Putukate, vetikate ja ainuraksete suured DNA genoomsed viirused (0)

Putukate, vetikate ja ainuraksete suured DNA genoomsed viirused
Baculoviirused moodustavad suure viiruste sugukonna (teada üle 500 liigi). Neile kõigile on iseloomulikud suured tsirkulaarsed dsDNA genoomid , mis on virionis pakitud kepikesekujuline nukleokapsiid (lad. baculum – kepike, siit ka sugukonna nimetus). Baculoviirustele on iseloomulik nakatunud rakkudes spetsiifiliste inklusioonkehade moodustamine. Baculoviiruseid on kõige enam teada liblikalistel, kuid neid on leitud ka kahetiivalistel, ehmestiivalistel ja ka krevettidel.
Baculoviirustel esineb kahte tüüpi virione:

• Virionid, mis kujunevad pungumisel raku plasmamembraanist (BV-budded viruses).
  
• Virionid, mis moodustuvad rakutuumas ja asuvad inklusioonkehades (OV-occluded viruses).
  

Sugukonda Baculoviridae kuulub on kaks perekonda viiruseid :

• Nucleopolyhedrovirus (NPVs; Autographa californica MNPV)
  
• Granulovirus (GVs; Gydia pomonella GV)
  

Perekondadesse jagunemine põhines ajalooliselt inklusioonkehade erineval morfoloogial:

• GVd moodustavad väikeseid inklusioone – graanuleid - millest igaühes asub üks virion;
  
• NPVd moodustavad suuri inklusioone, millest igaüks sisaldab palju – tavaliselt üle 20-ne - virioni).
  

NPV-d on oluliselt paremini uuritud kui GV-d.
OV-de (occluded virions) ja BV-de (budded virions) moodustamine NPV-ga nakatatud rakus
BV-d vabanevad nakatunud rakust välja pungumise teel. Need virionid on ette nähtud levikuks nakatatud peremehes (röövikus).
OV-d kogunevad rakutuumas moodustavatesse inklusioonkehadesse. Üldreeglina on OV-de moodustamine hilisem sündmus kui BV-de valmimine. OV-d on ette nähtud levikuks peremehelt peremehele.
BV-d on ette nähtud levikuks putuka organismis, OV-d aga viiruse levikuks väliskeskkonna kaudu.
BV-des ja OV-des asuvad nukleokapsiidid on identsed, erinev on aga neid ümbritsev membraan (erinevad membraanvalgud). Sellest tulenevalt erinevad ka mehhanismid , millega BV-d ja OV-d rakkudesse sisenevad.
BV membraani olulisem valk on membraanide liitumist põhjustav envelope fusion protein (EFP). AcMNPV puhul on see gp64 glükoproteiin (ilmselt ka antiretseptor).
OV-sid ümbritseb paks valguline maatriks , mis NPV-del koosneb valgust nimega polühedriin ja GV-del valgust granuliin. Polüheedri välispinda katab polühedroon-valk.
Perekond Nucleopolyhedrovirus
NPV poolt põhjustatud siidiusside haigusi tunti Hiinas juba 4000 BC. Mikroskoopia kasutuselevõtuga leiti, et nakatatud siidiussi rakkude tuumades leidub suurel hulgal polüheedri kujulisi kristallilisi inklusioone (NPV-d replitseeruvad rakutuumas), millest tulenevalt hakati haigust nimetama tuumseks polühedroosiks.
Kuna NPV-d nakatavad ka paljusid kahjulikke putukaid, omandasid need viirused tähtsuse putukatõrjes; molekulaarbioloogiliste uuringute tulemusena aga ka biotehnoloogias.
Perekonna enim uuritud esindajad on:

• Autographa californica MNPV (AcMNPV, peremees – tähtöölane);
  
• Bombyx mori NPV (BmNPV, peremees – siidiliblikas);
  
• Lymantria dispar MNPV (LdMNPV, peremees känalainelane) ja
  
• Orgyia pseudotsugata MNPV (OpMNPV, peremees tukslane).
  

Üldse on teada, et NPV nakatavad:

• liblikaliste (Lepidoptera, 300 liiki);
  
• kahetiivaliste (Diptera, 20 liiki);
  
• kiletiivaliste Hymenoptera (20 liiki) ja
  
• ehmestiivaliste Trichoptera (üks liik, puruvana) seltside esindajaid.
  

Samuti võivad need viirused nakatada teisi lülijalgseid (krevetid, suur majanduslik probleem Aasias). Individuaalsed NPV omavad suhteliselt kitsast peremeesteringi (tavaliselt ühe putukate seltsi piires).
NPV-de genoomi struktuur
Baculoviiruste genoomi mõõtmed on vahemikus 90-180 kbp; genoom on tsirkulaarne. Sekveneeritud on üle 30 bakuloviiruse genoomi
AcMNPV genoom on 133,894 bp pikkune ja sisaldab:

337 OFR-i (pikkusega üle 150 bp), lugemisraamid paiknevad mõlemas ahelas; funktsionaalset klasterdumist ei ole. Geenid paiknevad teineteise lähedal (vahed enamasti 2-200 bp), need vahealad on AT-rikkad ja toimivad promooterite ja terminaatoritena. Introneid on väga vähe. Transkriptid (eriti hilised ) on sageli struktuurselt polütsistroonsed.

Peale selle paikneb AcMNPV genoomis veel 8 homoloogilist kordusjärjestust (hrs, pikkusega 30-800 bp). Hr järjestus koosneb nn 60 bp kordustest, millest igaüks koosneb väga konserveerunud mittetäiuslikest 28 bp palindroomidest. Hr elemendid toimivad geeniekspressioonil enhanseritena (seondavad viiruse trans-aktivaatoried) ja osalevad viiruse DNA replikatsioonis ”origin” struktuuridena.
AcMNPV kodeerib kolme valku, millel on olemas homoloogia raku DNA replikatsioonis osalevate valkudega. Need on:

DNA polümeraas ;

helikaas ja

PCNA (proliferating cell nuclear antigene).
AcMNPV infektsioonitsükkel rakukultuuris
Baculoviiruse elutsüklile in vivo on iseloomulik primaarne ja sekundaarne infektsioon . Sekundaarne infektsioon sarnaneb infektsioonile rakukultuuris ja seda on seetõttu rohkem uuritud:

infektsioon algab sellega, et BV gp64 seondab raku retseptorit ( retseptor on siiani tundmatu, samas on teada, et gp64 seondab efektiivselt ka imetajarakke);

viirus tungib rakku retseptor-seoselise endotsütoosi teel;

gp64 on vastutav BV membraani liitumise eest endosoomide membraaniga;
Nukleokapsiidid vabanevad (4) ja liiguvad tuuma (5, selleks kasutatakse viiruse poolt indutseeritud aktiini polümeriseerumist), kus toimub DNA vabanemine (6) ja algab viiruse genoomi transkriptsioon (7). Replikatsiooniks vajalike valkude kogunemine algatab viiruse genoomi replikatsiooni ja koos sellega hilise transkriptsiooni (8). Algab nukleokapsiidide moodustumine, esialgu toimub nende transport tuumast välja plasmamembraanile (9) kus toimub BV-de pungumine (10) ja vabanemine keskkonda. Hilisemas faasis toimub nukleokapsiidide pakkimine OV virionidesse (12) ja peale väga hilise geeniekspressiooni toimumist leiab aset inklusioonkehade moodustamine (13).
NPV-de geeniekspressioon
Baculoviiruse geenid asuvad mõlemas DNA ahelas, funktsionaalset klasterdumist ei ole, ORFid enamasti ei kattu, introne on vähe.

• Varajane transkriptsioon algab enne DNA replikatsiooni ja toimub raku RNA-polümeraas II abil. See faas kestab ca 6-12 tundi ja teda iseloomustab keeruline regulatsioon (peamine regulaator on viiruse IE1 valk (67 kDa), seondub dimeeridena hrs järjestustele). Varajases faasi tulemusena ekspresseeritakse:
  

- geenid mis on valikud DNA replikatsiooniks;
- geenid, mis on vajalikud viiruse hiliseks geeniekspressiooniks (lef geenid);
- rida teisi geene nagu p35 ja egt, mis mõjutavad peremeest .
Hiline transkriptsioon algab koos DNA replikatsiooniga ja kestab 6-24 h p.i. Kui genoomi replikatsioon blokeerida, siis ei alga ka hiline transkriptsioon. Baculoviiruse hilist transkriptsiooni viib läbi viirus-spetsiifiline RNA polümeraas, mis tunneb ära viiruse hilised promooterid, milles esineb (A/G/T)TAAG motiiv (nn. basal promoter, promooterisse kuulub veel kuni 18 TAAG järjestust ümbritsevat aluspaari, mis moduleerivad promooteri aktiivsust). Bakuloviiruse hilist geeniekspressiooni koordineerivad vähemalt 19 erinevat viiruse kodeeritud valku (lef geenid, kodeerivad peale regulaatorite ka RNA polümeraasi subühikuid ja replikatsioonivalke).
Väga hiline transkriptsioon toimub 18-76 h p.i. Hüper-ekspresseeritakse geenid polh (polühedriin) ja p10, nende valgud on vajalikud inklusioonide moodustumiseks Väga hilises transkriptsioonis osaleb viiruse RNA polümeraas ja lisaks eelnevaile veel VLF1 valk (very late expression factor). Polühedriini promooteris asub samuti TAAG järjestus ning promooteri aktiivsust reguleerivad järjestused, mis paiknevad 50 bp fragmendis allpool TAAG elementi ja on vajalikud promooteri hüperaktiivsuse saavutamiseks (see regioon on VLF-1 trans-aktivaatori seondumiskoht).
DNA replikatsioon ja virionide moodustamine
Replikatsiooniks on vajalikud vähemalt kuus viiruse valku (IE1 – toimib kui origini äratundev valk, DNA pol, p143 (helikaas), lef-1(praimaas), lef-2 (praimaasiga seotud valk), lef-3 (ssDNAd seondav valk))
Bakuloviiruse DNA replikatsioon toimub rakutuumas veereva ratta mehhanismi abil. Kui on sünteesitud uued DNA-d ja viiruse struktuursed valgud, siis algab virionide moodustumine. Nukleokapsiidid moodustuvad hilise ja väga hilise geeni-ekspressiooni faasi jooksul.Kapsiidide moodustumine leiab aset virogeense strooma (struktuur, mis moodustub nakatatud rakkude tuumades) äärealade. Erinevad virionid moodustuvad erineval viisil ja erinevas infektsiooni faasis.
BV moodustumine ja pungumine rakust.
Moodustunud nukleokapsiidid väljuvad rakutuumast. Selle protsessi juures on oluline roll aktiinfilamentidel (kui aktiin depolümeriseerida, siis see protsess peatub). Ehkki esialgne membraan võib moodustada rakutuumas, omandavad BV-d lõpliku membraani plasmamembraanist pungumise teel. Pungumiseks on vajalik gp64 glükoproteiini olemasolu. Pungumise maksimaalne efektiivsus leiab aset ca 10-20 h p.i ja lõpeb umbes 36 h. p.i.
OV moodustumine.
OV-de moodustumine on detekteeritav alates 18 h p.i. Nende moodustamisega on seotud raku tuumamembraanide modifitseerimine ja polühedriin-valgu transport tsütoplasmast rakutuuma. Membraan omandatakse enne polühedriinist koosneva kapsli moodustumist. Kapslit ümbritseb omakorda polühedroon-valk.
NPV infektsiooni- tsükkel putukas
OVd on ette nähtud uute peremeeste nakatamiseks. Infektsioon röövikus kestab 4-20 päeva ja lõpeb rööviku surmaga.

Esimeseks etapiks on polüheedrte lahustumine sooles (aluseline pH >10 midgut osas), vabanenud virionid (2) on võimelised läbima peritroofilist membraani (3, selleks on oluline OV proteaas – enhancine valk) ja nakatavad nii epiteliaalseid kui ka regeneratiivseid rakke ( sisenemine rakku virioni ja plasmamembraani fusionil)

Järgnev infektsioon on sarnane infektsioonile rakukultuuris (4-11). Esmaselt nakatatud rakkudest vabanevad (basaalse membraani suunas) BVd.

Sekundaarne infektsioon toimub esialgsest infektsioonist pärinevate virionide (BV) vahendusel. Viirus levib putukas vererakkude (hemotsüüdid) ja/või õhutorude epiteeltakkude kaudu; vastuvõtlikes peremeestes nakatuvad lõpptulemusena peaaegu kõik rööviku sisesed koe- ja rakutüübid;

Hilises faasis täituvad putuka raku tuumad inklusioonkehadega, röövik sureb ja täitub piimja polüheedreid sisalduva vedelikuga. Epidermis muutub hapraks (viiruse proteaasi ja kitinaasi toimel) ja selle purunedes polüheedrid väljuvad.
Baculoviirused ja peremehe kaitsesüsteemid
Baculoviiruse infektsiooni rakkude tasandil iseloomustab nakatatud rakkude tuumade suurenemine, raku tsütoskeleti ümberkorraldamine ja raku biosünteeside (valgu ja RNA sünteesi) mahasurumine.
Putukate viirus-vastases kaitses on oluline roll apoptoosil. On võimalik, et rakkude apoptoosi indutseerivad mitmed viiruse infektsiooniga kaasnevad protsessid. Esimeseks märgatavaks sündmuseks apoptoosi protsessis on kaspaaside aktiveerumine, mis leiab aset umbes samal ajal kui aktiveeritakse viiruse DNA replikatsioon.
Selle kaitsemehhanismi mahasurumiseks kodeerib AcMNPV P35 antiapoptootilist valku (kaspaaside substraatne inhibiitor), mille süntees leiab aset enne kaspaaside aktiveerimist. On näidatud , et P35 puudumisel tekib nakatatud kultuuris ligi 10 000 korda vähem BVsid ja viirus ei suuda röövikut süsteemselt nakatada (LD50 tõuseb üle 1000 korra), sest nakatatud rakud surevad enneaegselt ja uued viirused ei jõua valmida. Muudel baculoviirustel esineb ka teistsuguseid apoptoosi blokeerivaid valke.
Edasise nakkuse käigus blokeerib viiruse ensüüm EGT, mis sekreteeritakse putukavastse hemolümfi baculoviirusega nakatatud rakkudest, rööviku arengu (modifitseerides hormoone - ecdysteroidide). See väldib rööviku üleminekut moondesse ja hoiab teda kasvamisjärgus. Sellisel viisil moduleerivad viirused kogu rööviku arengut (blokeeritakse moone) ja ka käitumist – nakatatud röövikutele on iseloomulik, et nad lahkuvad oma toitumiskohal ja/või ronivad taimede kasvude otstesse, kus nad jäävad oksa või lehe tippu rippuma (seda käitumist põhjustav ptp-geen, mis on ilmselt omistatud putuka genoomist).
Baculoviiruste kasutamine
Nii NPV-del kui ka GV-del on tähtis roll putukapopulatsioonide arvukuse reguleerimisel (tihedas populatsioonis on viiruse levik soodustatud, sest viiruse OVd satuvad massiliselt mullale ja lehtedele).
Kuna NPVd on mitmetele kahjurputukatele väga virulentsed, kasutatakse neid taimekaitses (üle miljoni hektari soojauba Brasiilias ja mujal). Probleemiks on, et NPVd tapavad röövikud suhteliselt aeglaselt ja võimaldavad neil enne suremist taimi ulatuslikult kahjustada. Sellest ülesaamiseks planeeritakse kasutada geneetiliselt modifitseeritud NVPsid, millesse on kloneeritud putukavastaste toksiinide geene.
Baculoviirused on väga tähtsad eukarüootse geeniekspressiooni vektorid (rekombinantsete valkude tootmine), kuna baculoviiruses leidub aktiivseid promootereid (polühedriini, p10, ka varajaste valkude promooterid) ja baculoviiruse genoomi saab kloneerida suuri inserte.
Nudiviirused
Nudiviirused on ebatüüpilised putukaviirused. Nende viiruste nimetus tuleneb sellest, et nende kepikese kujulisi, membraaniga virione ei pakita erinevalt baculoviirustest OV-desse (“nude” – paljas). Seetõttu on nudiviirused väliskeskkonnas oluliselt vähem stabiilsed kui baculoviirused ja neile on iseloomulik persistentsete ja latentsete infektsioonide tekitamine.
Nudiviiruste genoomiks on suur, kaheahelaline tsirkulaarne DNA. Siiani on nudiviiruste genoomid sekveneerimata ja nende molekulaarne evolutsiooniline päritolu on seetõttu ebaselge. Tuntuimad nudiviirused on Oryctes rhinoceros nudiviirus (peremees – ninasarvik põrnikas), Heliothis zea viirus (Hz-1, peremees - päikeseöölane) ja Gonad specific virus (GSV).
Nudiviirused on tähtsad putuka populatsioonide mõjutajad. Oryctes virus, mis põhjustab oma peremehel (nii valmikul kui vastsel) fataalset infektsiooni, on tähtis ja väga efektiivne putukatõrje vahend (kookospalme kahjustavate mardikate vastu). See viirus kandub edasi peamiselt saastatud toidu kaudu, kuid võib üle kanduda ka putukate paaritumise kaudu.
GSV nakatab putukate muna ja seemnesarju ja põhjustab sellega oma peremeestel steriilsust. Putuka populatsioonis levib GSV asümptomaatiliste viiruskandjate vahendusel (samuti ka vertikaalselt munade kaudu). GSV replikatsioon aktiveerub putuka hormoonide toimel.
Kõige enam on nudiviiruste hulgast uuritud Hz-1 molekulaarbioloogiat. Hz-1 genoom on ca 228 kbp pikkune tsirkulaarne DNA ja see viirus tekitab peamiselt persistentset ja latentset infektsiooni, mida iseloomustab viiruse DNA stabiilne integreerumine peremeesraku kromosoomi.
Vetikate viirused
Vetikaid nakatavad väga mitmed erinevad viirused, sh. ssRNA, dsRNA, ssDNA ja dsDNA genoomiga viirused. Enim on uuritud suured dsDNA genoomiga viirused. Need viirused kuuluvad sugukonda Phycodnaviridae ja jagunevad mitmesse perekonda:

• Chlorovirus (Paramecium bursaria chlorella virus 1 – PBCV1)
  
• Coccolithovirus (Emiliania huxleyi virus 86 – EhV-86)
  
• Prasinovirus (Micromonas pusilla virus SP1 – MpV-SP1)
  
• Prymnesiovirus (Chrysochromulina brevifilum virus PW1, CbV-PW1)
  
• Phaeovirus (Ectocarpus siliculosus virus 1 – EsV-1; Feldmannia species virus 1- FsV)
  
• Raphidovirus ( Heterosigma akashiwo virus 01 – HaV-01)
  

Palju liike on veel perekondadesse süstematiseerimata.
Enim uuritud üherakuliste vetikate, eriti Chlorella viiruseid. Esimene selline viirus - PBCV-1 (Paramecium bursaria Chlorella virus 1) avastati 1981 aastal ainuõõse organismi sümbiontsest Chlorella’st.
PBCV-1 virionid
PBCV-1 on lüütiline viirus, mis paljuned hästi vetikakultuuris. Tema virioni diameeter on 175-190 nm (T=169) ja sellest ulatuvad välja paindlikud ”oga-laadsed” struktuurid .
Vetikate viiruste virionidele on omane membraani olemasolu. Membraan asub virioni välimise glükoproteiinse kapsiidi all ja on vajalik virionide infektsioonilisuseks. Virioni massist moodustavad valgud 65%, DNA 21-25% ja lipiidid 5-10%.
Kokku on virionis üle 110 erineva viiruse kodeeritud valgu, millest vähemalt neli asuvad virioni pinnal. Peamine kapsiidivalk on 54 kDa glükoproteiin (40% virioni massist).
Rakuseinata vetikarakke PBCV-1 virionid ei nakata. See on seotud sellega, et virioni seondumiseks vajalik retseptor paikneb vetikaraku seinas. Virionide välispinnal paiknevad retseptor-struktuurid, mis kontakteerudes vetikarakuga muudavad struktuuri (moodustavad viirust ja rakku ühendavad fiibrid).
PBCV-1 genoomiks on 330,740 bp pikkune, permuteerimata dsDNA, mis sisaldab metüleeritud aluseid. Genoomi otstes asuvad 35 b pikkused juuksenõela struktuurid (st. genoomi otsad sarnanevad poksviiruste genoomile), millele järgnevad 2221 bp pikkused identsed inverteeritud terminaalsed korduvjärjestused.
PBCV-1 genoomis on leitud 702 lugemisraami, millest 366 kodeerib ilmselt valke ja 11-st tRNA geenist koosnev klaster, mis paikneb genoomi keskosas. Lugemisraamid paiknevad lähestikku ja mõlemas ahelas.
40% PBCV-1 poolt kodeeritavatest valkudest omab homoloogiat mingite teistest organismidest pärit valkudega.
84 geeni kuulub geeniperekondadesses (26 perekonda, igas 2-6 liiget)
Mõnedes geenides leidub introne, mis kuuluvad kolme erinevasse tüüpi:

• isesplaiseeruvad intronid
  
• splaisosoomi-splaiseeritavad intronid
  
• tRNA geeni intron
  

Sekveneeritud on ka mitmeid teisi Chlorella viiruseid, nende järjestuste sarnasus (valkude tasemel) on ca 60%
Seondumine rakule. PBCV-1 seondub kiiresti ja pöördumatult Chlorella rakkudele.
Seondumise saidis toimub raku seina lahustumine ja viiruse DNA tungib rakku (tühi kapsiid jääb raku pinnale).
Raku seina lüüsimine toimub virionis paikneva(te) ensüümi(de) toimel, DNA sisenemiseks rakku on vaja ka peremehe funktsioone. DNA transporditakse tuuma.
Vetikate viirused replitseeruvad rakutuumas. Sellele vaatamata ei vaja nad tuumseid funktsioone (replikatsioon võib toimuda ka UV-kiiritatud rakus). Samuti ei vaja PBCV-1 replikatsioon fotosünteesi toimumist. Siiski sõltub viiruse replikatsiooni efektiivsus peremeesraku seisundist.
Varajane infektsioon. Rakku sisenenud DNA ja sellega seondunud valgud transporditakse kiiresti rakutuuma, varajane transkriptsioon algab 5-10 minutit peale infektsiooni. Selle viib läbi raku RNA polümeraas (oma RNA polümeraasi pole). Küll aga on olemas transkriptsiooni reguleerivad valgud, sh. basaalsete transkriptsioonifaktorite homoloogid (TFIIB, TFIID, TFIIS). Osad (mitte basaalsed) transkriptsioonifaktorid on pakitud ka virionidesse. PBCV-1 kodeerib ka RNAd modifitseerivaid ensüüme (cap-sünteesi ensüümid RNA TP ja GT).
Promooteri moodustab järjestus, mis asub transkriptsiooni algus-saidi suhtes -150 kuni +50 b vahel. Enne DNA sünteesi ekspresseerub 227 geeni (neist 127 geeni ekspressioon lõpeb enne DNA replikatsiooni algust)
PBCV-1 transkriptsiooni kohta on teada et:
- PBCV-1 surub kiiresti ja efektiivselt maha peremeesraku transkriptsiooni (kromatiini re-modelleerimine valgu vSET poolt?).
- Osa varajasi transkripte sünteesitakse ka valkude de novo sünteesi puudumisel rakus. Varajased transkriptid on polüadenüleeritud, kuid hilistest transkriptidest on polüadenüleeritud vaid üksikud. Varajased ja hilised geenid ei ole klasterdunud.
DNA replikatsioon algab 1 tund peale infektsiooni algust. Raku tuuma ja kloroplasti DNA degradeerub, kuid DNA sisaldus rakus tõuseb (4 tundi peale infektsiooni algust) tänu viiruse DNA aktiivsele replitseerumisele 4-10 kordseks (seda võimaldab viiruse nukleotiide sünteesivate valkude olemasolu, selliseid ensüüme on vähemalt 13). Replikatsiooni viib läbi viiruse kodeeritud ensüümkompleks (vähemalt kümne viiruse geeni produktid, sh polümeraas, ligaas, topoisomeraas, RFC), millesse ilmselt kuulub ka peremeesraku komponente.
Hiline transkriptsioon algab koos DNA sünteesi algusega. Hiliseid geene on 133; jätkub ka osade varajaste geenide ekspressioon
Umbes 2 tundi peale infektsiooni algust toimuvad rakus tsütoloogilised muutused:
- tuumake kaob, kuid tuuma membraanid , mitokondrid ja kloroplastid säilivad;

• raku materjalid ”surutakse” kloroplasti vastu, vabanev ruum kujuneb viiruse moodustumise tsentriteks, sinna kogunevad ka membraanid.
  

Valkude sünteesil osalevad viiruse tRNAd ja arvatavasti ka viiruse kodeeritud translatsioonifaktorid (eF3). Mitmeid valke glükosüleeritakse, erinevalt enamikust viirustest teevad seda PBCV-1 enda ensüümid, mida on viirusel viis või kuus.
Virionide kapsiidid moodustuvad enne DNA pakkimist (pakkimine toimub kapsiidis leiduva ava kaudu).
4-5 tundi peale infektsiooni algust leidub nakatatud rakus juba arvukalt valmis virione.
Virionide pungumist rakumembraanist ei esine.
Rakkude lüüs algab 4 tundi ja lõpeb 8-10 tundi peale infektsiooni algust. Seda teevad viiruse kodeeritud ensüümid (vähemalt 5 erinevat; osa neist pakitakse ka virioni ja võivad olla olulised uue raku nakatamisel)
Rakkude lüüsimise tulemusena vabaneb iga nakatatud raku kohta 200-350 uut PFU-d.
Endonukleaasid ja DNA metüültransferaasid
Chlorella viiruse DNA sisaldab 5mC ja 6mA jääke positsioonides, mis erinevad peremehe DNA metüleerimissaitidest. See metüleerimine toimub viiruse poolt kodeeritud 5mC ja 6mA-metüültransferaaside poolt. Lisaks modifikatsiooni-ensüümidele (mõnel viirusel kuni 18 erinevat) kodeerib PBCV-1 veel ka DNA- sait -spetsiifilisi endonukleaase (restriktaase). Seega on vetikate viirused esimeseks mitte-prokarüootseks restriktaase kodeerivaks süsteemiks.
Chlorella viiruste poolt kodeeritud restriktaaside lõikamissaidid:
- Võivad sarnaneda bakteriaalsete restriktaaside saitidele (nt. R.CviAI lõikab GATC järjestust).
- Olla unikaalsed (nende puhul pole bakteriaalseid analooge teada).
- Asuda ainult ühes ahelas – vetikate viirustele on omased ka järjestus- spetsiifilised nikeerimisensüümid (nt. lõikab Nys1-nikaas DNAd CC ja NY2A- nikaas RAG järjestuse kohalt).
Nendel ensüümidel (nukleaasid ja metüültransferaasid) on oluline osa viiruse elutsüklis. Oletatavaks funktsiooniks võib olla:
- Endonukleaasid osalevad peremehe DNA degradeerimisel, mis on oluline viiruse replikatsiooniks vajalike substraatide vabastamiseks. Metüül -transferaasid kaitsevad viiruse enese DNAd selle süsteemi rünnaku eest.

• Viirused kasutavad restriktsioonisüsteemi kaitseks teise viiruse rünnaku vastu.
  

Eksperimentaalsed andmed toetavad enam esimest võimalust. Vähemalt kaks nukleaasi (kuid mitte metüültransferaasi) pakitakse virioni ja vastutavad peremehe DNA kiire degradeerimise eest.
Teised Phycodnaviridae esindajad
Peale Chlorella viiruste uuritakse suhteliselt intensiivselt ka:
- üherakuliste merevetikate Micromonas pusilla ja Chysochromulina (vastavalt MpV ja CbV) ja Emiliania huxleyi viiruseid (EhV)

• hulkraksete pruunvetikate Ectocarpus ja Feldmannia viiruseid (vastavalt EsV ja FsV).
  

Need uurimused on näidanud, et oma bioloogiliste omaduste poolest on phycodnaviirused väga erinevad.
EhV-86 genoom on 407 kbp pikkune tsirkulaarne DNA ja kodeerib 472-te valku (millest vaid 66-l on teada homolooge teistelt bioloogilistelt objektidelt). Nende valkude hulgas on palju (viirusele) eksootilisi ensüüme, nagu sfingolipiidide biosünteesi ensüüme. Väga oluline on see, et EhV kodeerib RNA polümeraasi
(vähemalt kuute selle subühikut). Siiani pole näidatud, et seda leiduks ka virionis – seega peab see viirus replitseeruma (vähemalt alguses) rakutuumas. Üldse on EhV virionist leitud 28 valku, millest 23 on membraanvalgud. See kajastab EhV peamist bioloogilist eripära – praegustel andmetel omab EhV välismembraani (mitte kapsiidi all) ja siseneb peremeesrakku endotsütoosi sarnase protsessi teel. Samuti on kirjeldatud EhV vabanemist pungumise teel.
FsV ja EsV tsükkel on seotud peremehe arenguga
EsV ja FsV viirused erinevad muudest vetikate viirustest selle poolest, et nende infektsioonis esineb lüsogeene staadium: viiruste genoom kodeerib integraasi ja integreerub peremehe genoomi (genoom on latentne vegetatiivses rakus ja aktiveerub sugurakkude moodustamisel).

• EsV genoom on dsDNA (335 kbp, praegustel andmetel lineaarne, väga pikkade ITR-idega – 12% genoomist) ja kodeerib 221 valku.
  

FsV genoom on tsirkulaarne (?) DNA , mis eksisteerib kahe variandina (mõõtmetega vastavalt 158 ja 179 kbp)
FsV integreerub peremehe genoomi.
Integratsiooni koht peremehe genoomis on kummalgi FsV genoomi variandil erinev.
FsV genoomi variandid on omavahel sarnased (erinevad lühikeste, ca 170 b pikkuste korduvjärjestuste poolest). Viiruse järjestused, mille kaudu toimub integreerumine, on mõlema genoomi variandi puhul samad.
Kuhu kuuluvad vetikate viirused?
Vetikate viiruste genoomsete järjestuste analüüs näitab, et vetikate viirused moodustuvad evolutsiooniliselt ühtse grupi (st. pärinevad ühest ürg -eelasest). Samas pole nad kuigi lähedased sugulased – PBCV1, EhV-86 ja EsV-1 omavad ainult 14-t ühist geeni.
Koos mimiviiruse, poksviiruste, iridoviiruste ja ASFV-ga moodustavad phycodnaviirused suurte nukleo -tsütoplasmaatiliste DNA viiruste (NCLDV) grupi. Kõikidel NCLDV esindajatel on 9 ühist geeni (st. 14-st phycodnaviiruste ühisest geenist on 9 ühised kõikidele NCLDV-dele); 33 geeni on leitud rohkem kui ühest viiruste sugukonnast.
NCLDV-d on ürgset päritolu viiruste grupp; analüüsid näitavad, et nende eellased pärinevad ajast, millal toimus prokarüootide ja eukarüootide lahknemine (ca 2 miljardit aastat tagasi).
Amööbi viirus – mimiviirus
Mimiviiruse peremeheks on amööb Acanthamoeba polyphaga; viiruse molekulaar-bioloogiast on veel teada väga vähe, tõenäoliselt replitseerub ta nii raku tuumas kui ka tsütoplasmas. Teada on mitu viiruse varianti (üks tüvedest kannab nime mamaviirus)
Genoom

• Genoomiks on lineaarne dsDNA, mille otste läheduses asuvad 900 bp pikkused inverteeritud korduvjärjestused. Seega on võimalik, et nakatatud rakkudes võib mimiviiruse DNA omandada ka tsirkulaarse kuju.
  
• Genoomi mõõtmed on viiruse kohta erakordselt suured: 1,181,404 bp (võrdluseks: bakteri Mycoplasma genitalium genoom on 580 kbp pikkune).
  
• Kodeeriv ala moodustab genoomist üle 90%, lugemisraamid paiknevad mõlemas DNA ahelas. Kokku on identifitseeritud 1262 ORF-i, mis on pikemad kui 100 koodonit, valke kodeerivad neist 911 (homolooge on leitud 194-le).
  
• Mimiviiruse poolt kodeeritavate valguliste produktide hulka suurendab splaisingu kasutamine. Mimiviirusel on olemas:
  

• valkude splaising (intein-domeenid, mis katalüüsivad enda väljalõikamist sünteesitud valgumolekulist ja uue peptiidsideme tekkimist väljalõikekohta ümbritsevate ah jääkide vahele) DNA polümeraasi kodeerivas alas
  
• isesplaiseeruvad intronid (seni teada faagidel ja phycodnaviirustel) – mimiviirusel on vähemalt neli sellist introni, mis kõik paiknevad RNA polümeraasi kodeerivates geenides.
  

Virion
Mimiviiruse virion on 400 nm diameetriga ikosaeeder, milles peale kapsiidivalkude leidub veel ka ensüüme (sh. RNA capeerimise ensüüm) ja viiruse mRNAd. Kapsiid on ca 40 nm paksune ja sellest ulatuvad välja pikad niitjad jätked ja kapsiidi all paikneb kaks kahekihilist membraani.
Mimiviirus kodeerib:
1.Vähemalt kümmet valgusünteesil osalevat valku sh. nelja aminoatsüül-tRNA süntetaasi, translatsiooni initsiatsioonifaktoreid 4E (cap-siduv faktor) ja IF-4A (helikaas); translatsiooni faktor eF-TU (GTP-d siduv faktor)
2. DNA reparatsiooni valke sh. kahte ensüümi, mis kõrvaldavad DNA-st oksüdeeritud puriin-jääke ja UV-damage endonukleaasi (UvdE)
3. Chaperone: kahte HSP70 perekonna chaperoni ja kolme DnaJ domeeni sisaldavat valku (sellised valgud seonduvad sageli HSP70 perekonna valkudega).
4. Viirustele uute ensümaatiliste radade valke, muu hulgas

• glutamiini metabolismi ensüüme (vähemalt viite erinevat)
  
• kuute glükosüültransferaasi. Esilagsed andmed näitavad, et need ensüümid osalevad viiruse valkude glükosüleerimisel
  
• nukleosiid trifosfaatide (CTP, UTP, GTP) sünteesil osalevat ensüümi
  
• lipiide metabolismis osalevaid ensüüme (vähemalt kolme). Nende ensüümide tähtsus viirusele ei ole selge, kuid võib oletada et nad võivad osaleda peremehe membraanidesse katkestuste tegemisel.
  

Mimiviiruse paljunemist on uuritud peamiselt elektronmikroskoobi ja EM tomograafi abil. Praegused andmed (ilmselt veel mittetäielikud) näitavad:

• Peremeesrakku siseneb mimiviirus fagotsütoosi teel.
  
• Mimiviiruse DNA koos virionis olevate core -valkudega vabaneb virioni tipus oleva suure kanali kaudu (mille moodustavad 5 “avanevat” ikosaeedri tahku) ja moodustab sfäärilise (diameeter 320 nm) core-struktuuri.
  
• Core-struktuur ei dissotseeru ja DNA ei vabanemist ja transporti tuuma ei toimu. Seega on mimiviiruse replikatsioon täielikult tsütoplasmaatiline. Seda võimaldab virionis olev RNA polümeraas. Kui viirus vajab tuumseid faktoried, siis transporditakse need tuumast välja.
  
• Geeniekspressioonis on selgesti eristatavad varajane, vahepealne ja hiline faas. Mass-sekveneerimine on näidanud, et varajase promooteri konsensus on AAAATTGA. Kokku ekspresseeritakse ca 1000 valku
  
• Viiruse DNA replikatsioon käivitab sfäärilise core-struktuuri dissotseerumise. Moodustuvad koonusja struktuuriga “viiruse vabrikud”, mille arv vastab alguses ligikaudselt rakku sisenenud virionide arvule. Hilisemas infektsioonis võivad “vabrikud” ka omavahel liituda.
  
• Virionide moodustamine toimub “vabrikutes”. Moodustatakse kapsiidid, DNA siseneb mitte ühe tipu kaudu vaid ühe ikosaeedri tahu kaudu, mis asub virioni vastasküljel (võrrelduna “core-struktuuri” vabanemiseks kasutatava “tipuga”.