei saa DNA-ahelat lahti keerata. Replikatsioonis üks ahel pikeneb järjest (juhtiv ahel) ja teine pannakse kokku juppidest (mahajääv ahel), mis ühendatakse DNA-ligaasi abil. Helikaas keerab biheeliksi lahti kasutades ATP energiat. Primaas teeb lühikese RNA praimeri, mis on komplementaarnte templeit DNA-ga ja seejärejl hakkab polümeraas seda pikendama moodustades lühikese 5'RNA-3'DNA tütarahela. Seejärel võtab polümeraas üle ja jätkab ahela pikendamist. · Helikaas keerab DNA biheeliksi lahti · DNA güraas e. topoisomeraas kompenseerib lahtikeerdumist (aitab struktuuri hoida) · DNA-polümeraasid vastutavad polünukleotiidahelate sünteesi eest 5'->3' suunas
-Osaliste kordusühikutega alleele tähistatakse: täiskorduste arv - punkt - aluste arv osalises korduses -Näide: TH01 9.3 alleel(AATG)6(-ATG)(AATG)3 Mikrovariandid: -Defineeritakse alleelidena, millel pole aluskordusmotiivi täpseid kordusi või esinevad kordusmotiivi järjestuse variandid või mõlemad -Võivad esineda insertsioonid, deletsioonid või aluse vahetused -Järjestuse variatsioon võib esineda korduse sees, külgnevas alas või praimeri seondumise saidis -Võib põhjustada PCR ebaõnnestumist, kui polümorfism praimeri saidis - "null alleelid" Null-alleelid: 15 -Alleelid esinevad, kuid ei amplifitseeru nukleotiidi muutuse tõttu praimeri seondumissaidis -Alleelide väljalangemine on probleem, kuna heterosügootne proov määratakse valesti homosüsoodiks (nn valehomosügootsus) -Kaks PCR praimerite komplekti annavad erinevad tulemused -Probleemid andmebaaside kasutamisel
50. DNA replikatsiooni initsiatsiooni mehhanism. DNA helikaas katalüüsib kaksikahela eraldumist, nii et tekib üksikahel. Replikatsioon saab toimuma hakata kindlatest piirkondadest – ori-regioonid. Seejärel on vaja sünteesida praimer, mida teeb kas primaas või RNA polümeraas. Praimerit on vaja, sest DNA polümeraas saab sünteesida ainult olemasolevat ahelat - praimer on selleks algeks. Praimeri külge kinnitub DNA polümeraas. 51. Erinevate DNA polümeraaside funktsioonid bakterites. Mis mehhanismidega on tagatud DNA replikatsiooni täpsus? Pol I ja Pol II – DNA reparatsioon Pol III – põhiline süntees Pol IV ja Pol V – DNA süntees, kui Pol III töö on vea tõttu blokeerunud. DNA replikatsiooni täpsus on tagatud Pol III subühikute (epsilon) poolt ja samuti Pol I ja II vastutavad replikatsioonis tehtud vigade paranduste eest. 52
Replikatsioon algab korraga mõlemas suunas ning kestab kuni valmib terve uus kromosoom Initatsioonvalgud- tunnevad origin-punkti Topoisomeraas-avab konformatsiooni Helikaas- lahutab kaksikahela (lõhub H sidemed) ja mood. Replikatsioonikahvli Single Strand Binding Protein (SSB valgud)- kaitsevad avatud ahelat Primaasid- algatavad sünteesi DNA polümeraas III- vastavalt komplementaarusele sünteesib matriitsahelat 5´3´ RNA polümeraas- sünteesib mahajäävale ahelale praimeri. Praimerit pikedab DNA polümeraas III- tekivad Okazaki fragmendid. DNA polümeraas I- lagundab RNA praimeri ja asendab DNA-ga DNA- polümeraas- viib läbi replikatsiooni Ligaas- ühendab Okazaki fragmendid Replikatsioon algab mitmes kohas, raku paljunemistsükli S-faasis suunas 3´--5` DNA- ahelad on antiparalleelsed, replikatsioon saab olla pidev ainult ühelt ahelalt(leading strand). Teiselt ahelalt Okazaki gragmentide kaupa. Vigade parandamiseks on DNApolümeraasil
mõlemale sünteesitakse juurde uus komplementaarne ahel (uus ja vana ahel) 14. DNA replikatsioonikahvli struktuur: põhikomponendid Juhtivat ahelat sünteesitakse ühe pideva lõiguna Mahajääva e viivisahela süntees toimub 200bp lõikudena (okazaki fragmendid) Repl. Algab replikatsiooni alguspunktidest (eukarüootides mitu, pro’des üksainus) 1) Helikaas liigub piki liiderahelat ja keerab II ahela katki 2) Primaas sünteesib praimeri 3) DNA polümeraas kinnitub praimerile ja lisab nukleotiide ainult ahela 3’ otsa, nad ei suuda alustada uue ahela sünteesi vabadest nukleotiididest → vajab praimerit (vaba 3’ otsaga nukleotiidide ahelat) 4) Primaas sünteesib praimeri ahela 3’ otsale 15. Miks toimub mahajääval ahelal DNA süntees katkendlikult? Sest replikatsiooni kahvel liigub 5’ →3’ suunas, polümeraas ei oska vastupidises suunas nukleotiidahelat sünteesida
kujuline piirkond, kuhu seostuvad komplementaarsed nukleotiidid ja kus formeeruvad uued ahelad. Lähteained Nukleosiidtrifosfaadid dATP,dGTP, dTTP, dCTP, DNA sablonahel (template standart), RNA-praimer oligonukleotiid (4...60 nukleotiidi). Ensüümid ja katalüüsitavad protsessid. Helikaas DNA biheeliksi despiralisatsioon, DNA-polümeraasid polünukleotiidahelate süntees 5' 3' suunas (seotakse ühe nukleotiidi 3'-OH ja teise 5'- P). DNA-primaas oligonukleotiidse RNA-praimeri süntees. DNA-ligaas mahajääva ahela fragmentide ühendamine. Kuna uute polünukleotiidahelate süntees toimub 5' 3' suunas, siis üks ahel kasvab pidevalt juhtiv ahel (leading strand), teine aga lühikeste fragmentidena mahajääv ahel (lagging strand, uurija nime järge tuntakse neid kui Okazaki fragmente), mis seejärel ühendatakse. RIBONUKLEIINHAPPED (RNA): Sisaldavad -D-riboosi suhkru molekuli jäägina; Lämmastikalustest sisaldavad
2. Mõõdukalt korduvad DNA järjestused - 10 kuni 105 koopiat genoomi kohta. 3. Kõrgelt korduvad DNA järjestused - enam kui 105 koopiat genoomi kohta. REPLIKATSIOON Replikatsioon - päriliku materjali (mis võib olla nii DNA kui RNA) kahekordistumine. Elusorganismide geneetiline informatsioon on säilitatud kaheahelalise DNA kujul. Replikatsioon on DNA süntees. Teiselt poolt on replikatsioon laiem mõiste kui DNA süntees hõlmates ka RNA praimeri sünteesi, DNA ja kromosoomi struktuuri muutusi ja replikatsiooni regulatsiooni. DNA sünteesi viib läbi ensüüm - DNA-sõltuv DNA polümeraas kusjuures substraatideks on desoksü- nukleosiid 5'-trifosfaadid. Nukleiinhappe (DNA või RNA) ahel kasvab 5'3' suunas. Fosfodiesterside moodustub kasvava nukleiinhappe ahelas oleva viimase nukleotiidi suhkrujäägi 3'-OH rühma ja lisanduva nukleotiidi suhkrujäägi 5' C-ga seotud fosfaadi vahel
(DNA metüleerimine), ei ole seotud muutustega genoomis. Geneetilise info 3 põhilist ülekandeprotsessi: 1. Replikatsioon – kahekordistumine geneetiline info on säilitatud DNA kaksikheeliksi kujul viib läbi DNA-sõltuv DNA polümeraas (substraat: desoksünukleosiid-5’-trifosfaat) DNA replikatsioon – eukarüootidel RNA replikatsioon – viirustel DNA sünteesitakse – DNA alusel, RNA alusel; rekombinatsiooni, reparatsiooni alusel Kitsas mõiste – DNA süntees Laiem mõiste – RNA praimeri süntees, DNA ja kromosoomi struktuuri muutused, replikatsiooni regulatsioon 2. Transkriptsioon – mahakirjutamine RNA süntees DNA matriitsi alusel. RNA sünteesi regulatsioon on geeni aktiivsuse regulaatori põhiline tase! viib läbi DNA-sõltuv RNA polümeraas (substraat: ribonukleosiid-5’-trifosfaat) 1 Sünteesitud RNA ahel vastab 1:1-le temaga antiparalleelsele DNA matriitsahelale (komplementaarsusprintsiip).
KORDAMISKÜSIMUSED Talpsep 1. Millisel juhul on LCR eelistatud meetod PCR ga võrreldes LCR on suurema spetsiifilisusega kui PCR. Seda on kaval kasutada tuntud järjestuste ja punktmutatsioonide tuvastamiseks kui kasutada oleva DNA kogus on limiteeritud. 2. Milline meetod võimaldab RNA amplifitseerimist DNA juuresolekul? NASBA on RNA tuvastamiseks eriti hea meetod: RNA ahelale saab panna pöördtranskriptaasiga praimeri juurde, sünteesitakse uus ahel, RNAas lõhutakse H-ga ära ja sünteesitakse uuesti jne kuni saadakse detekteeritav kogus nukleiinhappe molekule. Tal on ka see omadus, et töötab DNA juuresolekul ei pea proovi ära puhastama, mis RNA puhul on väga keeruline. Kasutatakse ka ekspressiooniproduktide määramiseks. 3. Millised ensüümid on vajalikud TMA meetodil amplifitseerimiseks? TMA- transcription mediated amplification.
poolustele tõmbavad. 19. Telomeer milleks vajalik, kirjeldada lühidalt üldist ehitust. Telomeer on kromosoomi otsa kaitsev spetsiifiline kordusjärjestus. Kindlustab kromosoomi otste replikatsiooni, kaitseb nukleaaside eest ning hoiab ära kromosoomide ,,kokkukleepumise''. Koosnev u 600-2500 aluspaarist, 3' ots on 200bp ulatuses üleulatuv, lassotaoline, moodustab T-lingu. 20. Miks telomeerid lühenevad? Oksüdatiivne stress; DNA lüheneb iga replikatsioonitsükliga (RNA praimeri seondumiskohas pole enam nukleotiide). Telomeeride otsi pikendab 3' otsast telomeraas. Enamus somaatilistes rakkudes on telomeraas inaktiivne ning rakud saavad jaguneda vaid kindla arvu kordi, sest iga replikatsioonitsükliga jääb DNA lühemaks. See tuleb sellest, et DNA sünteesil mahajäävale ahelale RNA praimeri seondumiskohta ei täida nukleotiididega enam miski. Telomeerid on väga vastuvõtlikud ka oksüdatiivsele stressile. Põhjustab isegi
nukleotiidi juures, lülitatakse sünteesitavasse ahelasse juhuslik nukleotiid ja replikatsioon saab jätkuda. SOS vastuse käigus indutseeritakse E. coli rakkudes DNA polümeraasid Pol II, Pol IV ja Pol V. Pol IV ja Pol V. Pol IV ja Pol V võimaldavad jätkata DNA replikatsiooni kohalt, kus DNA polümeraas III kompleks on peatunud, DNA süntees toimub vigaderohkelt, sest Pol IV-l ja PolV-l puudub vigu korrigeeriv aktiivsus. Pol IV DNA sünteesi jätkamine mittepaardunud või valestipaardunud praimeri otsast raaminihkemutatsioonid. DNA kahjustuste ületamine (TLS). Alternatiivne DNA replikatsioon Teatud juhtudel võib DNA replikatsioon alata ka DnaA-st sõltumatult ning teistest kromosoomipiirkondadest stabiilne DNA replikatsioon SDR. 29. DNA replikatsiooni initsiatsiooni mehhanismid oriC'lt bakteris E. coli. DNA replikatsiooni initsiatsioon on limiteeritud spetsiifiliste initsiatsiooni regioonide - ori regioonide olemasoluga
koos vanad ja teises uued ahelad. Semikonservatiivne matriitsiks on mlemad DNA ahelad; mõlemas DNA molekulis on üks ahel uus ja teine vana. Dispersiivne mõlemas DNA molekulis sisaldavad DNA ahelad segu vanadest ja uuesti sünteesitud lõikudest. Kinnitust leidis semikonservatiivne mudel. 50. DNA replikatsiooni initsiatsiooni mehhanism. DNA repl algab ori järjestuselt, kus toimub DNA ahelate lahtikeerdumine ja praimeri süntees. Praimer (võib olla nii DNA kui RNA) on vajalik selleks, et DNA polümeraasil oleks vaba 3' ots, kuhu nukleotiide liitma hakata. DNA dupleksi avamine võib toimuda kas transkriptsiooni teoimel või spetsiifiliste initsiaatorvalkude toimel. Kuna AT vahel on üks vesinikside, on neid piirkondi lihtsam avada ning ori-regioonid on alati AT-rikkad. 51. Erinevate DNA polümeraaside funktsioonid bakterites. Mis mehhanismidega on tagatud DNA replikatsiooni täpsus?
KONSERVATIIVNE MUDEL: algselt kaksikheeliksilt sünteesitakse uus; ühes DNA molekulis on koos vanad ja teises uued ahelad 30 DISPERSIIVNE MUDEL: mõlemas DNA molekulis sisaldavad DNA ahelad segu vanadest ja uuesti sünteesitud lõikudest 50. DNA replikatsiooni initsiatsiooni mehhanism. DNA replikatsioon algab oriC järjestustelt, kus esmalt moodustub DNA ahelate lokaalsel lahkuminekul replikatsioonikahvel. Toimub DNA ahelate lahtikeerdumine ja praimeri süntees. DNA replikatsioonikahvli avamine toimub A-T rikastest regioonidest initsiaatorvalgu DnaA toimel. Järgnevalt toimub DnaA-valkude kooperatiivne liitumine, moodustub 20-40 polüpeptiidist koosnev valguline kompleks, mille ümber seondub oriC piirkond. ATP juuresolekul toimub avatud kompleksi moodustumine. Ahelate lahknemine algab kolme tandeemse 13bp oriC kordusjärjestuste piirkonnas ja levib seni, kuni on avanenud kogu 13bp korduste piirkond.
lahjendused, igasse 4 hemaglutineerivat antigeeni ühikut, lisame erütrotsüüdid. 19. Molekulaarbioloogilised uurimismeetodid (PCR) PCR – tundlik ja efektiivne. Mullis. 1 päevaga tulemused, lihtne, algmaterjali vaja vähe – koguaeg 2kordistub, pole vaja radioaktiivseid elemente (nt blottimisel on vaja). Vaja 2 praimerit, Taq polümeraasi. Töötsükkel: kokku 25-30x 1. DNA denaturatsioon – 92 kraadi 2. praimeri seondumine – 50 kraadi 3. Taq polümeraasi tööks – elongatsioon – 72 kraadi. Jäämäe konseptsioon: jäämäe alumine osa – ei märka mitte midagi, subkliiniline, haigusnähud puuduvad, neid põhjustavad defektsed viirused. jäämäe pealne osa – ilmekad haigustunnused, loomad paranevad ise multisüsteemsed haigused – põhjustavad varieeruvat pilti. Vaktsiinid – inhibeerivad viiruste seondumist või transkriptaasi.
uuritavas materjalis olevate sihtmärk-nukleiinhapete amplifikatsioon, 2. sondi amplifikatsioon 3. sondist lähtuva signaali amplifkatsioon. Viimased kaks leiavad harvem kasutamist. Uuritavas materjalis olevate sihtmärk-nukleiinhapete amplifikatsioon –PCR Polümeraasahelreaktsioon - PCR (polymerase chain reaction) koosneb 30-50 korduvast tsüklist, kusjuures iga tsükkel koosneb kolmest järjestikusest etapist: 1. nukleiinhappe denaturatsioon, 2. praimeri seostumine üheahelalisele nukleiinhappele, 3. praimeri sidunud nukleiinhappe ahelale komplementaarse ahela süntees (joonis 2). 65 NUKLEIINHAPPE DENATURATSIOON. PCR reaktsiooni toimumiseks peab sihtmärgina kasutatav nukleiinhape olema üheahelaline. Sihtmärgina kasutatav DNA vabastatakse mikroorganismist kas kuumutamisel, keemilisel või ensümaatilisel meetodil. Prokarüootsete organismide, eriti bakterite
DNA replikatsiooni käigus lülitatakse kasvavasse DNA ahelasse inimesel 3000 nukleotiidi minutis, bakteril 30000 nukleotiidi minutis. · Replikatsioonil käituvad matriitsina mõlemad DNA ahelad ning replikatsiooni lõppproduktideks on kaksikheeliksid, milles üks ahel on uus ja teine vana (semikonservatiivne mudel). DNA replikatsiooni initsiatsioon · spetsiifiliste initsiatsiooni regioonide ori regioonide olemasoluga. vajalik DNA ahelate lokaalne lahtikeerdumine ning praimeri süntees (praimerit on vaja selleks, et sünteesitaval polünukleotiidahelal oleks vaba 3'-OH ots, kuhu DNA polümeraas saab liita nukleotiide). · Vajalik ka AT-rikas regioon ja teatud DNA järjestused Replikatsioon toimub interfaasis Praimer - uue ahela algus · Lühike oligonukleotiidi (DNA või RNA) järjestus, mis on komplementaarne DNA järjestusega. · Vajalik DNA ahela sünteesi alustamiseks, sest polümeraasil on vaja vaba 3'-OH otsa. DNA helikaas - Eraldab DNA ahelad teineteisest.
ning tulemuseks on kaks molekuli, kus üks ahel on vana ja teine uus. (LEIDIS KINNITUSE) · Dispersiivne mudel mõlemad tütarahelad sisaldavad segu vanadest ja uutest sünteesitud lõikudest 50. DNA replikatsiooni initsiatsiooni mehhanism. · DNA replikatsioon algab ori (origin of replication) järjestustelt, kus toimub DNA ahelate lahtikeerdumine ja praimeri süntees (praimer on vajalik, et polünukleotiidahelal oleks vaba 3'-OH ots). Ori järjestus on alati A-T rikas. Bakterikromosoomil on ainult üks alguspunkt oriC. DNA dupleksi avamine toimub kas transkriptsiooni toimel või spets. initsiaatorvalkude seondumisel. 51. Erinevate DNA polümeraaside funktsioonid bakterites. Mis mehhanismidega on tagatud DNA replikatsiooni täpsus? · E. coli rakust on eraldatud 5 DNA polümeraasi:
Polümeraasi õlad sünteesivad erinevaid ahelaid - vasak õlg pidevalt sünteesitavat juhtivat ahelat (leading strand) ning parem õlg Okazaki fragmentidena sünteesitavat mahajäävat ahelat (lagging strand). Selleks, et DNA replikatsiooni läbiviiv ensüümkompleks koos püsiks, on Okazaki fragmentidena sünteesitav DNA ahel linguna replikatsioonikahvlis. -kompleks võimaldab ensüümikompleksi liikumist valmissünteesitud Okazaki fragmendi otsast järgmise praimeri 3' OH otsa. Mutatsioonisagedus Okazaki fragmentidena sünteesitavas DNA ahelas on 20 korda suurem kui pidevalt sünteesitavas ahelas ensüümkompleks liigub kahjustustest kõrgema sagedusega üle. DNA polümeraas III subühik (epsilon) vastutab DNA replikatsiooni täpsuse eest, tal on 3' 5' eksonukleaasne aktiivsus, mis võimaldab valesti DNA ahelasse lülitatud nukleotiidid kõrvaldada (tagab DNA polümeraasi ,,korrigeeriva" (proofreading) aktiivsuse)
replikatsioonikahvlite) liikumist denatureerunud piirkondade suhtes ja nägid, et replikatsioonikahvlid eemaldusid teineteisest. DNA replikatsiooni alguspunkt DNA replikatsiooni initsiatsioon on limiteeritud spetsiifiliste initsiatsiooni regioonide - ori regioonide olemasoluga. Nimetus ori tuleneb inglisekeelsest terminist "origin of replication". Replikatsiooni initsiatsiooniks on vajalik DNA ahelate lokaalne lahtikeerdumine ning praimeri süntees. Praimerit on vaja 61 selleks, et sünteesitaval polünukleotiidahelal oleks vaba 3'-OH ots, kuhu DNA polümeraas saab liita nukleotiide (vt. fosfodiestersidemete moodustumine DNA ahelas!). Erinevate DNA molekulide replikatsiooni puhul võib praimeriks olla kas DNA või RNA, samuti valguga seondunud nukleotiid. Praimeri sünteesib kas RNA polümeraas või primaas (ingl. k. primase). DNA dupleksi avamine võib
replikatsioonikahvlite) liikumist denatureerunud piirkondade suhtes ja nägid, et replikatsioonikahvlid eemaldusid teineteisest. DNA replikatsiooni alguspunkt DNA replikatsiooni initsiatsioon on limiteeritud spetsiifiliste initsiatsiooni regioonide - ori regioonide olemasoluga. Nimetus ori tuleneb inglisekeelsest terminist "origin of replication". Replikatsiooni initsiatsiooniks on vajalik DNA ahelate lokaalne lahtikeerdumine ning praimeri süntees. Praimerit on vaja selleks, et sünteesitaval polünukleotiidahelal oleks vaba 3'-OH ots, kuhu DNA polümeraas saab liita nukleotiide (vt. fosfodiestersidemete moodustumine DNA ahelas!). Erinevate DNA molekulide replikatsiooni puhul võib praimeriks olla kas DNA või RNA, samuti valguga seondunud nukleotiid. Praimeri sünteesib kas RNA polümeraas või primaas (ingl. k. primase). DNA dupleksi avamine võib
Polioviiruse RNA polümeraas Katalüütiliselt aktiivne on vaid vaba 3D. Puhtal kujul on 3D praimerist sõltuv ensüüm. Ruumiliselt struktuurilt on RdRp nn. “parema käe” struktuuriga- on olemas “sõrmede”, “peopesa” ja “pöidla” domeen. Aktiivsait asub ensüümi “peopesas”; “sõrmed” ja “pöial” puutuvad omavahel kokku. 3D-l on ka NTP-st sõltumatu RNA dupleksit lahtiharutav aktiivsus. RNA polümeraasi kaks peamist funktsiooni on: Praimeri süntees (Vg- VPg- pUpU) RNA süntees (elongatsioon) Polioviiruse genoomse RNA replikatsioon RNA süntees toimub sileda ER membraanidest moodustatud vesiikulites ja algab siis kui on kogunenud viirus-kodeeritud mittestrukturaalsed valgud. Replikatsioonil osalevad ka mingid raku valgud, RdRp katalüütiliseks subühikuks on 3D. Nii “+” kui “-“ RNA ahelate praimeeriks on VPg- pUpU. Positiivse ja negatiivse polaarsusega ahelate sünteesi vahekord on 20-50 : 1. Vaba
DNA Polümeraas I lõikab praimerid välja ja täidab lüngad Helikaasid kaksikheeliksi lahtikeeramine DNA güraas e. topoisomeraas lahtikeerdumisest tingitud pingete kompenseerimine, st DNA ahela läbilõikamine ja taas-ühendamine DNA primaas oligonikleotiidsete RNA-praimerite süntees DNA ligaas ühendab Okazaki fragmendid DNA polümeraas I liidab desoksüribonukleosiid-monofosfaadi (dNMP) ühikud praimeri (ssDNA) 3'-otsa. Telomeerid eukarüootsete kromosoomide lõpus paiknevad G-rikkad, 5...8 bp koosnevad korduvjärjestused (inimesel 1-12 tuhat bp). Kaitsevad DNA molekulide lõppe. Selgroogsetel järjestus TTAGGG. Telomeraas on RNA-sõltuv polümeraas (ribonukleoproteiin, toimib kui pöördtranskriptaas), mis pikendab 3'-otsa korduvjärjestuste lisamisega DNA on asendamatu ja järjestus peab püsima muutumatuna
*dispersiivne-mõlemad tütarahelad sisaldavad segu vanadest ja uuesti sünteesitud lõikudest *semikonservatiivne-14 N ->kege DNA ahel ja 15N->raske DNA ahel,ühelt ahelalt toimub replikatsioon pidevalt, teiselt aga katkendlikult fragmentidena.Leidis kinnitust. 50)DNA replikatsiooni initsiatsiooni mehhanism. -limiteeritud spetsiifiliste initsiatsiooni regioonide-ori regioonide olemasoluga. -on vajalik DNA ahelate lokaalne lahtikeerdumine ning praimeri süntees. -praimerit on vaja selleks et sünteesitaval polünukleotiidahelal oleks vaba 3'OH ots kuhu DNS polümeraas saab liita nukleotiide.Praimeriks võib olla kas DNA või RNA.Praimeri sünteesib kas RNA polümeraas või primaas, DNA dupleksi avamine võib toimuda kas transkriptsiooni toimel või spetsiifiliste initsiaatorvalkude seondumise tulemusena.Kuna DNA dupleksi avamine on kergem A-T rikastes regioonides on ori regioonid alati A-T rikkad.
Selle tõttu ei saa mahajäävat ahelat replikatsioonikahvli liikumise suunas pidevalt sünteesida (DNA polümeraas sünteesib uut ahelat ainult 5'-3' suunas). Mahajääv ahel sünteesitakse fragmentide kaupa. Algsele DNA ahelale liidetakse RNA praimer ning uut ahelat sünteesitakse vastupidiselt replikatsioonikahvli liikumise suunale. Praimer eemaldatakse (prokarüootides DNA polümeraas I poolt) ning RNA molekulid asendatakse DNA molekulidega. Toimub uue RNA praimeri liitumine ning järgmise fragmendi süntees. Neid lõike nimetatakse Okazaki fragmentideks ning need liidetakse DNA ligaasi poolt, et saada terviklik DNA ahel.[9] Regulatsioon Eukarüoodid Eukarüootides on DNA replikatsioon kontrollitud rakutsükli poolt. Rakk läbib kasvamisel ja jagunemisel erinevad rakutsükli faasid, DNA replikatsioon leiab aset S faasis (sünteesi faas). Eukarüootse raku arenemist läbi rakutsükli mõjutavad rakutsükli kontrollpunktid. Kontrollpunktide
Sel teel tagatakse geneetilise info ülekanne. DNA replikatsioon toimub rakutuumas ja eelneb rakujagunemisele. Ühest DNA molekulist kaks ühesuguse nukleotiidse järjestusega DNA molekuli. Järgnevalt sünteesitakse interfaasi ajal transkriptsiooni käigus rakutuumas olevalt DNA-lt mRNA. mRNA liigub tsütoplasmas paiknevatesse ribosoomidesse, kus translatsiooni tulemusena saadakse valgud. 8. DNA replikatsioon DNA kahekordistamine. Teostab ensüüm DNA polümeraas. Süntees toimub praimeri ja matriitsi olemasolul. Esmalt DNA helikaas lahutab kaheahelaline DNA. Praimer on vaba 3’OH rühmaga nukleotiidjärjestus, millelt alustatakse matriitsahela alusel DNA süntees. 3’OH otsa lisatakse sünteesil desoksüribonukleotiidid (5’fosfaat). 3’OH ja 5’ fosfaadi vahele tekib fosfodiesterside. Süntees toimub 5’-3’ suunas. DNA replikatsioon on kahesuunaline. Ühelt ahelalt toimub pidev süntees st juhtiv ahel (süntees toimub 5’3’ suunas, vaja ühekordselt praimerit)
Süntees 5’-3’ suunas. · Mahajääval ahelal(viivisahel) (lagging strand) toimub DNA süntees katkendlikult, teda saab pikendada RNA praimerite ja spetsiaalse ensüümi praimaasi abil. Süntees toimub 3’-5’ suunas (fragmendid sünteesitakse 5’ - 3’ suunas). 18. Kuidas sünteesitakse liiderahel ja viivisahel Liiderahela sünteesimine - katkematult 1 praimeriga Viivisahela sünteesimine - DNA praimaas sünteesib DNA järjestuse pealt lühikese RNA praimeri. - DNA polümeraas jätkab DNA sünteesi- moodustub Okazaki fragment. - Eesolev RNA praimer asendatakse DNA-ga. - Okazaki fragmentide katkekohad liidetakse DNA ligaasi abil. 19. Mis on Okazaki fragment ja millest ta koosneb? Okazaki fragmendid on lühikesed DNA fragmendid, mis tekivad sünteesi tagajärjel viivisahelal. Koosneb RNA praimerist ning järgnevast DNA polünukleotiidist. Need lõigud liidetakse DNA ligaasi poolt ja saadakse teine DNA ahel. 20
Dispersiivne - mõlemad tütarahelad sisaldavad segu vanadest ja uuesti sünteesitud lõikudest. Semikonservatiivne 14N isotoopi sisaldav kerge DNA ahel ja 15N isotoopi sisaldav raske DNA ahel. Ühelt toimub replikatsioon pidevalt, teiselt katkendlikult. Leidis kinnitust. 50. DNA replikatsiooni initsiatsiooni mehhanism. Limiteeritud spetsiifiliste initsiatsiooni regioonide ori regioonide olemasoluga. Replikatsiooni initsiatsiooniks on vajalik DNA ahelate lokaalne lahtikeerdumine ning praimeri süntees. Praimeriks võib olla DNA või RNA, samuti valguga seondunud nukleotiid. Praimerit on vaja, et sünteesitaval polünukleotiidahelal oleks vaba 3'-OH ots, kuhu DNA polümeraas saab liita nukleotiide. 51. Erinevate DNA polümeraaside funktsioonid bakterites. Mis mehhanismidega on tagatud DNA replikatsiooni täpsus? Bakteril E.Coli on leitud 5 DNA polümeraasi(I,II,III,IV,V) I ja II osalevad DNA vigade parandusel III on põhiline DNA replikatsiooni ensüüm
(mahajääv ahel), mis ühendatakse DNA-ligaasi abil. Helikaas keerab biheeliksi lahti kasutades ATP energiat. Primaas teeb lühikese RNA praimeri, mis on komplementaarnte templeit DNA-ga ja seejärejl hakkab polümeraas seda pikendama moodustades lühikese 5'RNA-3'DNA tütarahela. Seejärel võtab polümeraas üle ja jätkab ahela pikendamist. Pol on seotud templeitahelaga seotuse tõttu Rfc-valguga (replication factor C), mis pöördudes muutub PCNA-ks (proliferating cell nuclear antigen trimeerne valk, mis ümbritseb tütarDNA-d). Tavaliselt on
Meetodid: ahela katkestamise meetod, alus-spetsiifiline keemiline lõikamine, geel-sekveneerimine, automaatne DNA sekveneerimine d) PCR protsess (polümeraasahelreaktsioon) kontrollitud temperatuuriprogrammiga tsükliline protsess, mille käigus paljundatakse soovitud DNA järjestust. DNA polümeraas kopeerib üheahelalise DNA in vitro tingimustes. Vajalik on nelja desoksünukleotiidi juuresolek ning lõigu kaheahelalise DNA tekitamine praimeri abil. Praimeril peab olema vaba 3'-OH ots 10. Loetlege DNA denaturatsiooni põhjustavad tegurid. Nimetage, mida mõistetakse DNA sulamise all. Kõrge temperatuur (85-90°C) Ekstreemne keskkonna pH (<3 või >10) Kõrge ioonjõud Uute H-sidemete moodustajad (formamiid, uurea) DNA denaturatsioon temperatuuri toimel tähendab DNA sulamist. 11. On teada, et Homo sapiens'i ja Streptomyces albus'e DNA sulamistemperatuuride Tm väärtused on vastavalt 86,5 ja 100,5 oC. Skitseerige
DNA ligaas- seob Okazaki fragmendid, luues fosfodiestersideme DNA helikaas- lagundab vesiniksidemed Eksonukleaasid- lagundavad RNApraimeri DNA topoisomeraasid- keerab DNA ahela replikatsiooniks lahti DNA liider- ja viivisahela sünteesi erinevus. DNA polümeraasi liikumise suund. Okazaki fragmentide olemus ja funktsioon- Kuna viivisahela suund on 3´5´ suunaga,siis DNA polümeraas ei saa sinna koheselt uut ahelt sünteesida. DNA praimaas sünteesib RNA praimeri 5´3´ suunaga,sinna kinnitub DNA polümeraas ja sünteesib Okazaki fragmendi. Sünteesitud RNA praimer lagundatakse eksonukleaaside poolt ja Okazaki fragmendid seotakse ligaasi poolt. DNA liider- ja viivisahela sünteesi alustamine. Prereplikatiivses kompleksis asuvate alguspunkti äratundva kompleksi ja helikaaside fosforüülimine kui replikatsiooni algatamise eeltingimus eukarüootides. Raku G1 faasis tekib prereplikatiivne kompleks replikatsiooni origin punkti.See tagab selle, et
kui DNA ahela katkemiskohti. Üldiselt pole telomeerid kindla pikkusega. Inimesel 650 kuni 2500 kordust (eri kudedes erinev). 3´ots on alati G-rikas ja ca 200 bp üleulatuv, mis arvatakse tagasi pöörduvat ja lassotaolise T-lingu moodustavat. Miks telomeerid lühenevad? DNA molekul jääb aga iga replikatsioonitsükliga otstest järjest lühemaks, sest DNA sünteesil nn mahajääva ahela iga jupi sünteesi alustamiseks kasutatava RNA praimeri kõige viimast enda seondumiskohta ei täida DNA nukleotiididega enam miski. Seega sünteesitud mahajääv ahel on 5’ otsast lühem kui ahel, mille järgi ta sünteesiti. Mis juhtub rakuga, kui telomeerid on raku põlvkondade vältel täielikult kadunud? Sellised kromosoomid muutuvad ebastabiilseteks – kui katkiste otstega kromosoome on mitu, võivad nad omavahel liituda. Lisaks toimib kõikides rakkudes rakujagunemise kontrollsüsteem, mille käivitab
annaabi.ee 
