Viroloogia (0)

Viroloogia
Viiruse definitsioon
Viirused on rakulist ehitust mitteomavad obligatoorsed endoparasiidid.
Erinevad rakulise ehitusega parasiitidest selle poolest, et :

• Viirus ei ole iseseisvalt aktiivse eluga väljaspool rakku. Viiruse bioloogiline aktiivsus avaldub ainult nakatunud rakus.
  
• Viiruse geneetiline materjal asub vahetult rakus, ei ole ümbritsetud mingi membraaniga.
  
• Viirus ei paljune pooldumisega vaid sünteesitakse ta struktuurseid osasid ja pakitakse jälle kokku.
  
• Ükski teadaolev viirus ei kodeeri tervikliku translatsioonisüsteemi.
  
• Viirus on võimeline peremeesrakust lahkuma ja nakatama teisi rakke.
  

Virion- viiruse osake

• Virion- viirus-spetsiifiline struktuur , mis on ette nähtud viiruse genoomi toimetamiseks ühest rakust teise.
  

Erinevused virioni struktuuris kajastavad enamasti erinevusi viiruste elutsüklites. Olulisemaks sellistest omadustest on lipiidse membraani olemasolu (envelope viruses) või selle puudumine (nonenvelope viruses). Selline vahe kajastab erinevusi viiruste interaktsioonidel peremeesrakuga (seondumisel rakuga ja eraldumisega rakust).
Virioni struktuuri kajastavad põhimõisted

• Subühiku- üks kindlat ruumilist struktuuri omav polüpeptiidahel.
  
• Kapsiid - valguline struktuur, mis ümbritseb viiruse genoomi.
  
• Nukleokapsiid- täielik valk-nukleiinhappe kompleks .
  
• Envelope- lipiidne membraan ja sellega seondunud valgud .
  

Viiruste süstemaatika

• Morfoloogiline
  
• Antigeensed omadused
  
• 3-D struktuur
  
• Genoomide ja valkude järjestuse analüüs
  
• Bioloogilised omadused
  

Viiruste geneetilise mitmekesisuse peamised põhjused
Viiruseid iseloomustab suur geneetiline mitmekesisus. Selle moodustamisel osalevad mitmed mehhanismid :

• Viiruste kiire replikatsioonitsükkel ja suur järglaste arv.
  
• Sagedased mutatsioonid genoomi replikatsioonil (eriti RNA kaudu kulgeval replikatsioonil)
  
• Geneetiliste elementide vahetus:
  

Viiruse ja peremehe vahel

Erinevate viiruste vahel

Genoomi sisesed duplikatsioonid. Selle tulemusena moodustuvad korduvjärjestused on viirustele väga olulised.

Genoomi elementide ümbervahetus.

• Viiruse antiretseptor- virioni component (valk, glükproteiin), mille abil virion seondub peremeesrakule.
  
• Viiruse retseptor - peremeesraku pinnamolekul, millele virion seondub. Viiruse retseptoriks võivad olla valgud, glükoproteiinid, lipopolüsahhariidid, fosfolipiidid.
  

Infektsiooni algus, raku nakatamine.
Raku sisenemiseks vajavad ssRNA genoomsed faagid bakteri niitjaid struktuure- pilid, mis on viirusele retseptoriks:

• E.coli F (-sex) pili;
  
• Pseudomonas, caulobakter nn. Polaarne pili
  

Faagid seonduvad pili külgedele A- valgu (antiretseptori) kaudu, kattevalk pole seondumiseks oluline.
Faagi peremeesteringi määrab ära sobiva pili olemasolu raku pinnal. Seondumine pili struktuurile kutsub esile A-valgu lõikamise kaheks fragmendiks (15kDa ja 24kDa). RNA väljub kapsiidist (5’ ots ees) ja liigub piki pili raku suunas.
Nagu kõikide positiivse polaarsusega RNA genoomsete viiruste puhul on leviviiruste esimeseks biosünteesiks nakatatud rakkude translatsioon , see toimub rakku sisenenud genoomselt RNA-lt.
Prokarüootse translatsiooni initseerimine
Initsiatsiooniks on vajalik:

• 30S ja 50S sübühikut
  
• mRNA
  
• fMet - tRNA
  
• GTP
  
• Initsiatsioonifaktorid
  

IF1- blokeerib ribosoomi A-saidi, hoiab selle vabana ja võimaldab fMet-tRNA-l seonduda ainult P saiti.
IF3- blokeerib E-saidi ja takistab ribosoomi subühikute omavahelist asotsiatsiooni.
IF4- väike GTP-ase, mis seondub fMet- tRNAga ja aitab sellel seonduda 30S subühikuga.

• 16s rRNA tunneb oma 3’ otsaga ära RBS elemendi (ribosoomi seondumissait, Shine-Dalgarno järjestus) mis asub 5 -10 b ülapool initsiaatorkoodonit: see paigutab p-saidi initsiaatorkoodoni kohale.
  
• fMet- tRNA seondub paardulise abil initsiaatorkoodonile.
  
• Seondub 50S subühik.
  

Prokarüootne translatsioon
ELONGATSIOON algab A-saidi vabanemisega, mis võimaldab uute aa-tRNA-de seondumist. Selles osaleb elongatsioonifaktor Tu (EF-Tu; väike GTP-ase). Toimub peptiidsideme moodustamine ja translokalisatsioon : ribosoom liigub 3 nukleotiidi võrra edasi, peptidüül tRNA paigutub taas P- saiti. Seda protsessi katalüüsib elongatsioonifaktor G (EF- G). EF- Tu- GDP kompleksi konverteerimist EF- TU-GTP kompleksiks vahendab elongatsioonifaktor Ts (EF- Ts).
TERMINATSIOON toimub, kui A- saiti satub terminaator - koodon . Terminaator- koodonid tuntakse ära terminatsioonifaktorite poolt (release factor, RF) poolt:

• RF1 tunneb ära UAA ja UAG koodonid.
  
• RF2 tunneb ära UAA ja UGA koodonid.
  

Need faktorid käivitavad peptidüül- RNA-s asuva estersideme hüdrolüüsi ja vabastavad sellega sünteesitud valgu ribosoomi küljest. Kolmas factor RF3 , katalüüsib RF1 ja RF2 vabanemist peale terminatsiooniprotsessi.
NB!

Prokarüootses rakus on transkriptsioon ja translatsioon sageli samaaegsed.

Prokarüootses rakus ei ole AUG ainus initsiatoorne koodon (ca ¼ juhtudel on selleks GUG või UUG), kuid initsiatoorseks aminohappeks on alati fMet ( ja vastavalt tRNA).

Prokarüootses rakus ei sõltu translatsiooni mRNA 5’ otsast. , st transleeritakse ka polütsistroonseid maatrikseid.
Translatsioon ja selle regulatsioon: MS2
Leviviridae esindajate geeniekspressioon on väga hästi reguleeritud:

• Replikaasi sünteesitakse replikatsiooni alul ja väikestes kogustes
  
• Kattevalku sünteesitakse infektsiooni lõpus ja suurtes kogustes
  
• Maturation valku (valmimisvalk) vajab viirus vaid ühte koopiat virioni kohta ja selle ekspressioon toimub madalal tasemel.
  

See kontroll toimib eelkõige translatsioonilisel tasandil tänu spetsiifilistele RNA teise astme struktuuridele , mis reguleerivad ribosoomide juurdepääsu initsiatsiooni-koodonitele:

• Maturation valku (erinevatel perekondadel A-valk või A2 valk) transleeritakse ainult kasvavalt mRNA ahelalt.
  
• Replikaasi (R) ja lüüsivalgu (L) geenid asuvad kattevalgu geeni translatsioonilise kontrolli all.
  

kattevalgu RBS ei ole “võtmekohaks” ainult MS2 RNA translatsioonil . Sama regioon osaleb ka transkriptaasi seondamisel ja seob omavahel translatsiooni ja replikatsiooni regulatsiooni. Kattevalgu enda geenil negatiivne regulatsioon puudub.
Replikaasi translatsioon
Replikaasi geen asub kattevalgu geeni translatsioonilise kontrolli all. Seetõttu blokeerivad terminaatorkoodonid kattevalgu ORF 5’ poolses osas ka replikaasi translatsiooni. Selle põhjuseks on asjaolu , et replikaasi RBS regioon MJ moodustab kaheahelalise struktuuri kattevalgu geeni kodeeriva regiooniga. Ribosoomid mis transleerivad kattevalgu geeni “sulatavad” lahti R-geeni RBS järjestuse ja avavad R-geeni translatsiooniks. Kattevalk toimib ka R-geeni negatiivse regulaatorina. Kui kattevalgu konsentratsioon kasvab ja valk hakkab moodustama diameere siis seonduvad need R geeni alguses asuvale operator- juuksenõela struktuurile ja blokeerivad blokeerivad ribosoomide seondumise.
Lüüsvalgu translatsioon
Lüüsvalgu geen asub samuti kattevalgu geeni translatsioonilise kontrolli all (terminaatorkoodonid kattevagu geenis blokeerivad lüüsvalgu translatsiooni).
Selle põhjuseks on:

• Lüüsivalgu geeni alguses asub “juuksenõela” struktuur mis ei lase ribosoomidel otse initseerida L- geeni translatsiooni.
  
• Lüüsivalgu geenil puudub RBS järjestus
  

Seepärast oimub L-geeni translatsioon järgmiselt:

• Ribosoom, mis transleerib kattevalgu geeni, jõuab oma terminaatorile ja toimub translatsiooni termineerumine.
  
• Peale terminatsiooni, võib see ribosoom tänu juhuslikule liikumisele piki RNA-d jõuda L-geeni algusesse ja alustada translatsiooni. Selline initsiatsioon toimub madala tõenäosusega, see tõenöosus on määratud kapsiidivalgu terminaatori (pos. 1727) ja lüüsivalgu initsiaatori (pos. 1678) vahel. Ribosoomi liikumine on juhuslik ja re-initseeritakse lähimal initsiaatoril. Selline mehhanism tagab ka L-valgu ekspressiooni hilises infektsioonis.
  

Valmimisvalgu ekspressioon
Valmimisvalku transleeritakse ainult kasvavalt mRNA ahelalt, kuna selle geeni RBS on vaba ainult senikaua kuni kasvav RNA molekul pole saavutanud alalist teise astme struktuuri, mille koosseisus RBS moodustab stabiilse dupleksi.
Vastava teise astme struktuuri saavutamine on spetsiaalselt aeglustatud nn.kineetilise lõksu abil: algul moodustub ebastabiilne teise astme struktuur, milles RBS on vaba (komplementaarne järjestus pole veel sünteesitud), vastava komplemendi sünteesi järel läheb metastabiilne struktuur aeglaselt üle alaliseks stabiilseks struktuuriks. Muidu moodustuks stabiilne struktuur sekundiga, mis ei ole translatsiooni initsiatsiooniks piisav.
Translatsioon leiab asset ainult ebastabiilse konformatsiooni ajal. Selle mehhanismi mote seisneb selles, et A- valgu sünteesi võimaldatakse vaid lühikest aega.
ssRNA faagide replikatsioon : QB replikaas
faagi QB replikaas (RNA dependent RNA polymerase , RdRp ) koosneb neljast subühikust, millest vaid üks on viiruse spetsiifiline.

• Subühik I: raku ribosomaalne valk S1
  
• Subühik II: faagi R-valk
  
• Subühik III: raku translatsiooni (elongatsiooni) faktor EF-Tu
  
• Subühik IV: raku translatsiooni (elongatsiooni) faktor EF-Ts
  

Seega kuulub faagi replikaasi kolm raku translatsiooni osalevat valku, mis moodustavad koos viiruse valguga aktiivse replikaasikompleksi.
Negatiivsete ahelate sünteesiks on vaja kõiki nelja subühikut. Lisaks sellele on negatiivsete ahelate sünteesil abifaktoriks bakteri geeni hfq product (nn.host factor), mis hülbustab tugevalt struktureeritud mRNA-dele ligipääsemist. IFQ on E.coli polyA järjestusi seonduv valk ja tema loomulik funktsioon on transkriptsioonifaktor sigma mRNA translatsiooni soodustamine. IFQ on heksameer, erinevalt kolmest ülejäänud raku faktorist ei seondu RdRp-ga vaid hoopis faagi RNA (positiivne ahel) 3’ otsaga (-CAAoh) mis on selle valgu puudumisel dupleksis lähedal asuvate G-jääkidega. IFQ harutab selle juuksenõela lahti ja vabastab 3’ otsa.
Replikatsioon
QB replikaas seondub RNA-ga kahes sisemises saidis (S ja M):

• Interaktsioon S- saidiga on vajalik ribosoomide väljatõrjumiseks maatriksist. Seda vahendab subphik 1(S1 valk , selle valgu loomulik funktsioon on translatsiooni initsiatsiooni käigus seondada mRNA ribosoomile; S- sait vastab kattevalgu translatsiooni alguspunktile , seega funktsioneerib S1 valk viiruse RdRp-s samamoodi kui ka ribosoomis). See on ka põhjuseks miks S1-valk on vajalik aiult negatiivse RNA sünteesiks.
  
• Interaktsioon M-saidiga on replikatsiooniks absoluutselt vajalik. M-saidiga seondunud replikaasi aktiivtsenter asub kontaktis genoomi 3’- otsaga. Seega on replikatsiooni initseerimiseks oluline pigem RNA ruumiline struktuur. Kuna replikatsioon initseeritakse G-jäägi liitumisega siis arvatakse, et selleks on oluline EF- Tu.
  

Replikatsiooni käik

• RdRp sünteesi kiiruseks on umbes 35 b/sekundis.
  
• Replikatsiooni esimeseks etapiks on vaba negatiivse polaarusega RNA süntees, dsRNA -d ei teki. Tavaliselt toimub ühelt positiivselt RNA ahelalt mitu järjestikust negatiivse ahela sünteesi initseerimist. Süntees lõpeb ühe täiendava A-jäägi lisamisega minus ahela otsa. Kuna pluss ahel algab G-jääkidega (pppGpGpGp…) siis on negatiivse ahela 3’ otsas järjestus CCCAoh.
  
• Positiivse polaarsusega RNA de süntees erineb negatiivse polaarsusega RNA sünteesist, on lihtsam ja efektiivsem ning sõltub RNA 5’- ja 3’-otstes asuvatest struktuursetest elementidest. Ka siin lisab RdRp maatritsi 3’ otsa täiendava A-jäägi taastades normaalse 3’ otsa (CCAoh).
  

Loeng 2 Merits
Positiivse polaarsusega RNA viiruseda

• + RNA viiruste genoom on sama polaarsusega kui mRNA.
  
• + RNA viiruste paljad genoomid on infektsioonilised.
  
• + RNa viiruste esimeseks biosünteesiks rakus on alati translatsioon.
  
• + RNa viiruste replikaas on alati transleeritav otseselt genoomselt RNA-lt.
  
• Kõik eukarüootide + RNA viirused replitseeruvad alati raku tsütoplasmas ja replikatsioon on alati seotud raku membraaniga.
  

Eristatakse RNA viiruste seas nelja erinevat super -sugukonda:

Picorna sarnased viirused.

Alpha sarnased viirused.

Flavi sarnased viirused.

Corona sarnased iirused
Sugukond Picornaviridae: virionid
Virion on membraanita ja ca 30nm diameertigam ikosaeeder. Virioni kapsiidi mooduatavad kolmest struktuurvalgust (VP1, VP2, VP3) koosnevad protomeerid.
Polio- ja rhinoviiruste puhul on igale protomeerile omane sügav “vagumuse” või “kanjoni” olemasolu välispinnal. See kanjon on kohaks kus asub raku retseptorit seondav akseptorsait,
Aphtho- ja cardioviirustel on siledad virionid ja seepäraste erineb nende viiruste retseptorit siduva saidi struktuur oluliselt eelmiste viiruste struktuurist.
Polioviiruse virionid on stabiilsed (ka madala pH suhtes) ja piisavalt suured mahutamaks lisaks viiruse genoomile veel kuni 1500 b jagu RNA-d. seega ei ole genoomne RNA virionides tihedalt pakitud ja on võimalik , et kapsiidi struktuuri stabiliseerimises osalevad ka RNA interaktsioonid virioni valkudega.
Picornaviiruse genoom
Genoomne ssRNA on 7.2-8.5 kb pikkune . Genoomi 5’ otsas asub VPg (22-24AH jääki) mis seondub RNA 5’ otsaga Tyr jäägi kaudu . genoomi 5’- terminaalne järjestus on alati VPg- pUpUpA. Genoomi 3’ otsas asub polüA pikkusega 35-100 b.
Picornaviiruste genoomi mittekodeerivad alad on väga konserveerunud ja funktsionaalselt väga tähtsad: 5’-NTR on pikk (624-1199b).
Polioviiruse RNA: esimesed 88 b moodustavad “ristikheinalehe” laadse sekundaarstruktuuri ; sellele järgneb IRES struktuur (internal ribosomal entery site) pikkusega ca 400b; IRES elemendile järgneb veel 154 b pikkune mitte transleeritav ala.
3-NTR on suhteliselt lühike (14 -126 b) ja on arvatavasti oluline replikatsiooniks. Polioviiruse 3’.NTR moodustab topelt stem loop struktuuri.
Polioviiruse kodeeritud valgud
Picornaviiruste genoomi kodeeriv ala on organiseerutud väga lihtsalt: genoomis on ainult pks lugemisraam , mis kodeerib polüproteiini pikkusega 2,178-2,322 AH jääki. Polüproteiin lõigatakse ko- translatsiooniliselt kolme viiruse proteaasi (2A, 3C, 3CD) poolt 11 -12 –ks erinevaks valguks.
1A (VP4), 1B (VP2), 1C (VP3) ja 1D (VP1) on kapsiidivalgud.

• 2A on polioviiruse varajane proteaas , teostab polüproteiini kotranslatsioonilist lõikamist endast eespool. Polioviiruse 2A valk on ka peremehe translatsiooni mahasuruja.
  
• 2B seondub membraanidega ja teeb nendesse kanaleid (viroproiin). 2B osaleb ka RNA replikatsioonis , kuid tema tomumismehhanism ei ole teada.
  
• 2C osaleb picornaviiruste RNA replikatsioonis NTP-as’ina ja vahendab viiruste replikatsioonikomplekside kinnitumist rakumemebraanidele.
  
• 3AB on VPg eelvalk, millest replikatsiooni käigus lõigatakse lahti VPg (3B). 3 AB stimuleerib ka 3D polümeraasi ja 3CD proteaasi aktiivsust.
  
• 3C on kemotrüpsiini – tüüpi proteaas, mille katalüütiline aminohappe jääk on mitte seriin vaid tsüsteiin. 3C ja tema eelvalk 3CD teostavad enamuse polüproteiini lõikamisest, peale selle omab 3C ka rakulisi sihtmärke.
  
• 3D on RdRp katalüütiline subühik. Erinevalt enamikest tuntud RdRp-dest on polioviiruse 3D praimerist sõltuv ensüüm .
  

Polioviiruste infektsioonitüskkel
Poliovirus nakatab looduses vaid inimesi ja simpanseid, kuid rakukultuuris paljuneb ta edukalt ka teiste primaatide rakkudes.
Kogu polioviiruse replikatsioonitsükkel toimub nakatatud rakkude tsütoplasmas:

• Infektsioon algab seondumisega retseptoritele ja sisenemisega rakku.
  
• Esimese etapina toimub mRNA translatsioon.
  
• Järgneb raku translatsiooni mahasurumine ja viiruse RNA replikatsioon.
  

Uute genoomide ja struktuursete valkude kogunedes toimub uute virionide moodustamine , mis vabanevad nakatunud raku purunemisel. Kokku kestab polioviiruse infektsioonitsükkel 5-10 tundi.
Retseptor ja antiretseptor
Polioviiruse retseptor PVR (CD155) on membraanne gülokoproteiin, mis omab kolme Ig- sarnast domääni (V- C2- C2) , transmembraanset domääni ja väikest tsütoplasmaatilist domääni. Polioviiruse seondamiseks on vajalik ainult PVR V- domään. Enamuste rihnoviiruste retseptoriteks on ICAM-1 membraanvalk.
Antiretseptor asub polio- ja rhinoviiruste virionide pinnal paiknevate kanjonite- laadsete struktuuride põhjas.
FMDV , coxackie A9 ja paljude teiste picornaviiruste kapsiiidid ei oma kanjoni struktuurilist pinda, ja arvatakse, et need viirused seonduvad raku poolsele retseptoritele virioni pinnal asuvate silmuste (loop) kaudu.
Polioviiruse genoomi sisenemine rakku
Polioviiruse rakku sisenemise esimeseks etapiks on endotsütoos. Erinevalt teistest viirustest on polioviiruse genoomi sisenemine rakku pH sõltumatu, kuid absoluutselt vajalik on virioni interaktsioon retseptoriga (CD155. Retseptorile seondumine indutseerib virionis konformatsioonilise muutuse: virioni pinnale “väljub” VP1 valgu N-terminaalne ots. VP1 valgu N-terminaalses osas asub 30 AH pikkune amphipaatiline heeliks , mis interageerub raku memmbraaniga. Selle tulemusena moodustub virioni ühes tipus membraani läbiv kanal, mille kaudu virionis sisalduv RNA kantakse üle rakku.
Polioviiruse RNA polümeraas
Katalüütiliselt aktiivne on vaid vaba 3D. Puhtal kujul on 3D praimerist sõltuv ensüüm. Ruumiliselt struktuurilt on RdRp nn. “parema käe” struktuuriga- on olemas “sõrmede”, “peopesa” ja “pöidla” domeen . Aktiivsait asub ensüümi “peopesas”; “sõrmed” ja “pöial” puutuvad omavahel kokku. 3D-l on ka NTP-st sõltumatu RNA dupleksit lahtiharutav aktiivsus.
RNA polümeraasi kaks peamist funktsiooni on:

• Praimeri süntees (Vg- VPg- pUpU)
  
• RNA süntees (elongatsioon)
  

Polioviiruse genoomse RNA replikatsioon
RNA süntees toimub sileda ER membraanidest moodustatud vesiikulites ja algab siis kui on kogunenud viirus-kodeeritud mittestrukturaalsed valgud. Replikatsioonil osalevad ka mingid raku valgud, RdRp katalüütiliseks subühikuks on 3D. Nii “+” kui “-“ RNA ahelate praimeeriks on VPg- pUpU.
Positiivse ja negatiivse polaarsusega ahelate sünteesi vahekord on 20-50 : 1. Vaba negatiivset ssRNAd nakatatud rakkudes ei leidu.
Polioviiruse translatsioon: IRES element
Picornaviirustel puudub cap-struktuur.
Polioviiruse genoomil on 714b pikkune 5’ liider- järjestus, millel on:

• Intensiivne sekundaar - ja ruumiline struktuur ja
  
• Milles paikneb kokku 7 translatsiooniks mittekasutatavat AUG koodonit .
  

Seega ei saa picornaviirused kasutada valgusünteesi initseerimiseks standartset cap-sõltuvat skaneerimise mehhanismi ja translatsiooni initseerimine toimub sisemise initsiatsiooni mehhanismi abil.
Picornaviiruste IRES elemenid kujutavad endast intensiivse sekundaar-struktuuriga RNA järjestusi. Praegustel andmetel seondavad IRES elemendid otseselt ribosoomi 40 subühikut, mis:

• EMCV IRES puhul seondub otseselt initsiatoorsele AUG koodonile.
  
• Polioviiruse IRES puhul skaneerib mRNA-d alates IRES elemendist kuni itintsiatoorse AUG koodnini.
  

IRES elemenid toimimise mehhanism
Enamiku picornaviiruste IRES elementidel toimuvad translatsiooni initsiatsioonis ei osale initsiatsioonifaktor elF- 4E (otseselt cap-struktuuri siduv faktor).
eIF- 4E asemel võib translatsiooni initiatsioonis osaled ka eIF- 4G C-terminaalne domeen (moodustub nakatunud rakus eIF- 4G lõikamisel 2A proteaasi poolt).
Initseerimine algab eIF- 4G C-terminaalse fragmendi cap-sõltumatu seondumisega IRES elemendile. See seondumine on vahendatud raku adapter-valgu poolt.
Picornaviiruste RNA rekombinatsiooni skeem (copy-choice mehhanism)
Picornaviirustele on iseloomulik küllalt kõrge rekombinatsiooni sagedus:

• Kahe sama serotüüpi viiruse puhul on see 10 – 20% ühe infektsioonitsükli jooksul;
  
• Erinevate serotüüpide vahel on see vaid 0,01%
  

Rekombinatsioon toimub RNA sünteesi käigus (enamasti negatiivsete ahelate sünteesi jooksul) nn. Copy-choice mehhanismi abil:

• RNA polümeraas koos sünteesitava ahelaga eraldub maatritsilt;
  
• Sünteesitav ahel paardub järgnevalt teise RNA molekuliga;
  
• Süntees jätkub uuel maatritsil.
  
• Protsessi tulemuseks on rekombinantne RNA molekul.
  

Teiseks geneetiliseks variatsioonide tekitamise mehhanismiks on picornaviirustel RNA polümeraasi poolt tekitatud vead ( üks viga 10 000 nukleotiidi kohta).
Virionide moodustumine
Protomeer - Mitme subühikulised valgud sisaldavad kahte või enamat mittekovalentselt seotud polüpeptiidi, mis võivad olla nii identsed kui ka erinevad. Kui vähemalt kaks ahelat mitmesubühikulises valgus on identsed, on valk oligomeerne ning identsed ühikud, mis koosnevad vähemalt ühest ahelast, on protomeerid.
Picornaviiruse virionide moodustumine on mitmeetapiline protsess. Selle teadaolevateks protsessideks on:

• Protomeeride (VP0 + VP1 + VP3) assotsieerumine pentameerideks.
  
• Pentameerid ( 12 tk) moodustavad pro-virioni, milles asub RNA genoom.
  

Spetsiifilist pakkimissignaali picornaviiruste RNA-s seni leitud ei ole. RNA pakkimine toimub arvatavasti valmis kapsiidi sisenemise teel. Küll on aga näidatud, et pakkimine on seotud RNA sünteesiga.
RNA pakkimine käivitab viimase virioni valmimisega seotud protsessi, milleks on VP0 autokatalüütiline lõikamine.
Polioviiruse infektsiooni mõju peremeesrakule
Poliovirus surub nakatatud rakkudes maha raku biopolümeeride sünteesi:

• Valgusünteesi surutakse maha poole tunni jooksul peale infitseerimist.
  
• RNA süntees surutakse maha umbes tunni ajajooksul peale infitseerimist.
  
• DNA süntees lõpeb umbes nelja tunni jooksul (see efekt tuleneb raku valgusünteesi mahasurumisest).
  

Poliovirus on võimeline indutseerima ka nakatatud raku apaptoosi (selles on tähtsaim osa viiruse proteaasidel).
Raku RNA sünteesi blokeerimine. Inhibeeritakse kõiki RNA polümeraase:

• Eriti tugevasti ja kiirelt surutakse maha RNA pol II aktiivsus. Üheks RNA sünteesi mahasurutavaks mehhanismiks on transkriptsioonifaktori II D lõikamine viiruse 3C proteaasi poolt;
  
• RNA pol III aktiivsuse mahasurumiseks lõikab 3C ka TF- III C-d sisaldavat kompleksi;
  
• RNA pol I aktiivsuse mahasurumiseks lõikab 3C transkriptsioonifaktoreid SL-1 ja UBF.
  

RNA viiruste seal kolm super-sugukonda

• Pikorna sarnased viirused
  
• Alfa-sarnased viirused
  
• Flavi-sarnased viirused
  

Alfa-sarnased viirused
Alfa sarnaseid viiruseid leidub nii putukatel (tetraviirused), selgroogsetel (togaviirused, HEV) kui ka taimedel (tobamoviirused, bromoviirused, protexviirused jne).
Virionid- sfäärilised või spiraalsed.
Ühe või mitme komponentsed genoomid.
Alfa –sarnaseid viiruseid ühendatavaks joonteks on :

• Homoloogia replikaasi valkudes.
  
• Cap- struktuur RNA genoomi 5’ otsas. See struktuur sünteesitakse viiruse kodeeritud ensüümide poolt spetsiifilist mehhanismi kasutades.
  
• Replikatsioon toimub sarnase skeemi järgi ja leiab asset raku membraanidest moodustunud struktuuride- sfäärulites.
  
• Vähemalt osa struktuurseid valke ekspresseeritakse subgenoomsete (sg) RNA-de abil. sgRNA-d sünteesib viiruse replikaas genoomi negatiiivses ahelas paiknevalt sg-promooterilt.
  

Sugukond Togaviridae

• Perekond Alphavirus: Sindbis viirus (SIN), Semliki Forest virus (SFV), Chickunguunya viirus (CHIKV).
  
• Perekond Rubivirus, ainus tuntud esindaja on Rubella virus (RUB, punetiste viirus). Ei oma putukvektorit, inimene on ainus peremees.
  

Virion: membraaniga sfäärilised, diameeter on ca 70 nm, kapsiid koosneb 240-st kapsiidivalgu molekulist.
Ümbrise membraan pärineb raku plasmamembraanist ja selles asuvad glükoproteiinidest koosnevad “ogad” (alfa- viirustel E1 ja E2 valgud, 80 *3 koopiat kummastki).
Alfa-viiruse zonootiline tsükkel
Viirused mis looduses tsirkuleerivad lülijalgsete vektorite ja selgroogsete peremeeste vahel nimetatakse arboviirusteks (arthropode borne virus).
Alfa-viirused on tüüpilised abroviirused:

• Infektsioonide hooajalisus ja tsüklilisus.
  
• Infektsioon vektoris asümptomaatiline.
  
• Levik ülekandevektori kaudu on ainus looduses esinev ülekandevorm.
  
• Levik inimesele on juhuslik (tupikperemees) ja on seotud muutustega moskiitode populatsioonis.
  

Alfa-viiruste levik, peremehed

• Erinevad alfaviirused nakatavad imetajaid, linde ja kalu; peale selle nakatatakse ka oma selgrootuid vektoreid.
  
• Alfaviirused põhjustavad palavikku, löövet ja artriiti, kuid mitmetel alfaviirustel on võime põhjustada ka letaalset entsefaliiti.
  
• SIN ja SFV laboratoorsed tüved on apatogeensed ja on tähtsad nii mudelobjektidena kui ka geenitehnoloogia süsteemidena.
  

Mõju peremeesrakule

• Selgrootute rakkudes: läheb kiirelt üle püsivaks infektsiooniks, mõjutab rakke vähesel määral.
  
• Selgroogsete rakkudes: peremeesraku transkriptsiooni ja translatsiooni mahasurumine, apaptoosi indutseerimine.
  

Alfa-viiruse genoom
Alfa- viiruste genoomne RNA on ca 12 kb pikkune. Teda iseloomustaks:

• Genoom 5’-otsas cap-struktuur;
  
• Genoom 3’- otsas asub polyA järjestus, ca 70 jääki;
  
• 5’-terminaalne 2/3 genoomi kodeerib mittestruktuurseid valke (NSP, ekspresseeruvad otse genoomilt).
  
• 3’- poolne 1/3 genoomi kodeerib struktuurseid valke (SP) ja ekspresseerub sgRNA kaudu. sgRNA sünteesitakse infektsiooni käigus (virionides seda ei ole) subgenoomselt promootorilt viiruse RdRp poolt. sgRNA on capeeritud ja polüadenüleeritud.
  

Seondumine rakule ja sisenemine rakku
Rakkudesse sisenemiseks kasutatakse alternatiivseid retseptoreid. Alfa-viiruse antiretseptoriks on E2 glükoproteiin. Retseptor-antiretseptor interaktsioon indutseerib virionis konformatsioonilised muutused, mis on olulised partikli edasisel lahtipakkimisel.
Rakku sisenemine toimub retseptor- vahendatud endotsütoosi teel, viiruse membraani liitumine vesikulite membraaniga on pH-sõltuv protsess:

• Happelistes tingimustes (pH 5- 6) E1:E2 diameerid dissotsieeruvad ja moodutavad E1 tiameerid, on aktiivseks fusion -valguks. Membraani liitumise tulemusena vabaneb viiruse kapsiid tsütoplasmasse.
  
• Tsütoplasmas toimub nukleokapsiidi lahtiharutamine raku ribosoomide poolt. Selle tulemusena vabaneb viiruse genoomne RNA raku tsütoplasmasse.
  

Replikaas- mittestruktuursed valgud
Polüproteiin protsessitakse valmis NS-valkudeks viiruse proteaasi poolt.

• NSP1 on metüül- ja guanülüültransferaas, mis teostab viirus-spetsiifilist cap-sünteesi. Osaleb (-) RNA sünteesi initseerimisel ja seondab replikatsiooni kompleksi rakumembraanidele.
  
• NSP2 on NTPase, RNA helikaas, RNA- trifosfotaas ja tsüsteiin-proteaas. Reguleerib viiruse replikatsiooni ning osaleb nakatatud rakkudes raku spetsiifilise transkriptsiooni ja translatsiooni mahasurumises.
  
• NSP3 osaleb viiruse replikaasi komplekside moodustamises ning NS polüproteiini protsessingu reguleerimises.
  
• NSP4 on alfaviiruste RdRp, sisaldab polümeraaset motiivi GDD. Rakus on NSP4 suhteliselt ebastabiilne ja suur osa temast lagundatakse ubiquitiin-proteosoom mehhanismi vahendusel.
  

Alfaviiruste RNA replikatsioon

• Replikatsiooni cis-järjestused (polümeraasi seondumise kohad) paiknevad genoomi otstes.
  
• Replikatsioon on reguleeritud NS polüproteiini protsessingu kaudu.
  

Replikatsiooniga kaasneb spetsiifiliste vakuoolide (modifitseeritud endo - ja lüsosoomid) moodustumine rakus. Need vakuoolid on viiruse RNA replikatsiooni kohtadeks ja sisaldavad membraanseid struktuure, mida nimetatakse sfääruliteks ja milles lokaliseeruvad alfaviiruse NS valgud ning toimub viiruse RNA süntees.

• Varajane replikatsioon, (-) RNA ahelate süntees, toimub 0,5-3,5 tundi peale infektsiooni ja sõltub pidevast valgusünteesist. Vaba proteaasi (nsP2) kontsentratsioon rakus on sel ajal veel madal (polüproteiin on sel ajal veel stabiiline). Varajase replikaasina funktsioneerib kompleks , mis koosneb polüproteiinist P123 ja nsP4 valgust.
  
• Hiline replikatsioon ei ole sõltuv pidevast valgusünteesist ja toimub juba valminud sfäärulites. Hiline replikaas kujutab endast täielikult protsessitud nsP1, 2, 3 ja 4 stabiilset kompleksi ning sünteesib nii genoomseid kui subgenoomseid (+)RNA ahelaid.
  

Struktuursed valgud

• sgRNA-lt 3h pärast nakatumist
  
• polüproteiini alguses paikneb tugev translatsiooniline enhanser, mis võimendab struktuurse polüproteiini translatsiooni ligi kümme korda. Enhanseri toime põhineb viirus-indutseeritud translatsioonilise bloki kompenseerimises.
  
• C: kattevalk (kapsiidivalk)
  
• P62 – E3+E2 = viimane etapp.
  
• RNA pakkimissignaal- asub RNA ns-valke kodeerivas alas.
  

Kollatõve E viirus (HEV)

• HEV-il on membraanideta ikosaeedrilised virionid ja positiivse polaarsusega RNA genoom. Molekulaarsete funktsioonide ja kodeeritud valkude homoloogiate järgi kuulub HEV virus alfa-sarnaste viiruste hulka.
  
• ORF3 kodeerib fosfoproteiini, mis seondub raku tsütoskeletiga ja mõjutab signaalülekande radade kaudu peremeesraku geeniekspressiooni.
  
• Organismis (inimene, primaadid) replitseerub HEV maksakoes. Praegusel ajal puuduv HEV replikatsiooni uurimiseks sobiv rakukultuur (replitseerub ainult ahvide primaarsetes hepatotsüütides).
  

Tobamoviirused- tubaka mosaiigiviirus (TMV)
Alfa-sarnaste taimeviiruste ühised jooned on:

• Genoomide 5’-otstes asub cap-struktuur, mis sünteesitakse viiruse ensüümide poolt.
  
• Vähemalt osade geenide ekspresiooniks kasutatakse sgRNA-sid, mis sünteesitakse kasutades subgenoomset promootorit, negatiivse RNA maatritsil.
  

TMV virion

• TMV virionid kujtavad endast jäika kepikese laadset struktuuri, mis on rakuvälises keskkonnas väga stabiilne.
  
• TMV partikkel koosneb ühest molekulist genoomsest RNA-st ja ca 2100 identsest kattevalgu subühikust.
  
• Üks kattevalgu molekul seob 3 nukleotiidi RNA-st, spiraali pöörde peale tuleb 49 nukleotiidi ja 16 1/3 kattevalgu molekuli
  
• Spiraali maksimaalne raadius on 9nm, RNA fosfaadid asuvad 4nm kaugusel spiraali teljest.
  

TMV infektsioonitsükkel rakus

• TMV ei oma vektorit ja tungib rakku vigastuste kaudu raku seinas.
  
• Madal Ca2+ ioonide kontsentratsioon rakus mõjutab TMV kattevalgu struktuuri ja toob kaasa mõnede CP subühikute eemaldumise TMV genoomi 5’- otsa katvast virioni otsast.
  
• Järgeb partikkli kotranslatsiooniline lahtiharutamine ribosoomide poolt.
  
• TMV replikatsioonikompleksid asuvad ER membraanidel
  
• Võrreldes enamiku taimeviirustega on TMV infektsioon väga kiire:
  

• Nakatatud lehes 6 – 96 tundi;
  
• Süsteemne infektsioon on detekteeritav 5 – 7 päeva pärast nakatumist.
  

TMV akumuleerub nakatatud taimes väga kõrges kontsentratsioonis (kuni 10% raku kuivainest) kuid ei tapa reegline nakatunud rakke.
TMV genoomi mittekodeerivad alad
TMV genoom on 6395 nukleotiidi pikk ja sisaldab:

• 5’- mittetransleeritav liider (Ω-liider): on 70 b mittetransleeritav ala, mida iseloomustab G- jääkide puudumine. Ω-liider ei oma sekundaarstruktuuri ja toimib translatsioonilise enhanserina (“cap”). Ω-liider osaleb ka TMV genoomi replikatsioonis.
  
• Subgenoomsed promooterid asuvad sgRNA-de transpkriptsioonisaitidest ülapool.
  
  • MP sgRNa sünteesitakse infektsioonifaasis ja suhteliselt vähesel hulgal.
    
  • CP sgRNA sünteesitakse hiljem ja ta on väga mažoorne.
    
• IRES- elemendid (võivad erinevatel tobamoviirustel asuda MP ja /või CP geeni ees) ning võimaldavad vastavate valkude transaltsiooni otse genoomselt RNA-lt.
  
• Genoomi 3’ ots moodustab tRNA like struktuuri. Viiruse seisukohalt on tRNA-like struktuur negatiivse RNA ahela sünteesil promootoriks ja arvatavasti ka kaitseks raku ribonukleaaside vastu.
  

TMV genoomi kodeerivad alad
ORF1- 126 kDa valk, TMV replikaasi subühik, seondub infitseeritud rakkudes membraaniga. Osaleb viiruse genoomse ja sgRNA-de cap-imisel ja sisaldab RNA-helikaasset domeeni.
ORF2- 183 kDa valk, TMV replikaasi katalüütiline subühik. Translatsioon toimub UAG terminaatorkoodoni mahasurumise teel (“read-through” strateegia). Mahasurumise efektiivsus on ca 5-10%.
MP, movement protein, sünteesitakse sgRNA-lt: hüdrofoobne, seondub membraanide ja rakuseintega ning on TMV transpordivalguks:

• MP seondub kooperatiivselt viiruse RNA-ga ja moodustab transpordikomplekse;
  
• MP seondub ka plasmodesmidega (ülipeened tsütoplasmaniidi mis seovad rakke omavahel) ja laiendab neid.
  
• MP seondub ka mikrotorukeste ja aktiinfilamentidega
  

CP, coat protein, viiruse kattevalk. Ekspresseeritakse sgRNA-lt, moodustab RNA-ga viiruse partikleid, osaleb viiruse kaugtranspordis taime juhtkudede kaudu.
TMV pakkimissignaal ja virionide moodustumine
CP moodustab lahuses topelt diske (34-st CP subühikust). Topelt- diske esineb kas avatud või suletud kujul. Partikli moodustumine algab alati kindlasti kohast viiruse nukleotiidi järjestuses/ struktuurist, mile nimetus on “ origin of assembly”, mis asub 900 – 1300 nukleotiidi kaugusel viiruse genoomi 3’ otsast. TMV kattevalk on võimaline katma ainult selliseid RNA-sid , milles esineb “origin of assembly” struktuur.

• “origin of assembly” interakteerub topelt- diskiga, mis läheb üle “avatud vormi”.
  
• Partikli pikenemine 5’ suunas toimub topelt- diskide lisandumise teel.
  
• Partikli pikenemine 3’ suunas on tunduvalt aeglasem ja toimub arvatavasti kattevalgu mono-, tri- ja pentameride liitumise teel.
  

Negatiivse polaarsusega RNA viirused
NB!

• Negatiivse polaarsusega RNA on mRNA suhtes komplementaarse (antisense) polaarsusega.
  
• Negatiivne RNA ei ole translatsiooniline matriits.
  
• Negatiivse polaarsusega RNA viiruste esimeseks biosünteesiks rakus on alati transkriptsioon.
  
• Negatiivse RNA genoomiga viirused kannavad virionis alati kaasas RNA transkriptsiooni ensüüme.
  
• Nende viiruste genoomne RNA on alati pakitud ribonukleokapsiidi ja ei ole kunagi palja RNA kujul.
  
• Negatiivse polaarsusega RNA viiruste transkriptsiooni produktid- mRNA-d on paljad RNA-d , replikatsiooniproduktid pakitakse nukleokapsiidi juba sünteesi käigus.
  

Selts Mononegavirales
Jaguneb nelja sugukonda:

• Rhabdoviridae
  
• Paramyxoviridae
  
• Filoviridae
  
• Bornaviridae (ainukesed mis replitseeruvad tuumas)
  

Rhabdoviiruste virionid on “kuuli” kujulised ja koosnevad kahest peamisest struktuurist:

• Nukleokapsiidi: Spiraalne RNP (ribonukleoproteiin) moodustab virionis “superheeliksi” ja koosneb genoomsest RNA-st ja temaga seondunud polümeraas-kompleksist. Viimase moodustavad RNAd ümbritsev nukleokapsiidivalk (N-valk), L-valk (RdRp) ja P-valk (fosfoproteiin).
  
• Ümbris koosneb plasmamembraanist pärinevatest lipiididest ja VSV valkudest:
  
  • G-valk (transmembraane glükoproteiin) moodustab umbes 400 trimeerset “oga”
    
  • M-valk (perifeerne maatriksvalk) stabiliseerib G-valgu trimeere ja organiseerib RNP pakkimise superheeliksisse. Osa M- valgust asub ka RNP superspiraali siseküljel.
    

VSV infektsioonitsükkel
VSV replitseerub nakatatud rakkude tsütoplasmas. Infektsioonitsükkel kestab ca 12h ja lõpeb raku surmaga.
Replikatsioon ja transkriptsioon on teineteisest täiesti erinevad protsessid:

• Transkriptsioon on genoomsel (negatiivsel) RNP maatritsil mRNA-de (vaba RNA molekul) süntees.
  
• Replikatsioon on genoomsel RNP-l (vRNA) täieliku antigenoomse RNP (cRNA) süntees ja sellel omakorda genoomse RNP (vRNA) süntees.
  

Antigenoomne cRNA ehkki on positiivse polaarsusega , ei ole kunagi translatsiooniliseks matriitsiks ja on alati pakitud nukleokapsiidi.
VSV genoomi transkriptsioon

• Transkriptsioon algab enamasti genoomi 3’- otsas. Esimesena kopeeritakse 47 b pikkune liiderjärjestus, mille sünteesi järel transkriptsioon katkeb ja liider RNA vabaneb ja liigub rakutuuma. Peale liider- RNA järjestuse kopeerimist ja terminatsiooni leiab transkriptsioonis asset paus.
  
• Initseerimine N-geenil võib toimuda nii peale liider- RNA sünteesi kui ka otse. N- geeni initseerimine on ainus mis võib toimuda vahetult, kõik ülejäänud initseerimised nõuavad eelneva transkripti sünteesi termineerimist.
  
• Sellist transkriptsioonipilti seletavat mudelit nimetatakse reinitsiatsiooni mudeliks (stop and start mudel). (U)7 järjestus geenide ahelas toimib nii poly (A)- signaali ja terminaatorina kui ka transkriptsiooni re-initsieerimisel olulise järjestusena.
  

Replikatsioon
Viirus- spetsiifiliste valkude kogunemine initseerib ümberlülitamise transkriptsioonilt replikatsioonile. Selle tõttu sõltub VSV replikatsioon aktiivsest ja kestvast viirus-spetsiifilisest valgusünteesist (eriti N- ja P valkude süntees).
Replikatsiooni käigus ignoreerib RdRp liider- RNA-le järgnevaid ja geenide vahelisi “stop-signaale”.
Kahe polümeraasi mudel:

• Transkriptsiooni teostab polümeraas, kuhu kuulub L- valk ja N-terminusest fosolüreeritud P-valgu tetrameer (L-P4 polümeraas).
  
• Replikatsiooni teostab L-valgust ja uuesti sünteesitud N- ja P- valkudes koosnev L-N-P4 polümeraas, milles P- valk on veel N-terminusest fosfolüreerimata kuid on fosfolüreeritud C- terminusest.
  

Sugukond Paramyxoviridae
Genoom on segmenteerimata (-)ssRNA; virionides RNP-na.
Virion

• Sfäärilised ja ümbrisega virionid
  
• Membraani all paiknevad maatriks-valgud ja ribonukleokapsiid ning membraani sees on viiruse glükoproteiin.
  
• Membraan pärineb rakatunud raku plasmamembraanist
  
• Kõigil Paramyxoviirustel on olema:
  
  • HN (hemaglutiniin-neuraminidaas)
    
  • F (fusion valk) mis põhjustab pH-st sõltumatut viiruse ja raku membraanide liitumist.
    
• Nukleokapsiid on spiaraalse konformatsiooniga ning koosneb genoomsest RNA-st ja kolmest valgust: N- valk, L-valk ja P- valgust. Nukleokapsiid on oma struktuurilt stabiilne, kuid transkriptsiooniliselt aktiivne.
  

Genoom

• 15- 19 kb
  
• Genoomse 3’- otsas asub mittekodeeriv liider- järjestus (50b) ja 5’- otsas asub trailer- järjestus.
  
• Genoomis on olenevalt viirusest 6 – 10 geeni.
  

Valgud

• Nukleokapsiidi valk (N- valk)
  
• L-valk. Redakteerimise protsess.
  
• M- valk
  
• P- geenis suur hulk geneetilist infot- samalt geenilt sünteesitakse erinevaid valke kasutades 5’- otsas asuvaid kattuvaid lugemisraame (“leaky scanning”) ja RNA redakteerimist, mille käigus lisatakse täiendavaid G-jääke sünteesitavasse mRNA-sse.
  
• P- fosfoproteiin on P-geeni ainus product, mis on otseselt vajalik viiruse RNA replikatsiooniks.
  
• V-valk on vajalik immuunsüsteemi mahasurumiseks.
  
• C- ja C’- valgud reguleerivad mRNA sünteesi,
  

Redakteerimine toimub kotranskriptsiooniliselt ja selle mehhanism on sarnane poly(A) sünteesi mehhanismiga: toimub polümeraasi libisemine spetsiifilisele järjestusele, mille tulemusena ühte C-jääki kopeeritakse mitu korda (oluline on see, et sünteesitavasse mRNA-sse lisatav G-jääk paardub nii U- kui C- jääkidega).
Membraanvalgud

• Antiretseptor valgul on erinev nimi vastavalt viirusele:
  
  • HN valk seondab neuramiinhaper ja on respiro- ja rubulaviirustel aktiivne ensüüm (eemaldab raku pinnalt siaalhappe ja väldib punguvate virionide taaskleepumist nakatatud rakule)
    
  • H- valk on HN-valguga homoloogne kuid ei oma neuraminidaasset aktiivsust.
    
  • G-valk
    
• Fusion valgu (F-valk) peamine funktsioon on viiruse ja raku membraanide liitumine. F-valk iseenesest on väheaktiivne ja selle aktiveerimine on seotud HN- ja F- valkude omavahelise interaktsiooniga peale HN- valgu ja raku retseptori interakteerumist.
  

Sugukond Bunyaviridae
Sugukonda Bunyaviridae kuuluvaid viiruseid iseloomustab:

• Kolmest negatiivse või ambisense polaarsusega RNA segmendist koosnev genoom.
  
• Tsütoplasmas toimuv replikatsioon ja virionide valmimine Golgikompleksil.
  

Enamus bunyaviiruseid omab lüilijalgseid vektoreid ja on inimesele suhteliselt vähepatogeensed. Samas leidub ka ohtlikke.
Genoomi kodeerivad alad
Erinevate bunyaviiruste genoomide organisatsioonis ja ekspressiooni strateegiates leidub nii sarnaseid kui ka erinevaid jooni:

• Ambisense strateegia phlebo- ja tospoviirustel
  
• Segmentide erinevad mõõtmed ning kodeeritud valkude arv.
  

Ambisense segmendiks nimetatakse sellist RNA-d mille osa sisaldab lugemisraami (positiivne osa) samal ajal kui teisele osale (negatiivsele osale) vastav lugemisraam asub komplementaarses orientatsioonis.
Ambisense segmentides erineva polaarsusega lugemisraamid ei kattu.
Ambisense segmendi poolt kodeeritavad valgud ekspresseeruvad eranditult mRNA-de kaudu, st segmendi positiivse polaarsusega osa ei ole mitte kunagi translatsiooniliseks maatriksiks.
Perekonna Tospoviruse esindajate M segment (4,8 kb) erineb ülejäänud perekondade M- segmentidest selle poolest, et ta omab ambisense orientatsiooni ja kodeerib:

• Negatiivses orientatsioonis Gn ja Gc polüproteiini
  
• Positiivses orientatsioonis mittestruktuurset valku NSm
  

dsRNA genoomiga viirused
Sugukond Totiviridae: L- A viirus
Sugukonda Totiviridae kuuluvaid viiruseid iseloomustab ühekompetentne dsRNA genoom pikkusega 4,6kbp, sagely on totiviirustel ka sateliit- RNA-sid. Tüüp esindajaks on L-A viirus.
L-A viirust kandvad pärmid sekreteerivad viiruse sateliidi poolt kodeeritud valgulist toksiini, mis tapab viirust mittekandvaid pärme. Kuna on palju erinevad sateliit- RNA-sid siis on ka palju erinevaid toksiine.
L-A virion omab T=1 sümmeetriat (koosneb 60-st kattevalgu diameerist). Struktuurilt meenutab tuntud dsRNA genoomset viiruste virionide “core” struktuuri. L-A viiruse virionid sisaldavad alati ainult ühte tüüpi RNA-d (st. viiruse ja sateliidi RNA pakitakse alati eraldi kapsiididesse).
Virionis paiknevad 1- 1,5 nm diameetriga poorid, mis:

• Lasevad virioni sisse RNA sünteesi substrate
  
• Võimaldavad sünteesitud RNA –l virionist väljuda
  
• Ei lase virionist väljuda dsRNA-l
  
• Ei lase virioni sisse RNA-d degradeeruvaid ensüüme.
  

L-A viiruse genoomi organisatsioon

• L-A viiruse genoom on dsRNA (mõlemal ahelal puuduvad cap ja poly(A) järjestused) mille positiivses ahelas asub kaks teineteisega kattuvat lugemisraami. Need kodeerivad vastavlt:
  
  • Peamist kattevalku (tavaliselt nimetatakse seda gag- valguks, 76 kDa
    
  • Polümeraasi (pol. 100 kDa domeen). See ekspresseerub ribosomaalse -1 raaminihke abil fusion valgu gag-pol kujul (pol moodustab fusion-valgu C-terninaalse domeeni). L-A viiruse pol kujutab endast tüüpilist RdRp-d, milles asuvad lisaks polümeraasi konsensusele, ka kolm ssRNA-d seondavad domeeni.
    

L-A viiruse satelliit RNA organisatsioon
Iga M-saidi genoom kodeerib oma positiivse ahela 5’- poolses otsas pre-protoksiin valku. Satelliitide 3’- otsa poolne järjestus valke ei kodeeri kuid sisaldab olulisi cis-järjestusi (vajalikud pakkimiseks ja replikatsiooniks). Neid kahte osa eraldab sageli varieeruva pikkusega poy(A) järjestus.
L-A viiruse ja tema satelliidi replikatsioonitsükkel
Nii viirus kui tema satelliit replitseeruvad sarnaselt:

• Virionides toimub uute positiivsete mRNA-de süntees. Sünteesitud mRNA-d väljuvad virionist
  
• Sünteesitud RNA-d transleeritakse, sünteesitakse gag- ja gag-pol valgud
  
• Gag, gag-pol ja positiivne RNA moodustavad uue partikli
  
• Uutes partiklites leiab aset negatiivse ahela süntees.
  

Satelliitide replikatsioon erineb L-A viiruse replikatsioonst ainult selle poolest, et moodustuvasse uude kapsiidi pakitakse ainult üks positiivne M RNA , mis replitseerub kapsiidis mitu korda (seni kuni kapsiid on täis). Seetõttu nimetatakse seda skeemi “head- full replication”.
L- A viiruse geenide ekspressioon
Translatsiooni iseloomustavad mitmed ebatraditsioonilised võtted:

• Ribosomaalne raaminihe, mRNA-s asuvad gag ja pol lugemisraamid kattuvad ca 130 b võrra ja selles regioonis võib aset leida – 1 lugemisraami nihe. Raaminihke effektiivsus on umbes 2% ja see on geneetiliselt määratud- kui seda kunstlikult suurendada või vähendada toob see endaga kaasa replikatsioonitsükkli häirumise.
  
• Kui gag pol-liitvalku on liiga palju, alustatakse korraga liiga suure hulga partiklite kokkupanemist ja nende kokkupanemise lõpuleviimiseks ei jätku piisavalt gag- valku- tulemuseks on poolikud virionid.
  
• Gag- decapping aktiivsus. L-A viiruse gag- valgud moodustavad in-vitro kovalentseid sidemeid suvaliste capeeritud mRNA-dega. On näidatud , et raku mRNA-de dekapeerimine kujutab endast mehhanismi, millega viirus väldib omaendma mitte capeeritud mRNA-de degradeerimist raku ensüümide poolt. Mehhanism ise seisneb selles, et viirus tekitab hulgaliselt mittekapeeritud raku mRNA-sid , mille hulka viirus-spetsiifiline mRNA “ära kaob”.
  

L-A replikatsioon =negatiivse RNa-de süntees
Nagu ka teistel dsRNA viirustel , toimub L-A genoomi replikatsioon ainult moodustunud kapsiidides- rakust on vajalikud ainult substraadid (NTP-d).
Replikatsiooni teostav RdRp on väga spetsiifline- see replitseerib ainult L-A ja tema satelliit- RNA-sid. Selleks on vajalikud kaks RNA-s paiknevat järjestust:

• RNA 3’- terminaalne järjestus. See järjestus sisaldab replikatsiooniks vajaliku stem-loop struktuuri. Olulised on ka viimased 6 nukleotiidi.
  
• RNA sisemine järjestus, nn internal replication enhancer. See on tõenäoliselt esimene sait , millega RNA polümeraas seondub (seepärast asub ta pakkimissignaali läheduses ja kattub sellega osaliselt).
  

Reoviiruse infektsioonitsükkel
NB! Kõikidel dsRNA viirustel:

• Kogu reoviiruse infektsioonitsükkel toimub tsütoplasmas.
  
• dsRNA vabanemist ei toimu kunagi, ta on alati core osakeses.
  
• Esimeseks viirus- spetsiifiliseks sünteesiks rakus on alati transkriptsioon.
  
• Kõik RNA sünteesid toimuvad “core” osakeses.
  
• Transkriptsiooniks nimetatakse dsRNA-l positiivse polaarsusega RNA sünteesi. See RNA väljub core osakesest.
  
• Replikatsiooniks nimetatakse positiivsel RNA-l negatiivse ahela sünteesi (dsRNA moodustumine).
  
• Replikatsioonile eelneb alati positiivse ssRNA segmentide selektsioon ja pakkimine.
  
• Peale transkriptsiooni toimub sekundaarne transkriptsioon.
  

Rakule seondumine ja rakku sisenemine
Reoviiruse antiretseptor (∂1 valk) võib seondada põhimõtteliselt iga makromolekuli, milles on olemas siaalhappe grupid. Reaalsed retseptorid võivad olla erinevatel rakkudel erinevad: üheks selliseks on junction adhesion molecule 1 (JAM 1). Reoviiruse seondumine võib olla kaheetapiline:

• Esmalt toimub reoviiruse antiretseptori seondumine siaalhappe jäägile
  
• Järgneb seondumine spetsiifiliste valk-valk interaktsioonide kaudu (selles osaleb antiretseptori “pea” struktuur).
  

Reoviiruse sisenemine rakku toimub clathrin-ist sõltuva retseptor- vahendatud endotsütoosi teel. Viirus sattub moodustatavastesse endo- ja lüsosoomidesse, milles toimub pH- taseme langus.
Reoviiruse genoomi plastilisus
Uute omadustega reoviiruse genoomid moodustavad:

• RNA polümeraasi poolt tehtavate kopeerimisvigade tulemusena.
  
• Väga oluliseks mehhanismiks on segmentide ümbersorteerimine.
  
• RNA süntees partiklites vähenab oluliselt genoomide vahelise RNA- rekombinatsiooni toimumist reoviiruse replikatsiooni- protsessis, seega vähendab plastilisust.
  

Rotaviirused
Rotaviiruste virion meenutab pealtvaates ratast ja pseudo T=13 sümmeetriat ning koosneb kuuest struktuurvalgust, mis moodustavad kolmekihilise kapsiidi.
Rotaviiruse genoomis on 11dsRNA segmenti , kokku on genoomi mõõtmed ca 18,5 kb. Segmentide organisatsioon sarnaneb reoviiruse genoomi segmentidele. Kogu perekonnas on konserveerunud segmentide terminaalsed järjestused: 5’- UGU…GACC- 3’.

• Virioni lahtipakkimine on otseselt seotud transkriptsiooniga: kui on kaks kahti, siis virion on juba tsütoplasmas ja seal polümeraas on aktiivne ja transkribeeritakse (+)RNA, mis väljub virionist.
  
• Tsütoplasmas toimub translatsioon: (+)RNA =mRNA
  
• Või/ja +RNA interakteerub VP2 ja VP1-VP3-ga. VP2 moodustab sisemise kihi ja aktiveerib VP1 ja polümeraas sünteesib –RNA ahela. See tähendab, et replikatsioon ja virioni kokkupakkimine on otseselt seotud. Replikatsioon toimub virioplasmas ehk inklusioonkehades, kus tekib võrgustik virraalsete RNA-de ja kapsiidide kokkupanekuks.
  

Rotaviiruse NSP3 inhibeerib rakus translatsiooni

• NSP3 toimib sarnaselt raku poly(A)-d siduvale valgule (PABP) ja on oluline rotaviiruse mRNA translatsiooniks.
  
• NSP3 seob üheltpoolt viiruse RNA 3’- ostsi ja teiseltpoolt transkriptsioonifaktorit eIF- 4G.
  
• Tänu rotaviiruse mRNA 5’ ja 3’ otste omavahelisele interaktsioonidele aktiveerib NSP3 poone eIF- 4G sidumine viiruse mRNA-de translatsiooni
  
• Samal ajal surub NSP3 maha peremehe RNA-de translatsiooni
  

Sugukond Partitiviridae
Taimede ja seente viirused.
Virion T=1.
Genoom koosneb kahest dsRNA segmendist pikkustega 1,4- 2,4 kb, mis pakitud eraldi virionidesse.
mRNA-d on monotsistroonsed. Kodeerivad vastavalt kattevalku ja replikaasi.
Sugkond Endornaviridae
Taimede ja seente ja vetikate. Ei moodusta virione.
Genoomiks on üks dsRNA fragment 14-17,6 kb, mille kodeerivad pluss ahelas on 5’ otsast 1,2 – 2,7 kb kaugusel spetsiifiline ahela katkestus (nick). Genoom kodeerib ühte pikka polüproteiini. Replikatsioon toimub tsütoplasmaatilistes vesiikulites.