Geenitehnoloogia (GMO) (0)

Geenitehnoloogia – kas lihtsalt uus sordiaretus ?
Geneetiliselt muundatud organism ehk GMO on elusolend ( bakter , taim, loom), kelle pärilikkuse ainet (DNA-d) on geenitehnoloogilisi võtteid kasutades  kunstlikult muudetud.
Võrreldes tavapäraste sordi- ja tõuaretusmeetoditega on geneetilise muundamise suureks erinevuseks võimalus kombineerida väga kaugete liikide geene (nt. siirdada geene kalalt tomatitaimele) või sisestada organismi tehisgeene. Muundamisel on tegu looduse poolt seatud liigipiiride ületamisega.
Geenitehnoloogia on tänapäevane uus tehnoloogiavaldkond, mille eesmärk on geneetilise info kasutamine rakenduslikel eesmärkidel.
geenitehnoloogia – molekulaargeneetika haru, rakkude ja organismide geneetilise informatsiooni muutmine DNA molekuli osade siirdamisega.
Geenitehnoloogia eesmärgiks on geneetilise informatsiooni kasutamine kõige erinevamatel rakenduslikel eesmärkidel – põllumajanduses, toiduainete tootmises, inimeste ja loomade mitmete omaduste muutmises ning haiguste diagnoosimises ja ravis .
Geeniteraapia
Uu(t)e geeni(de) viimine inimesesse eesmärgiga ravida teatud haigusi, eelkõige pärilikke haigusi ja vähki.
Praeguseks on teada umbes 10 000 geeni, milles esinevad defektid võivad põhjustada organismis haigusliku protsessi. Kaardistades iga üksiku inimese geenid , saab teada tema geneetilise eelsoodumuse haigestuda ühte või teise haigusesse.
Transgeensete organismide loomine
Paljude bakterite, taimede ja loomade pärilikkust on muudetud sellega, et neisse on viidud teiste organismide geene.
Geenitehnoloogia abil on juba praeguseks konstrueeritud suur hulk uute omadustega baktereid., taimi ja loomi, kes toodavad bioloogiliselt aktiivseid aineid: mitmesuguseid raviühendeid, nagu näiteks kasvufaktoreid, verehüübimisfaktoreid, peptiidseid ravimeid, antikehi jms.
Praegu püütakse konstrueerida loomi, kes kannaksid inimese koesobivusantigeene. Selliste loomade organeid, näiteks maksa, neeru ja südant, oleks võimalik siirata inimese organismi, ilma et viimane neid koesobimatuse tõttu ära tõukaks.
Transgeensed loomad on väga tähtsad inimeste molekulaargeneetika uurimisel .
Geenitehnoloogiat kasutatakse ka uute omadustega taimede loomiseks. Eesmärk on konstrueerida taimi, mis oleksid külma- ja põuakindlad ning mille viljad küpseksid kiiresti, üheaegselt ja oleksid maitsvad , aga samas säiliksid kaua. Samuti töötatakse selle kallal, et saada lamandumiskindlaid ja viirus- ning seenhaiguste suhtes vastupidavaid leivavilja sorte. Klassikalise sordiaretusmeetoditega kuluks selleks aastakümneid.
GMO-d ehk geneetiliselt muundatud organismid on elusolendid, sh. taimed ja ka nendest saadud tooted, nt. loomasööt, kelle pärilikkuse ainele ( geenidele ) on biotehnoloogiliste meetodite abil kunstlikult lisatud teiste elusolendite pärilikkuse ainet või kelle pärilikkuse ainet on muul viisil nüüdisaegse geenitehnoloogia abil muudetud.
Geneetiliselt muundatud toiduks nimetatakse toitu või toiduaineid, mille valmistamisel on kasutatud geneetiliselt muundatud organisme (GMO-sid). Euroopas kasutatakse ning müüakse geneetiliselt muundatud sojauba ja maisi. Nende mõju inimese tervisele on palju uuritud, kuid kahjulikku toimet pole tõestatud.
Geneetilise muundamise puhul on põhimõtteliselt tegu sordiaretusega, kuid see on oluliselt kiirem ja tõhusam viis soovitud tulemuseni jõudmiseks.
Geneetiliselt muundatud toiduainete eelised ja probleemid
Eelised
Probleemid
· Suurem saagikus leevendab inimkonna toiduprobleeme.
· Kultuurtaimede suurem elu-jõulisus ja haiguskindlus.
· Keskkonna saastatuse vähendamine, kasvatatakse kahjuritele mürgiseks muudetud transgeenseid kultuure.
· Eetikaprobleemid – igale organismile jäägu oma normaalne genoom .
· Võib olla kahjulik inimese organismile. Mõni allergiat põhjustav valk võib sattuda toitu, kus teda normaalselt ei leidu.
· Võimalik negatiivne mõju keskkonnale. Kahjurid muutuvad looduslike toimainete suhtes immuunseks
· Põllukultuuridesse kantud muundatud geenid võivad üle kanduda umbrohule, muutes need samuti elujõulisemaks
Kloonimine
Identse genoomiga organismi loomine (reproduktiivne kloonimine)
· Võetakse tüvirakk, mis on võimeline määramatult paljunema.
· Rakust eemaldatakse geneetilist informatsiooni.
· Munarakust eemaldatakse rakutuum ja asemele siirdatakse tüviraku tuum.
· Soodustatakse munaraku jagunemist ja kasvamist.
· Saadud embrüo siirdatakse emaslooma emakasse.
·Arenev organism sünnib tüviraku andja identse koopiana.
Tüvirakkudest samasuguse DNA-nukleotiidjärjestusega rakkude saamine ( ravikloonimine )
Tüvirakud võivad areneda peaaegu igat tüüpi koe rakkudeks. Tüvirakke saadakse mõne päeva vanusest embrüost
· Eraldatakse tüvirakud ja kultiveeritakse (kasvatatakse ja paljundatakse) laboratooriumis.
· Ravimiseks siirdatakse tüvirakke otse haigesse koesse, kus nad muunduvad vastava koe rakkudeks ning asendavad kahjustatud rakke.
Alternatiivina võib tüvirakkudest vajalikud rakud kasvatada ka laboris enne nende organismi siirdamist.
Geneetiliselt muundatud organism ehk GMO on organism, kuhu geenitehnoloogilisi võtteid
kasutades (nn rekombinantse DNA tehnoloogia abil) on stabiilselt genoomi viidud
mingid võõrad, selle organismi geenikogumis muidu mitteesinevad geenid, geenifragmendid
või muud DNA lõigud. Oluline on see, et võõr-DNA peab olema stabiilne – see
tähendab, et ta peab loodud GMO kõigis rakkudes püsima stabiilselt vähemalt mitme
põlvkonna vältel. Vastasel juhul pole tegu GMOga.
Teiseks tuleb rõhutada, et GMOsid luuakse geenitehnoloogia abil. Võõrastest liikidest
pärit DNAd võib organismidesse viia ka ristamise, rakkude fuseerimise ( liitmise ) või
viiruste abil, kuid vastavalt GMOsid puudutavale seadusandlusele ei ole sellised liigid
(näiteks kõik traditsioonilised kultuurtaimed ning kariloomad) GMOd .
Viimaks tuleb märkida ka seda, et GMO genoomid erinevad oma tavaeellastest tegelikult
väga vähe. Nimelt on igas rakutuumaga organismis umbes 10 000 - 50 000 geeni. Geenide
vahele jäävad lisaks nn mittekodeerivad regioonid , mis osas liikides moodustavad 99%
kogu organismi genoomist. Kui nüüd viia kirjeldatud organismi veel üks geen, erineb
selle GMO genoom eellase omast 0,00002%. Vaatamata sellele, et organismi geenide
kogum on peaaegu samasugune kui vanemliinis, võib uue organismi talitlemine olla paljuski
erinev.
Geneetiliselt muundatud bakterite kõrval kasutatakse hetkel majandustegevuses eelkõige
geneetiliselt muundatud taimi. Sellist GM kultuurtaime võib luua mitmel erineval meetodil.
Esiteks kasutatakse n-ö looduslikku teed. Nimelt suudab mullas elav agrobakter ühe osa
oma DNAst täiesti normaalse loodusliku protsessi käigus viia taimerakku ja sisestada seal
taimegenoomi. Asendades nüüd agrobakteris looduses paiknevad geenid meie poolt
soovitutega, saamegi tolle bakteri abil võõr-DNA stabiilselt taimerakkudesse viia.
Teine laialt kasutatav meetod ekspluateerib aparaati , mida eesti keeles võiks nimetada
DNA püssiks. Selle abil on võimalik (taime)rakku “tulistada” imepisikesi kullaosakesi,
mille külge on eelnevalt seotud DNA. Raku sees tuleb DNA kullapartikli küljest lahti,
siseneb rakutuuma ja lülitub seal rekombinatsiooni teel genoomi.
Mõlema meetodi puhul tuleb pärast DNA rakku viimist muundatud üksikust rakust kasvatada
terve uus taim, sest ainult sellisel juhul saame me tõelise GMO.
Üksikust rakust uue taime regeneratsioonil kasutatakse koekultuuri meetodeid , mida tuntakse
põhimõtteliselt juba üle poole sajandi. Sarnase metoodikaga on kasvatatud näiteks
laialt tuntud meristeemmaasikad, koekultuuri etapi on läbinud suur osa Eestis kasvatatavate
seemnekartulite eellasi.
Geenitehnoloogia on üpriski moodne, ent siiski mitte suisa eilse päeva saavutus. Esimene
GM bakter loodi Kalifornias 1971 . aastal, esimesed GM taimed tehti Belgias ja Missouris
1983. aastal
GMOde kasutamine
Ehkki GMOde kasutamise ajalugu pole kuigi pikk, on maailmas juba mitmeid GMOsid
kasutusele lubatud. Euroopa Liidus kasvatatakse või kasutatakse tööstuslikult paarikümmend
nimetust GMOsid. Esimestena tulid turule GM vaktsiinid (1992-1994), neile järgnes
herbitsiidikindel tubakas aastal 1994 ning 1996-1997 aastal riburada mitmed rapsiliinid,
soja-, siguri -, maisliinid ja mitmed geneetiliselt muundatud lillesordid.
Ka mujal maailmas (peamiselt USAs, Kanadas, Jaapanis , Austraalias jm) on kasutusel veel
mõned muud GMOd, näiteks puuvill, melon , papaia, kartul , suhkrupeet jm.
Enne GMO kasutuselevõttu annab selle kohta hinnangu teaduslik komitee, kes vaagib
kõiki võimalikke riske ja teeb seejärel vastavale ametiasutusele ettepaneku kas loa andmiseks
või sellest keeldumiseks. Eestis hindab paljunemisvõimeliste GMOde ohutust
Geenitehnoloogiakomisjon ning lube annab keskkonnaminister, GM toidu ja loomasööda
kohta langetatakse otsus Euroopa Liidu tasandil. Lube peab uuendama iga 10 aasta järel.
Kui GMO on juba kasutusele lubatud, on tootjal kohustus seda ka hiljem jälgida – milline
on pikaajaline mõju inimestele, loomadele, keskkonnale. Niipea kui avaldub mõni oht, peatatakse
koheselt selle GMO kasutamine, kasutusluba tühistatakse ning GMO eemaldatakse
nii turult kui ka kasutuselt. Peale tootja jälgivad GMO mõju ka teadus- ning järelevalveasutused.
Et hõlbustada GMOde jälgimist pärast turustamist, saavad kõik turule lubatud GMOd
oma unikaalse koodi. See numbritest ja tähtedest koosnev kaubakood on igal GMOl
erakordne nagu inimesel nimi. Kõik GMOd peavad olema märgistatud alates tema kasvatamisest
seemnena kuni lõpptooteni välja, olgu see siis kook, jahu, õli või muu.
Kuna GMOd on väliselt tavakultuuridega sarnased ja pelgalt pealevaatamisega neid muundamata
organismidest üldjuhul eristada ei saa, on seemnekasvatajatel GMO ja tavakultuuride
kooskasvatamisel raske vältida oma sordi saastumist GMOga. Eriti raske on see tuultolmlejate
taimede puhul, kelle õietolm võib kanduda kilomeetrite kaugusele. Samas võivad
seemned ka lihtsalt mehaaniliselt seguneda. Piirkondades, kus GM taimi on kasutatud
juba palju aastaid, on 100% GMO- vabu seemneid juba raske leida. Sellest probleemist ülesaamiseks
on mõnes maades kinnitatud teatud piirnormid, millest allpool lubatakse GMO
saastust ja millest ülevalpool tuleb seeme juba märgistada kui GMOd sisaldav.
DNA KLOONIMINE I
Kloonimise puhul võib eristada kaht meetodit:
1. Rakuvaba DNA kloonimine ehk in vitro
DNA kloonimine. See on uuem meetod,
millest räägiti põhjalikult eelmises (PCRi)
loengus.
2. Rakuline DNA kloonimine ehk in vivo
kloonimine. Meetod põhineb spetsiifilise
DNA fragmendi in vitro sisestamisel
iseseisvalt replitseeruvasse DNA järjestusse.
Selline replikon viiakse sobivasse
peremeesrakku ja paljundatakse seal.
Varasemal ajal mõeldi kloonimise all just
seda meetodit.
Rakuline kloonimine koosneb neljast
põhietapist:
1. Rekombinantsete DNA molekulide
konstrueerimine in vitro
Meile huvipakkuva geeni fragment , e. insert
(võõr-DNA), sisestatakse ligeerimisel isereplitseeruva
geneetilise elemendi (replikoni),
enamasti plasmiidi või viiruse DNA genoomi
e. vektorisse.
2. Transformatsioon .
Selle tulemusel saadakse uus rekombinantne
DNA molekul , mis on võimeline sisenema
(näit. viirusena) või mida on võimalik
sisestada e. transformeerida bakteri rakku.
DNA repli-katsioon toimub seal sõltumatult
peremeesraku kromosoomi(de)st.
3. Selektiivne paljundamine.
Individuaalsete rakukolooniate (kloonide)
saamiseks külvatakse transformeeritud rakud
välja selektiivsele (agar)söötmele. Viiruse või
plasmiidi replikatsioonil tekib rohkem kui 1012
identset viiruse või plasmiidi DNA molekuli.
Sama koefitsendiga paljundatakse ka rekombinantset
DNAd.
4.Rekombinantsete DNA kloonide
eraldamine
Selektiivsöötmel kasvatatud kloonidest
eraldatakse rekombinantne DNA
Esimesena näitasid pärilikkuse funktsionaalse
ühiku ühest organismist teise ülekandmise
võimalikkust Stanley Cohen, Herbert Boyer
ja nende kaastöölised (Stanfordi ja California
Ülikoolidest) 1972 -1973. aastal.
DNA kloonimine võimaldab:
1. huvipakkuvate DNA fragmentide
piiramatus koguses paljundamist
2. geeniproduktide, enamasti valkude
tootmist
3. uurida geeni struktuuri, funktsiooni
DNA fragmentide saamine ja
ühendamine
DNA restrikteerimisel tekivad kas 5’ või 3’
üleulatuvate üheahelaliste sabade, või nn.
tömpide otstega DNA fragmendid . Oluline on
konverteerida DNA otsad ühendatavateks.
Omavahel ühendatavad on kaheahelalise DNA
tömbid ja 5’ või 3’ üheahelalised komplementaarsed
DNA otsad. Mittekomplementaarsed
üheahelalised osad tömbistatakse ehk
täidetakse (Vt. DNA märkimise loengust -
Klenowi fragmendi ja T4 polümeraasiga).
Kõigi kolme erinevat tüüpi otstega DNA
molekulide ühendamiseks kasutatakse
ligeerimist s.o. DNA fragmentide ühendamist
ligaasi abil. Ligaas katalüüsib kovalentse
sideme moodustumist 5’-fosfaat- ja 3’-
hüdroksüülrühma vahel. Enamasti kasutatakse
T4 DNA ligaasi.
Optimaalsete tingimuste korral on inserdi
kloonimisse efektiivsus keskmiselt 1:50 st.
ühel juhul siseneb insert vektorisse ja 49-l
juhul toimub lihtne vektori retsirkulariseerumine.
Vektori retsirkularisatsiooni vältimiseks /
vähendamiseks ja kloonimise efektiivsuse
tõstmiseks on mitmeid võimalusi.
1. Kasutada vektori lineariseerimiseks
restriktaase, mis annavad erinevaid
üheahelalisi otsi. Taoliselt on võimalik
defineerida ka inserdi sisestamise suunda.
2. Vektorit töödeldakse aluselise fosfataasiga,
Näit. CIP (calf intestin phosphatase). Selle
tulemusel eemaldatakse vektori 5’fosfaat
rühmad ja vektor ei religeeru iseendaga kokku.
3. Tömpide otstega DNA lõikude paremaks
sisestamiseks kasutatakse ka linkereid või
adaptereid. Linkerid ja adapterid on kaheahelalised
sünteetilised oligod, mis sisaldavad
restriktaaside poolt äratuntavaid DNA
järjestusi (restriktsiooni saite)
Esimeses ringis ligeeritakse adapterid või
linkerid, mida võetakse DNA fragmentide
suhtes suures ülehulgas, et ligeerimisel
liidetaks iga fragmendiga adapterid või
linkerid. Seejärel linkeritega varustatud DNA
restrikteeritakse, et eemaldada linkerite
ülearused osad. Edasi fragment puhastatakse ja
ligeeritakse soovitud vektorisse.