Geenitehnoloogia (2)

GEENITEHNOLOOGIA
Geenitehnoloogia – molekulaargeneetika rakendusharu, DNA- fragmentide siirdamine rakkude ja organismide geneetilise informatsiooni muutmiseks või nende kasutamine pärilike haiguste diagnoosimisel ja indiviidide geneetilisel tuvastamisel.
Geenitehnoloogia seisneb DNA valitud lõikude eraldamises, töötlemises in vitro ja siirdamises sama või muu liigi isendi geneetilisse struktuuri – kromosoomi, plasmiidi või viirusesse.
Rekombinantne DNA – DNA molekul , milles on ühendatud eri liikidelt pärit DNA- fragmendid .
Restriktaas – bakteritel esinev endonukleaaside hulka kuuluv ensüüm, mis katkestab DNA kaksikahela kindla nukleotiidijärjestuse kohalt.
Ligaas – ensüüm, mis ühendab kovalentse sidemega DNA-fragmentide ahelate otsad .
Geenides on intronid ja eksonid :

• Intron – lõigatakse
  
• Ekson – liidetakse
  

Bakterid toodavad inimese valke alates 1978. aastast :

• Esimene oli insuliin
  
• Inimese kasvuhormoon
  
• Erütropoietiin aneemia raviks
  
• Interferoon, mis reguleerib immuunsüsteemi
  
• Verehüübimisfaktorid
  
• Difeeria ja teetanuse vaktsiin
  
• Pärmseened teevad B-hepatiidi vaktsiini
  
• Putukarakud toodavad papilloomi vaktsiini
  

Transgeensed loomad
Esimene transgeenne hiir saadi 1981 aastal : roti kasvuhormooniga kasvas hiir 2 korda suuremaks .
Geenivektorite ülekandeks kasutatakse viirusi või siiratakse vajalik geen mikropipeti abil otse viljastatud munarakku.
Transgeenseid hiiri kasutatakse geneetika-, arengubioloogia - ja meditsiinilaborites ning farmaatsiafirmades katseloomadena teaduslikul otstarbel .
Transgeensete imetajate saamine on küllaltki vaevaline protseduur :

• Esiteks, keeruline on mikropipeti abil geenivektori sisestamine viljastunud munarakku seda kahjustamata. Viimasel ajal on kasutatud lihtasmat meetodit – geeni siirdamist embrüonaalsetesse tüvirakkudesse in vitro, kus õnnestunud geenisiirdega rakke saab valida ja seejärel varasesse embrüosse viia.
  
• Teiseks pole veel õnnestunud luua geenivektoreid, mis integreeruksid genoomi DNA-sse soovitaval kohal. Nii võivad nad kahjustada olemasolevaid geene.
  
• Kolmandaks, siirdatav geen peab olema varustatud koespetsiifilise promootoriga, mis tagaks geeni avaldumise õiges koes ja sobival ajal.
  
• Neljandaks, lisanduvad kaod, mis tulenevad embrüosiirdamisega seotud riskidest.
  

Õnnestunud geenisiirdega loom saadakse tavaliselt 100-200 katsetuse tulemusena.
Kõige enam on geneetiliselt muundatud : hiir, siga, lammas, lehm , kana, kala, ahv.
Transgeensed taimed
Transgeenseid taimi luuakse peamiselt põllumajanduslikel eesmärkidel.
Neli peamist taotlust :

• Parandada saaduste tarbekvaliteeti ( säilivust, ainelist koostist, välimust )
  
• Suurendada vastupidavust haigustele ja kahjurputukatele
  
• Tõsta taluvust umbrohutõrje kemikaalide suhtes
  
• Tõsta karmide keskkonnatingimuste taluvust ( külma-, kuuma-, põuataluvust vms )
  

Transgeensete taimede loomine on ühitatud meristeempaljundusega. Geenivektori ülekandeks kasutatakse tavaliselt agrobakterit. Õnnestunud geenisiirdega taimerakud valitakse välja in vitro ja neist kasvatatakse taimed.
Esimene geenitehnoloogiliselt muundatud taimesort (kauasäilivate viljadega tomat ) lubati USA turule 1994. aastal (geeninokaudiga).
Kõige rohkem on geneetiliselt muundatud : soja, mais, raps, riis , tomat, puuvili , raps, teravili.
GMO - aretuse poolt

• Kiired tulemused
  
• Geenid teistelt liikidelt
  
• Geenide avaldumist saab reguleerida
  
• Teatakse täpselt, millist geeni üle kantakse, mis muutub uues sordis
  
• Põldudel kasutatakse väham keskonnamürke
  

See on täppissordiaretus.
GMO –aretuse vastu

• Kahjurid võivad muutuda immuunseks
  
• Geenid võivad üle kanduda umbrohule
  
• Erinevate organismide geenide koostoime võib olla ettearvamatu
  
• GM-taimede maitseomadused on tavaliselt halvemad
  

Geeninokaut
Geeninokaut – geenitehnoloogiliselt rikutud geeniseisund. Geen lülitatakse välja.
On loodud sadade geenide suhtes „nokauti loodud“ hiiri.
Tehnika on keeruline :

Geenivektor ( vigane geen  marker ) viiakse hiire embrüonaalsetesse tüvirakkudesse

Vektor satub ristsiirdega genoomi

Selektiivsöötmel jäävad ellu mutantsed rakud , need on nokautrakud.

Nokautrakud siirdatakse uude embrüoblasti

Tekib kimäärne embrüo

See embrüo viiakse hiire emakasse

Sünnivad kimäärsed hiired (neid hoitakse)

Järgneva ristamise tulemusena sünnib ka homosügootseid nokauthiiri
Mudelhiired – haiguste uurimiseks
Organite kasvatamiseks GM-loomade baasil.
Kimäär – erineva genotüübiga ja eri organismidest pärit rakkudest koosnev organism.
Geeniteraapia
Geeniteraapia - geenitehnoloogiline meetod geneetiliste haiguste raviks või leevendamiseks.
Geeniteraapia seisneb enamasti normaalselt talitleva geeni siirdamises raske geneetilise puudega inimese mingi koe (organi) rakkudesse. Osal juhtudel seisneb ravi ka mutantse geeni avaldumise vaigistamises.
Inimesel on teada üle 30000 päriliku puude
Immuunpuudulikkuse ravi oli 1990. aastal suhteliselt edukas.
Geenivaigistamiseks kasutatakse mikro -RNA molekule. Kui mikro-RNA-d ühinevad mRNA-ga, siis viimane lagundatakse. Nii saaks ravida Huntingtoni haigust. Geenivaigistamine on täiesti uus suund.
Somaatiline geeniteraapia ehk ravikloonimine
Ravimiseks siirdatakse tüvirakke ( mis saadakse mõne päeva vanusest embrüost ning kasvatatakse ja paljundatakse laboris ) otse haigesse koesse, kus nad muunduvad vastava koe rakkudeks asendades kahjustatud rakke.

Haige patsient

Patsiendilt eemaldatud terved rakud

Rakkude siirdamine munarakku

Raku mõjutamine elektriga

7 päeva vanune embrüo

Embrüonaalsete tüvirakkude kasvatamine

Tüvirakkude siirdamine haigesse koesse
Sugurakkude mõjustamine

• Esimesel juhul viiakse geneetiline materjal pre-embrüosse – see on nii tulevase elusolendi kui ka tema järglaste ennetav ravi.
  
• Teisel juhul viiakse geen üksikisiku sugurakkudesse. See ravivõte ei mõjuta otseselt antud isikut, vaid peab tagama, et tema järglased sünniksid kindla tunnusega või ilma selleta.
  

Geenikandjad

• Üks võimalus on kasutada viirust – viiruse geenid asendatakse inimese normaalsete geenidega ja kuna viirus on suuteline sisenema paljudesse inimese rakkudesse, siis koos viirusega läheks rakku kohale ka soovitud geen.
  
• Teine viis geene paigale toimetada on plasmiidide kasutamine (plasmiid = bakterrakkude DNA molekul).
  

Geenitehnoloogia rakendusi
Molekulaargeneetiline diagnostika
Põhineb enamasti mutantsete geenide äratundmisel DNA- proovide abil.
DNA- kiibid – võrdlus DNA-lõigud, millega patsiendi geene kõrvutada saab tuvastada haiguse ja siis vastavalt määrata ravi (Rinnavähk, huntingtoni tõbi jne).
Helenduvad geenid on lisatud vaid markerina, et kindel olla geenide ülekandes.
DNA-sõrmejälgede diagnostika
Võrreldakse 10 või enama lookuse pikkust : Lookusi saab DNA-st välja lõigata ja paljundada.
See proov pannakse geeli. Geel pannakse elektrolüüsivanni.
Lookus – mingi kromosoomi mis tahes lõik, milles on tuvastatav mingi geneetiline element.
PCR metootika – võimaldab mõne raku olemasolu korral paljundada kindlat DNA-lõiku mõne tunni jooksul miljonis koopias, mis annab võrdlevaks uurimiseks piisavalt materjali.