Grupp III dsRNA viirused (1)

LIISI KINK
1
VIROLOOGIA
Grupp III dsRNA viirused
Ehkki kõik need viirused erinevad, lisaks erinevate peremeesorganismide kasutamisele,
teineteisest oluliselt ka genoomide ning virionide organisatsiooni poolest, leidub nende
elutsüklites küllalt palju ühiseid jooni.
1. SUGUKOND BIRNAVIRIDAE
Birnaviirustel on kahest segmendist koosnev dsRNA genoom, mille ahelate 5'-otstes asub
kovalentselt kinnitunud genoomiga seotud valk (VPg, terminaalne valk) ning seetõttu
moodustab birnaviiruste genoomne RNA VPg kaudu iseloomulikke mittekovalentseid
tsirkulaarseid struktuure. Üks genoomi segment transleeritakse polüproteiinina, mis lõigatakse
valmis valkudeks viiruse poolt kodeeritud proteaasi poolt.
Birnaviirused jagunevad kolme perekonda:
Avibirnavirus. Tüüpesindaja on kanade infectious bursal disease virus (IBDV, tuntud
alates 1960-ndatest).
Aquabirnavirus. Tüüpesindaja on lõhede infectious pancreatic necrosis virus (IPNV,
nakatab kalu, tuntud 1940-ndatest aastatest).
Entomobirnavirus. Tüüpesindaja on drosophila X viirus (DXV), nakatab putukaid.
Peale nende on teada veel birnaviiruseid, mis nakatavad molluskeid (oyster virus, OV). Ehkki
birnaviiruse laadseid agente on kirjeldatud nii inimesel kui ka koduloomadel puuduvad siiani
veel kindlad andmed imetajate klassikaliste birnaviiruste kohta. Enim uuritud birnaviirused on
IBDV ja IPNV (kuna need viirused põhjustavad suurt majanduslikku kahju).
1.1. Viron ja genoom
Virionid on ikosaeedrilised, ca 60 nm diameetriga. Kahekomponentset dsRNA genoomi
ümbritseb ühekihiline kapsiid (T=13), mille koosseisu kuulub neli struktuurset valku:
kaks mazoorset struktuurvalku on VP2 (40 kDa, viiruse peamine antigeen) ja VP3 (32
kDa);
minoorsed struktuurvalgud on VP1 (90 kDa) ja VP4 (28-29 kDa, virionis leidub seda
valku väga vähe, nakatatud rakus aga
suhteliselt palju, mistõttu teda nimetatakse ka
NS valguks).
1
LIISI KINK
2
VIROLOOGIA
IBDV genoom:
Segment A (3261 bp) sisaldab 5'-NTR (96 b) ja 3'-NTR (96 b) järjestusi.
Segment B sisaldab 5'-NTR (111 b) ja 3'-NTR (182 b) järjestusi.
Segmentide 5'-NTR järjestused on omavahel homoloogsed (eriti suur on homoloogia on 32 5'-
terminaalset nukleotiidi vahel), 3'-NTR-id aga mitte. Peale selle kujutavad mõlema segmendi
terminaalsed järjestused endast inverteeritud korduvjärjestusi. Need terminaalsed struktuurid
võivad moodustada sekundaarstruktuure, mis on olulised viiruse genoomi replitseerumiseks ja
pakkimiseks.
Segmendi A kodeeriv ala sisaldab erinevates faasides kahte osaliselt kattuvat ORF-i. Pikk ORF1
kodeerib 110 kDa polüproteiini. Valmis valkude järjekord polüproteiinis on (N-terminusest
alates) VP2-VP4-VP3. ORF2 kodeerib VP5 valku (17 kDa). VP5 on mittestruktuurne valk, mis
pole viiruse replikatsiooniks absoluutselt vajalik.
Segmendi B kodeeriv ala sisaldab ühte lugemisraami, mis kodeerib VP1 valku. VP1 on dsRNA
segmentide terminaalseks valguks (side RNA 5'-terminaalse G-jäägiga Ser-jäägi kaudu VP1-s),
mille abil genoomi segmendid moodustavad stabiilseid rõnga kujulisi struktuure. Peale selle on
VP1 multifunktsionaalne ensüüm ­ RdRp (transkriptaas ja replikaas), GT ja MT.
1.2. Replikatsioon
Ehkki nii IPNV kui ka IBDV replitseeruvad rakukultuuris on nende andmed nende
replikatsioonist väga piiratud. Uurimist on takistanud raku poolsete biosünteeside foon, sest
birnaviiruse infektsioon ei mõjuta oluliselt raku biosünteese ja on samas ka ise tundlik
actinomycine D-le.
Teadaolevalt ei ole birnaviirste replikatsioon seotud rakutuumaga. Birnaviiruste virionid
(erinevalt reoviirustest) ei vaja transkriptsioon aktiveerimiseks kapsiidivalkude proteolüüsi.
Nakatatud rakus ei toimu kapsiidi täieliku dissotsieerumist (nagu ka reoviirustel).
Transkriptsioon on erinevalt reoviirustest poolkonservatiivne (toimub ahela väljatõrjumisega).
Sünteesitakse kaks mRNAd, mis sisaldavad cap struktuuri. Samas on oletatud, et osade
(tulevaste genoomsete segmentide?) sünteesil toimub transkriptsiooni praimeerimine VP1-
valgu poolt.
2
LIISI KINK
3
VIROLOOGIA
Genoomi komponent A kodeerib polüproteiini, mis lõigatakse kiiresti VP2a- (VP2 eelvalk, 50
kDa), VP4- ja VP3-valkudeks. Viiruse proteaasiks on VP4, kuid on tõenäoline, et VP2a lõplikuks
protsessinguks (VP2 moodustumine, toimub vahetult enne virionide moodustumist või juba
moodustunud virionides) on vajalik ka raku proteaaside osalus.
Replikatsioon toimub arvatavasti moodustunud subviraalsetes partiklites. On oletatud, et VP1
võib toimida negatiivsete RNA ahelate sünteesil praimerina.
2. SUGUKOND PARTITIVIRIDAE
Vaatamata väga laiale levikule avastati esimene krüptoviirus (beet cryptic virus (BCV)) alles
1969 aastal. Osalt seisneb selle põhjus selles, et krüptoviirused on väga vähese patogeensusega
viirused - taimedes on krüptoviiruse kontsentratsioon väga madal ja nakkusega ei kaasne
märgatavaid sümptoome.
Krüptoviiruste süstemaatika muutub pidevalt, praegu ühendatakse nad ühte sugukonda
sarnaste seeneviirustega (Partitivirus, Chrysovirus). Krüptoviirused moodustavad sugukonnas
Partitiviridae kaks perekonda:
Alphacryptovirus. Tuntumad esindajad on white clover cryptic virus 1 (WCCV1) ja BCV.
Betacryptovirus. Tuntuim esindaja on white clover cryptic virus 2 (WCCV2).
Enam on uuritud perekonna Alphacryptovirus esindajaid.
Iga krüptoviirus on tuntud ainult ühest peremeestaime liigist. Viirus leidub kõigis taime osades,
koespetsiifilisus puudub. Unikaalseks jooneks on see, et krüptoviirustel puudub ka
transpordifunktsioon (puudub nii rakust-rakku kui ka süsteemne transport).
Krüptoviirustele on iseloomulik väga efektiivne ülekanne seemnetega ja tolmuteradega.
Igasugune muu (mehhaaniline-, vektor- ja pookimise jne kaudu toimuv) ülekanne puudub. Seni
pole teada ka liikumist rakust rakku, nakatatud rakkude arv suureneb rakkude loomuliku
paljunemise teel. Krüptoviiruseid on leitud paljudel õistaimedel (paljudel taimedel mitu erinevat
viirust) ja krüptoviiruste sarnaseid viirusi on kirjeldatud ka okaspuudel (nulg) ja merevetikatel.
2.1. Viron ja genoom
Alphacryptovirus ­ Genoomis on kaks dsRNA segmenti (2.0 ja 1.7 kbp), mõningail juhtudel ka
kolm segmenti. Virionid (30 nm) koosnevad ühest struktuurvalgust (55 kDa) ja virioniga on
seotud RdRp aktiivus
Betacryptovirus ­Genoomis on kaks segmenti (2.25 ja 2.1 kbp). Virionid (38 nm) sisaldavad
RdRp aktiivsust.
3
LIISI KINK
4
VIROLOOGIA
Genoomi segmentidel puudub omavaheline homoloogia v.a segmentide otstes (sarnaselt
reoviirustele). BCV kaks segmenti kodeerivad igaüks ühte valku (on monotsistroonsed) -
vastavalt 67 ja 52 kDa valke:
väiksem nendest kujutab endast kattevalku;
suurem on tõenäoliselt viiruse RdRp.
Krüptoviiruste replikatsioonitsükkel on arvatavasti väga sarnane teiste dsRNA genoomsete
viiruste replikatsioonitsüklile.
3. SUGUKOND REOVIRIDAE
Esimesed reoviirused (nimetus tuleneb sõnadest respiratory enteric, orphan viruses) eraldati
1959 aastal. Praeguseks kuulub sugukonda Reoviridae üheksa perekonda viiruseid, mis
nakatavad:
loomi: perekonnad Orthoreovirus, Rotavirus, Orbivirus, Coltivirus;
linde: perekonnad Orthoreovirus, Rotavirus, Orbivirus;
kalu ja molluskeid: perekond Aquareovirus;
putukaid: perekond Cypovirus
taimi: perekonnad Fijivirus, Oryzavirus, Phytoreovirus.
Sugukonda kuuluvad perekonnad erinevad teineteisest virionide mõõtmete, genoomi
segmentide arvu, struktuursete valkude arvu ja omaduste ning ülekande mehhanismide poolest.
Erinevusi on ka peremeesteringis ja viiruste põhjustatud patogeneesis.
Kõiki nendesse perekondadesse kuuluvaid viiruseid, sõltumata konkreetsest peremehest,
iseloomustavad:
sfäärilised, mitmest kontsentrilisest valgukihist koosnevad, membraanita virionid (60-
85 nm);
segmenteerunud dsRNA genoom, mis koosneb 10-12 segmendist;
tsütoplasmas toimuv replikatsioonitsükkel, mille jooksul ei toimu virioni täieliku
lahtipakkimist;
kõikide RNA sünteesiks vajalikke ensüümide kodeerimine ja asjaolu, et kõik RNA
sünteesid leiavad aset subviraalses partiklis.
4
LIISI KINK
5
VIROLOOGIA
3.1. PEREKOND ORTHOREOVIRUS
Siia perekonda kuulub rida imetajate (ja inimese) ning lindude viiruseid. Imetajate reoviirused
on reeglina vähepatogeensed ja jagatakse tinglikult:
mitte-fusgeenseteks viirusteks. Siia kuuluvad mitmed inimesi ja koduloomi nakatavad
viirused (nakatumine toimub enamasti suu kaudu);
fusogeenseteks viirusteks, mis põhjustavad nakatatud rakkude liitumist. Siia kuulub
Nelson Bay viirus, mis nakatab Austraalia lendrebased.
Lindude reoviirused on reeglina patogeensed ja põhjustavad enamuses nakatatud rakkude
liitumist (st. nad on fusogeensed viirused).
Reoviiruseid on leitud ka madudel. Enim on uuritud imetajate reoviiruseid, milliste uurimiseks
kasutatakse tänapäeval pöörgeneetikat (on olemas meetodid kloneeritud genoomi segmentidest
infektsioonilise viiruse rekonstrueerimiseks).
3.1.1. Virion
Reoviiruste virionide diameeter on ca 85 nm, ISVP-l (infectious subvirion particle) 80 nm ja
core-osakesel 60 nm. ISVP on
infektsioonilised ja erinevad
täielikest virionidest valgulise
koostise (ISVP-del puudub 3
valk) ning valkude
konformatsiooni poolest.
Virionid koosnevad kahest
kontsentrilisest ikosaeedrilisest
kapsiidikihist (välimine ja
sisemine kapsiid), mis
ümbritsevad dsRNA genoomi
(paikneb virioni keskses, 49 nm
diameetriga, regioonis).
Kapsiidis leidub kokku 132
funktsionaalselt tähtsat kanalit.
Välimine kapsiid
Välimine kapsiid kujutab endast mitteklassikalist T=13 ikosaeedrit ja koosneb 60-st valgu 2,
600-st valgu µ1, 36-st valgu 1 ja 600-st valgu 3 koopiast.
Reoviiruste väliskapsiidi valkude kohta on teada et:
µ1 valk on organiseeritud trimeeridena ja moodustab kapsiidi karkassi. Karkassis leidub
kahte tüüpi kanaleid (diameetrid 2.5-11 nm) mida nimetatakse P2 ja P3 kanaliteks.
Kumbagi kanalit on 60 koopiat ja nende funktsioon võib seisneda rakumembraani
läbimisel toimuva µ1 struktuurse ümberkorralduse võimaldamises;
5
LIISI KINK
6
VIROLOOGIA
3 valk seondub µ1 valguga (iga 3 subühik kontakteerub kolme µ1 subühikuga ja
stabiliseerib sellega kapsiidi) ning moodustab kapsiidi pinnal "sõrmede" struktuuri
(ulatuvad kapsiidi pinnalt esile 3.4 nm võrra);
2 valk moodustab core-struktuuri pinnalt väljaulatuvad "ogad" (2 pentameerid) ja
"asendab" T=13 sümmeetrias "puuduvat" 180-t µ1 subühikut (st. iga 2 monomeer
täidab virionis kolme µ1 valgu positsiooni). Kuna 2 on aktiivne ensüüm ja on seotud
core-struktuuriga, siis peetakse teda mõnikord ka sisemise kapsiidi valguks. Samas on
suur osa 2-valgust eksponeeritud kapsiidi pinnal. Iga 2 pentameeri sisemuses asub 8
nm diameetriga kanal (P1 kanal), mis võib olla teeks, mille kaudu sisenevad kapsiidi RNA
sünteesi substraadid ja mille kaudu väljub kapsiidist sünteesitav mRNA;
1 valgu trimeerid moodustavad 12 kapsiidist väljaulatuvat (kuni 40 nm võrra)
paindlikku "kiudu", mis on olulised virioni seondumisel rakkudele. Virionides ja ISPV-des
omab 1 (seondub 2-valguga) erinevaid konformatsioone.
Vahekiht
Reoviiruste virionide T=13 väliskapsiidi ja T=1 sisekapsiidi ühendavad 2- (vt. ülal) ja 2- (vt.
allpool) valgud. Need valgud (täpsemalt 2-valgu 1-valku siduv domään ja 2-valk)
moodustavad virionides mittetäieliku vahepealse valgukihi. See struktuur on oluline sise- ja
väliskapsiidi vahelisteks interaktsioonideks.
Sisemine kapsiid
Reoviiruste virionide sisemise kapsiid ruumiline struktuur on teada täpsusega 0.36 nm - tehtud
on röntgenstruktuur analüüs, mis on näidanud, et sisemine kapsiid omab ebatavalist T=1
sümmeetriat ja koosneb:
120-st 1-valgu subühikust (moodustavad 60 dimeeri, mis paiknevad T=1 sümmeetrias)
ja moodustavad sisemise kapsiidi karkassi;
150-st 2-valgu subühikust (60 koopiat ümbritsevad five-fold telgi, 60 koopiat asuvad
three-fold telgede lähedal ning 30 koopiat asuvad two-fold telgede tippudes), mis on
olulised 1 valgust koosneva karkassi stabiliseerimiseks.
1-ja 2-valgud on RNAd siduvad valgud ning kontakteeruvad viiruse genoomiga. Peale nende
leidub sisemises kapsiidis veel kaks minoorset valku, 3 (12 koopiat) ja µ2 (12 kuni 24 koopiat).
Minoorsed valgud paiknevad sisemise kapsiidi siseküljel (five fold teljel?). Sisemine kapsiid ei
sisalda kanaleid (v.a. five-fold telgede tippudes) ja kaitseb genoomi väliskeskkonna mõjude eest.
Core struktuur on ensümaatiliselt aktiivne ja sisaldab RdRp (polümeraasi), RNA trifosfotaasi ja
guanülüültransferaasi aktiivsusi ning kahte tüüpi metüültransferaasi (metüleerivad vastavalt G
jääki cap struktuuris ja RNA esimese nukleotiidi riboosi 2'-O positsioonis).
Peale valkude ja genoomse dsRNA leidub virionides veel kahte tüüpi RNA oligonukleotiide:
ca. 2400 koopiat nukleotiidi GC(U)(A) (2-9 nukleotiidi pikkune), mis kujutavad endast
abortatiivse transkriptsiooni produkte. Umbes 10% seda tüüpi oligonukleotiididest on
capeeritud;
6
LIISI KINK
7
VIROLOOGIA
ca. 850 koopiat oligoadenülaate (2-20 A jääki), mis on samuti sünteesitud viiruse
transkriptaasi poolt.
Oligonukleotiidide asukoht ja funktsioonid virionides on ebaselged (teada on see, et core-
struktuuris neid ei leidu).
3.1.2. Genoom
Reoviiruste genoomne dsRNA kujutab endast paremale keerduvat kaksikspiraali, milles ühe
pöörde kohta tuleb 10 bp. Reoviiruste genoom koosneb kümnest lineaarsest dsRNA segmendist,
mis suuruse järgi jagatakse kolme klassi: L, ca 3900 bp; M, ca 2250 bp; S, ca 1300 bp.
Igas virionis paikneb täielik, 10-st individuaalsest genoomsest segmendist (L1, L2, L3, M1, M2,
M3, S1, S2, S3, S4) koosnev komplekt. Igas genoomses dsRNA-s on:
positiivse ahela 5'-otsas paikneb cap-1 struktuur;
negatiivse ahela 5'-otsas asub mitte kolm vaid kaks fosfaati ja see ots on sageli
blokeeritud (blokeeringu tüüp teadmata);
nii positiivse kui ka negatiivse ahela 3'-otsad on polüadenüleerimata ja blokeerimata.
Reoviiruse prototüüp-tüve (T3D) genoom on täielikult sekveneeritud ja koosneb kokku 23,549
bp-st (individuaalsete segmentide pikkused on 3916 ja 1196 bp vahel). Enamus segmente on
monotsistroonsed ja sisaldavad ühte pikka lugemisraami (365-1289 koodonit), kaks segmenti
on bitsistroonsed:
segment on S1, mille mRNA-lt ekspresseeritakse alternatiivseid AUG koodoneid
kasutades kahte valku (kattuvad lugemisraamid, mis asuvad erinevates faasides);
segment M3 kodeerib kahte C-koterminaalset valku (nende AUG koodonid asuvad samas
lugemisraamis).
Seega kodeerib reoviiruse genoom kokku 12 valku, millest 8 on struktuursed (1, 2, 3, µ1, µ2,
1, 2 ja 3) ning neli mittestruktuursed (µNS, µNSC, NS ja 1s) valgud.
7
LIISI KINK
8
VIROLOOGIA
Kõikide segmentide 5'- ja 3'-mittetransleeritavad regioonid on suhteliselt lühikesed:
5' ­ NTR on 12 b (S1 segment) kuni 32 b (S4 segment) pikkune;
3' ­ NTR on 32 b (L1 segment) kuni 83 b (M1 segment) pikkune.
NTR regioonides paiknevad signaalid mRNA pakkimiseks ja replikatsiooniks ning ka aktiivseks
translatsiooniks (osaliselt ulatuvad need signaalid ka kodeerivasse regiooni).
Kõikide genoomsete segmentide terminaalsed järjestused on kogu perekonnas konserveerunud.
Kõikide positiivsete ahelate 5'-terminaalne järjestus on 5'-GCUA, kõikide positiivsete ahelate 3'-
terminaalne järjestus UCAUC-3'.
Ehkki reoviiruste genoomi äärmised terminaalsed järjestused ei ole teineteise suhtes
inverteeritud, moodustavad reoviiruse mRNAd (positiivsed ahelad) tänu 5'- ja 3'-otsade
läheduses asuvatele inverteeritud elementidele "panhandle" tüüpi tsirkulaarseid struktuure.
3.1.3. Valgud
Struktuursed valgud
Mitmetele reoviiruse valkudele on omased "topeltrollid" ­ virioni koostises kujutavad nad
endast struktuurseid valke; nakatatud rakus täidavad nad ka "mittestruktuurseid" (sageli
ensümaatilisi) funktsioone.
1 (142 kDa). Sisemise kapsiidi peamine struktuurvalk, interageerub 2 ja 3 valkudega
(sisekapsiid) ja 2 valguga (väliskapsiidist). sisaldab oma N-terminuses NTP-d siduvat motiivi ja
on ensümaatiliselt aktiivne ATPase, RNA-helikaas ja RNA- trifosfotaasi katalüütiline subühik.
Sisaldab ka Zn-sõrme struktuuri ja seob tsink-ioone (vajalik RNA-sidumiseks?).
2 (144 kDa). Väliskapsiidi valk (pentameerid), interageerub kõigi seitsme struktuurse valguga.
Oluline virionide väliskapsiidi moodustamises. On ensümaatiliselt aktiivne valk
(guanülüültransferaas), osaleb cap-sünteesis. Kaudsetel andmete põhjal on 2-valk ka reoviiruse
metüültransferaas (funktsionaalne on ainult 2 pentameer?), mis teostab mõlemad cap-
sünteesiks vajalikud metüleerimised (nende reaktsioonide jaoks on 2 valgus eraldi domäänid).
3 (142 kDa). Sisekapsiidi minoorne valk, interageerub 1 ja 2 valkudega, on ensümaatiliselt
aktiivne, RNA transkriptaasi katalüütiline subühik (sisaldab GDD motiivi). Oluline ka RNA
selektsiooni ja pakkimise protsessis.
µ1 (76 kDa). Väliskapsiidi peamine struktuurvalk (interageerub 2 ja 3 valkudega). µ1-valk
modifitseeritakse posttranslatsiooniliselt N-terminaalse müristüleerimise teel. µ1 on oluline
raku membraanide läbimiseks virionide poolt. µ1 valgule on iseloomulik intensiivne post-
translatsiooniline protsessing:
- Virionides kujutab enamus µ1 valgust (95%) endast protsessitud vormi µ1C
(eemaldatud on 42 N-terminaalset ah jääki, nn. µ1N peptiid (4.3 kDa), mis jääb samuti
virioni). See protsessing on autokatalüütiline ja leiab aset seoses partiklite
moodustamisega (seondumisel 3 valguga);
- peale selle esineb ka protsessing µ1 ja µ1C valkude C-terminaalses regioonis (seda
teostavad raku trüpsiin- või kemotrüpsiin proteaasid). µ1 ja µ1C protsessingu N-
terminaalseid produkte nimetatakse vastavalt µ1- ja -valkudeks, C-terminaalset
8
LIISI KINK
9
VIROLOOGIA
produkti aga -valguks (mõlemad jäävad virioniga seotuks). See protsessing leiab aset
kas endosoomides ja/või seedetrakti läbimisel ning on arvatavasti oluline viirus-
spetsiifilise transkriptsiooni aktiveerimiseks.
Peale protsessingu ja N-terminaalse müristüleerimise esinevad ka muud µ1-valgu
modifikatsioonid (O-glükosüleerimine, ADP-ribosüleerimine). Nakatatud rakus on µ1
tsütotoksiline valk, mis osaleb (koos 1-valguga) raku DNA sünteesi mahasurumisel ja rakkude
apoptoosi indutseerimisel.
µ2 (83 kDa). Sisekapsiidi minoorne valk, interageerub 2- ja 3-valkudega. µ2 on reoviiruse
RNA-polümeraasi koostisosa, mille funktsiooniks on 3-polümeraasile spetsiifilisuse andmine.
Osaleb ka RNA trifosfotaases reaktsioonis.
1 (ca 50 kDa). Kapsiidi minoorne komponent (interageerub valkudega 2 ja 3), moodustab
oligomeerseid fiibreid, reoviiruse antiretseptor ­ valgu "pea" (C-terminaalne domään) on
retseptorit siduvaks osaks; N-terminaalne regioon kinnitab valgu virionile.
Funktsionaalselt on 1 hemoglutiniin (seob glycophorin A külge kinnitunud siaalhappejääke).
Eksperimentaalsed andmed näitavad, et reoviiruse T3D hemoglutiniinina funktsioneerib mitte
1-valgu "pea" vaid valgu "saba" keskmises regioonis paiknev domään. Seega on reoviiruse T3D
1 valgus kaks erinevat raku faktoreid siduvat saiti ­ "pea" ja sabas asuv "hemoglutiniin-
regioon".
Peale "struktuursete rollide" on 1 seotud DNA sünteesi mahasurumise ja apoptoosi
indutseerimisega nakatatud rakkudes.
2 (47 kDa). Osaleb sisekapsiidi moodustamisel, interageerub µ1- ja 2- valkudega, seob nõrgalt
dsRNAd. 2-valk on oluline reoviiruse RNA sünteesiks ja virionide morfogeneesiks.
3 (41 kDa). On väliskapsiidi põhivalk (koos µ1-valgu ja selle proteolüüsi produktidega).
Interageerub 2-, µ1- ja 1-valkudega ning stabiliseerib kapsiidi. Infektsiooni algusel
eemaldatakse 3 kapsiidist proteolüüsi teel (happeliste endosoomi proteaaside poolt). Sisaldab
tsink-sõrmede struktuuri, võib olla seotud virionide varajase morfogeneesiga (seondab
järjestus-mittespetsiifiliselt dsRNAd). 3-valk osaleb ka raku RNA ja valgu sünteesi
mahasurumises (mõjutab valgusünteesi PKR inaktiveerimise kaudu) ning reguleerib viiruse
transkriptsiooni ja translatsiooni (muu hulgas stimuleerib reoviiruse hiliste, capeerimata,
mRNAde translatsiooni) .
Mittestruktuursed valgud
Reoviiruse poolt nakatatud rakkudes leidub kaks mazoorset mittestruktuurset valku: µNS (koos
oma isovormi µNSC'ga) ja NS. Need valgud võivad osaleda partiklite ja virionide morfogeneesil.
Peale nende esineb nakatatud rakkudes ka minoorne mittestruktuurne valk 1s, mis
transleeritakse S1 segmendi teiselt ORF-ilt.
µNS ja µNSC (80 kDa, µNSC on 5 kDa võrra väiksem - tal puudub N-terminaalne 42 ah
fragment). Mõlemad valgud seonduvad raku tsütoskeleti seondavad sellele viirus-spetsiifilisi
struktuure?) ja viiruse mRNA-ga. mRNA seondamine leiab aset varsti peale sünteesi, ning võib
olla seotud segmentide selektsiooniga (µNS jääb mRNAga seotuks kuni negatiivsete ahelate
9
LIISI KINK
10
VIROLOOGIA
sünteesini). µNS leidub ka vastmoodustunud partiklites (osaleb väliskapsiidi moodustumisel?
reguleerib sekundaarset transkriptsiooni?).
NS (41 kDa). Cys-rikas RNAd siduv valk. Seondub viiruse mRNAdega (varsti peale nende
sünteesi), mõjutab nende translatsiooni ja võib olla seotud segmentide selektsiooni ning
partiklitesse pakkimisega.
1s (14-15 kDa). Aluseline valk, võib siduda nukleiinhappeid. Lokaliseerub nii tsütoplasmas kui
ka rakutuumas (tuumakeses). Võib osaleda raku DNA sünteesi mahasurumises ja tsütopaatiliste
efektide tekkimises (see efekt on detekteeritav ainult nakatatud, mitte transfitseeritud,
rakkudes).
3.1.4. Seondumine retseptorile ja sisenemine rakku
Reoviiruse antiretseptor on 1 valk (hemoglutiniin). Interaktsioon raku poolse retseptoriga pole
kõrge spetsiifilisusega, tänu millele seonduvad reoviirused väga erinevaile rakkudele.
Põhimõtteliselt võib reoviiruse retseptoriks olla iga makromolekul, millel on olemas siaalhappe
grupid, kuid arvatakse, et reaalsed retseptorid kujutavad endast glükoproteiine, mis
võimaldavad viiruse kaheetapilist seondumist:
1) esmalt toimub reoviiruse antiretseptori seondumine siaalhappe jäägile;
2) järgneb seondumine spetsiifiliste valk-valk interaktsioonide kaudu (selles osaleb
antiretseptori "pea"-struktuur).
Seega on võimalik, et retseptori seondamises osalevad erinevad 1 valgu domäänid (vt. ülal).
Funktsionaalsete retseptoritena on reoviiruse peremeesrakkudel seni identifitseeritud mitmed
(afiinsuse poolest erinevaid) retseptori kandidaate:
kõige kõrgema afiinsusega on 67 kDa glükoproteiin (sarnaneb struktuurilt -
adrenergilise retseptoriga);
teised glükoproteiinid (EGF-retseptor (54 kDa), 47 kDa glükoproteiin) on madalama
afiinsusega.
Reoviiruse sisenemine rakku toimub clathrin'ist sõltuva retseptor-vahendatud endotsütoosi teel
(ca. 20-30 min. peale infitseerimist). Viirus sattub moodustuvatesse endo- ja lüsosoomidesse,
milles toimub pH taseme langus. pH langusega endosoomis kaasneb reoviiruse virioni valkude
proteolüüs raku happeliste proteaaside poolt:
1) 3 valgu degradeerumine;
2) valk 1 eraldub partiklist;
3) µ1C valgu protsessing -produktiks.
Proteolüüsi tulemusena moodustuvad virionist partiklid, mis on väga sarnased ISVP-dele.
Proteolüüs on vajalik (selle puudumisel on infektsioon blokeeritud), kuna selle käigus toimub
virionide aktiveerumine, mis on omakorda tarvilik interaktsiooniks endosoomi membraanidega
ja viiruse sisenemiseks tsütoplasmasse.
Mõningatel juhtudel võib vastav proteolüüs toimuda ka väljaspool rakku (selle võib kunstlikult
läbi viia ka in vitro). Selliselt töödeldud viirus suudab tungida rakku ilma endotsütoosita (otse
10
LIISI KINK
11
VIROLOOGIA
läbi plasmamembraani), kuna membraaniga interageeruvad ainult ISVP-d (või proteolüüsi läbi
teinud virionid), kuid mitte terviklikud virionid ega "core"-partiklid.
Interaktsioon peremeesraku membraanidega toimub välimise kapsiidivalgu µ1 kaudu (N-
terminus on müristüleeritud, sisaldab amphipaatilisi heelikseid). Täpne tsütoplasmasse
sisenemise mehhanism on teadmata. Oletatakse et ISVP interaktsioon membraaniga viib
membraani lokaalse katkestuse tekkimiseni, või viiruse valgud moodustavad membraanis poori
taolise struktuuri. Läbi selliste struktuuride (kumb mudel on õige pole veel teada) tungib rakku
partikkel, mis koosneb "core" osakesest ja järelejäänud välimise kapsiidi valkudest (2-, -valk).
11
LIISI KINK
12
VIROLOOGIA
3.1.5. Transkriptsioon
Reoviiruse transkriptaas (polümeraasi katalüütiline subühik on 3-valk, RNA helikaas on 1-
valk) kuulub viiruse core-partiklisse ja toodab üheahelalisi mRNAsid, mis vabanevad
tsütoplamasse. Transkriptsioon on konservatiivne ja asümmeetriline, sünteesitavad mRNAd on
genoomi positiivse ahela identsed koopiad:
3'-polü(A) struktuur puudub;
5'- otstes on spetsiifiline cap1-struktuur, mille sünteesivad "core" partiklis asuvad
ensüümid (1 ­ trifosfotaas, 2 guanülüül- ja metüültransferaas).
Reoviiruste cap-sünteesi esimesed neli reaktsiooni on samad kui raku cap-sünteesil (vt. loeng
15), kuid peale cap-0 struktuuri moodustumist toimub selle täiendav metüleerimine G-jäägi
riboosi kohal (2'-O-metüleerimine, katalüüsitud samuti 2 valgu poolt):
AdoMet + m7GpppGpC.... m7GpppGm2pC... + AdoHcy
Hiljem võib toimuda (nüüd juba raku tsütoplasmaatilise metüültransferaasi poolt!) ka C-jäägi
riboosi 2'-O-metüleerimine.
Capeerimine ei ole transkriptsiooniga jäigalt seotud (ensüümid 1 RNA-trifosfotaas ja 2 MT/GT
on aktiivsed ka eraldivõetutena). Samas on teada, et virionides asuvad kõik mRNA sünteesi
ensüümid "core" struktuuri kindlates kohtades (five-fold telje läheduses, seega on virionis kokku
12 sellist kompleksi) ja seepärast on kõik mRNA sünteesi reaktsioonid koordineeritud: nt.
toimub capeerimine juba siis, kui sünteesitav transkript on alles 2-15 b pikkune. mRNAd
väljuvad kapsiidist 2 valgust koosnevates "ogades" paiknevate P1-kanalite kaudu.
Transkribeeritakse kõik 10 segmenti, erinevate mRNAde sünteesi proportsioonid on ligikaudu
pöördvõrdelised vastavate segmentide pikkustele. Seetõttu arvatakse, et kõik segmendid
transkribeeritakse teineteisest sõltumatult. Tõenäoliselt teostab transkriptsiooni paigalseisev
transkriptsioonikompleks (st. RNA liigub läbi transkriptaasi).
Transkriptaasi aktiveerimine
Reoviiruse virionid ei ole võimelised mRNAde sünteesiks, vaid ainult abortatiivseks
transkriptsiooniks (ja capeerimiseks). Rakku sisenemisele järgnev transkriptaasi aktiveerumine
on seotud elongatsiooni blokeerimise mahavõtmisega: kõige tõenäolisemaks aktivatsiooni
mehhanismiks peetakse dsRNA liikumisvabaduse võimaldamist ümber-korraldatud kapsiidis.
See aktiveerumine toimub arvatavasti kahes etapis:
1) Virionide proteolüüs (µ1 valgu protsessing ja eemaldamine virionidest rakku sisenemise
käigus) ning ISVP-laadse partikli moodustumine.
2) Proteaas-sõltumatu aktiveerumine (2 konformatsiooni muutumine, mis avab five-fold
teljel asuva kanali?), mis leiab aset partikli sisenemisel tsütoplasmasse.
Varajane transkriptsioon leiab aset rakku tunginud virionist pärinevates subviraalsetes
partiklites (kas see on core struktuur või ISVP-sarnane partikel pole veel teada). Varajane
transkriptsioon on detekteeritav umbes 2 tundi peale infektsiooni, saavutab maksimumi 6-8
12
LIISI KINK
13
VIROLOOGIA
tundi peale infektsiooni ja langeb allapoole detekteeritavat taset ca 12 tundi peale infektsiooni
algust.
Varajased transkriptsiooni produktid on üheaegselt nii:
- translatsioonil mRNAdeks (varajased mRNAd on capeeritud) kui ka
- maatriksiks negatiivse ahela sünteesil (see protsess toimub uutes kapsiidides!).
Sageli (kuid mitte alati) täheldatakse kõigepealt nn. "varajaste" transkriptide (L1, M3, S3 ja S4)
sünteesi ja mõningatel juhtudel on täheldatud, et ülejäänud kuue transkripti süntees on sõltuv
"varajaste segmentide" poolt kodeeritud valkude sünteesist (see seisukoht on küsitav).
3.1.6. Primaarne translatsioon
Viirus-spetsiifiliste valkude süntees on nakatatud rakkudes detekteeritav ca 2 tundi peale
infitseerimist. Samaaegselt algab raku translatsiooni mahasurumine, umbes 10 tundi peale
infitseerimist sünteesitakse nakatatud rakus ainult reoviiruse valke.
Erinevalt varajasest transkriptsioonist on viiruse mRNAde translatsioon reguleeritud: erinevate
mRNAde translatsioonitasemed on väga erinevad (erinevad teineteisest kuni 30 korda):
- kõige aktiivsemalt transleeritakse segmentide S4, M2, S2, S3 mRNAsid;
- kõige vähem transleeritakse segmentide S1, L1 ja M1 mRNAsid.
Sellised erinevused tulenevad:
1) Initsiaatorkoodonite erinevast kontekstist (-3 ja +4 positsioonid).
2) Muude cis-järjestuste (positsioonid ­8, -1 kuni ­3) mõjust.
3) Mittetransleeritava liidri erinevast pikkusest (kõige aktiivsemalt transleeritavatel
mRNAdel on kõige pikemad 5'-NTR regioonid) ja selle sekundaarstruktuurist
(juuksenõela struktuur alandab translatsiooni efektiivsust).
Võimalik, et translatsiooni reguleerivad ka raku negatiivsed regulaatorid. Viimastest osaleb
sellises regulatsioonis tõenäoliselt raku PKR (fosforüleerib eIF-2 valku ja blokeerib sellega
translatsiooni initsieerimist). Sellele blokeeringule seisab vastu reoviiruse dsRNAd siduv valk
3, mis lokaalsetes kompartmentides (viiruse translatsiooni saitides) seob ise dsRNAd ja väldib
sellega PKR aktiveerumist.
3.1.7. Sekundaarne translatsioon
Uued dsRNAd, mis asuvad uutes subviraalsetes partiklites (sekundaarsed transkriptsioonilised
partiklid) on maatriksiks uue põlvkonna mRNA-de sünteesile (nn. hilised mRNAd, moodustavad
95% reoviiruse poolt sünteesitavatest mRNAdest). Hilised mRNAd on detekteeritavad 4-6 tundi
peale infektsiooni ja nende sünteesi maksimum on ca 12 tundi peale infektsiooni.
Reoviiruse hilised mRNAd on sageli capeerimata (sekundaarset transkriptsiooni teostavates
partiklites asuv capeerimise-kompleks on arvatavasti latentses seisundis), kuid sellele
vaatamata transleeritakse neid efektiivselt. Raku translatsiooni mahasurumine reoviiruse poolt
võib:
13
LIISI KINK
14
VIROLOOGIA
põhineda raku mRNAde väljatõrjumisel translatsioonikompleksist enam aktiivsete
viiruse mRNAde poolt;
reoviiruse hilises infektsioonis toimub raku cap-sõltuva translatsiooni ümberlülitus cap-
sõltumatule translatsioonile (annab eelised viiruse hilistele capeerimata
transkriptidele).
3.1.8. Replikatsioon
Reoviiruse RNA replikatsioon leiab aset moodustunud core-partiklis. Iga pakitud mRNA on
maatritsiks täispika negatiivse ahela sünteesile, igal mRNAl sünteesitakse ainult üks negatiivne
ahel. Seda reaktsiooni teostab partiklis asuv RNA polümeraas.
3.1.9. Virionide moodustamine ja vabanemine
Segmentide sorteerimine ja pakkimine
Reoviiruse virioni pakkimisvõime on piiratud kümne segmendiga. Kuna reoviiruse virione
teadud viisil töödeldes on võimalik saavutada PFU:partikel suhe ligikaudu 1:1, siis peab igas
partiklis asuma terviklik genoom. Mehhanism, mille abil virioni pakitakse üks koopia igast
genoomi segmendist, seni veel ebaselge.
On teada, et segmentide sorteerimine ja pakkimine leiab aset mRNA tasandil (enne negatiivsete
ahelate sünteesi). mRNAde selekteerimine toimub tõenäoliselt viirus-spetsiifiliste cis-signaalide
(mis on igas mRNAs unikaalsed?) äratundmise teel:
need signaalid asuvad mRNA 5'- ja 3'-terminaalsetes regioonides (ca 190 b, k.a.
inverteeritud järjestused, mis võivad moodustada "panhandle" struktuuri);
oluline osa pakkimissignaalist võib olla ka 5'-cap struktuur (pakitakse ainult cap1-
struktuuriga mRNA-sid, mitte capeerimata või cap2-struktuuridega mRNAsid).
Viiruse valkudest on sorteerimisel ja pakkimisel tõenäoliselt olulised mRNA-sid siduvad valgud:
esialgu seonduvad mRNAdele reoviiruse µNS ja/või 3 valgud;
hiljem seondub ka NS valk.
Moodustuvate komplekside proportsioonid vastavad mRNA sünteesi proportsioonidele. Samas
on moodustunud partiklites, kus toimub replikatsioon, kõik segmendid esindatud ühe koopiaga,
seepärast oletatakse, et sorteerimisel võib osaleda ka 3 valk (RNA polümeraas).
Virionide moodustumine ja vabanemine rakust
Reoviiruse virionide moodustumine on keerukas ja paljuski veel ebapiisavalt uuritud protsess.
Uurimine on näidanud et:
kõige varajasemad detekteeritavad reoviiruse partiklid sisaldavad tõenäoliselt vaid
mRNAsid, 3 valku ja mittestruktuurseid valke µNS ja NS;
14
LIISI KINK
15
VIROLOOGIA
järgnevalt kõrvaldatakse moodustuvatest virionidest mittestruktuursed valgud,
moodustub osaliselt välimine kapsiid. Sellised partiklid on replikatsiooniliselt aktiivsed
(st. sisaldavad polümeraasi kompleksi valke);
negatiivse ahela sünteesi järel toimub kapsiidi konformatsiooniline muutus, seejärel
lisanduvad virionile uued väliskapsiidi valgud;
toimub virion-spetsiifiliste oligonukleotiidide süntees (arvatavasti on see seotud
transkriptaasi aktiivsuse mahasurumisega valminud väliskapsiidi poolt).
Pole teada, kas partiklid, milles toimub sekundaarne transkriptsioon, moodustavad hiljem
valmis virione või moodustuvad virionid ainult sekundaarses transkriptsioonis mitte osalenud
partiklitest.
Valminud virionid vabanevad nakatatud rakkude lüüsimisel (purunemisel); pungumist ja
vesikulaarset transporti reoviiruse puhul ei tunta.
Reoviiruse genoomi plastilisus
Uute omadustega reoviiruse genoomid moodustuvad:
1) RNA polümeraasi poolt tehtavate kopeerimisvigade tulemusena.
2) Väga oluliseks mehhanismiks on (nagu ka teiste segmenteeritud genoomiga viirustel, nt.
gripiviirusel) segmentide ümbersorteerimine (esineb lähedaste viiruste ko-infektsiooni
korral, vt. loeng 19).
3) RNA süntees partiklites vähendab oluliselt (või isegi välistab) genoomide vahelise RNA
rekombinatsiooni toimumist reoviiruse replikatsiooni-protsessis.
3.1.10. Infektsiooni mõju peremeesrakule
Reoviiruse infektsiooniga kaasneb nakatatud rakkudes tüüpiliste, membraanidega mitteseotud
inklusioonide (neid nimetatakse viirus-vabrikuteks või viroplasmadeks) moodustumine.
Viroplasmades paiknevad dsRNA, viiruse valgud ning osaliselt ja täielikult formeerunud
partiklid.
Reoviiruse infektsioon mõjutab raku vahepealseid filamente (reoviiruse µNS seondab
vimentiini), kuid mitte aktiin/tubuliin filamente. Vimentiin-filamendid inkorporeeritakse
viroplasmadesse ja see võib olla viiruse replikatsiooniks oluline; vimentiin-filamentide
ümberkorraldamine on ka üks reoviiruse põhjustatud tsütopatoloogia põhjustest.
Peremehe makromolekulide sünteesis mõjutamine
DNA-sünteesi mahasurumine nakatatud rakkudes leiab aset 8-12 tundi peale infektsiooni. See
saavutatakse rakutsükli blokeerimise teel. DNA sünteesi blokeerimine toimub retseptor-seotud
signaaliülekandetee kaudu ja selles osalevad arvatavasti nii 1- ja 1s-valgud kui ka viirus
tervikuna (1- ja 1s-valkude transientsest ekspressioonist rakus raku DNA sünteesi
mahasurumiseks ei piisa).
15
LIISI KINK
16
VIROLOOGIA
1- ja 1s-valgud on ka peamised kandidaadid reoviiruse poolt põhjustatud apoptoosi tekitaja
kohale. Sellele vaatamata ei ole apoptoosi indutseerimine otseselt seotud peremehe DNA
sünteesi mahasurumisega vaid on sellest sõltumatu ning kulgeb caspaas-8 aktiveerimise kaudu.
Seni ei ole leitud, et reoviirused kodeeriksid apoptoosi inhibeerivaid valke. Viiruse indutseeritud
apoptoos on osa reoviiruse patoloogiast ning võib olla oluline virionide vabanemiseks nakatatud
rakust.
Raku RNA ja valkude sünteesi mahasurumine vajab viiruse replikatsiooni ja viiruse valkude
sünteesi toimumist. On andmeid valgu 3 osalemisest nendes mahasurumise protsessides
(toime-mehhanism on teadmata, kuid võib oletada translatsiooni mõjutamist dsRNA poolt
aktiveeritud PKR vahendusel, vt. ülal).
Andmed raku translatsioonisüsteemi mõjutamisest reoviiruse poolt on vastukäivad:
- mõned andmed näitavad, et hilises infektsioonis toimub üleminek cap-sõltumatule
translatsioonile. Samas on vähemalt mõnedel juhtudel näidatud, et reoviiruse poolt
nakatatud rakkude ekstraktid on võimelised transleerima capeeritud mRNA-sid;
- on andmeid, et reoviirus mitte ei blokeeri capeeritud mRNAde translatsiooni, vaid
kodeerib mingit faktorit (tõenäoliselt on selleks 3 valk) mis soodustab capeerimata
mRNAde transleerimist;
- samuti on võimalik, et reoviiruse hiliste mRNAde eelistatud translatsioon tuleneb
sellest, et need RNA-d tõrjuvad raku mRNAd polüsoomidelt välja (on tugevad
translatsioonilised maatritsid).
Peremehe poolsed kaitsemehhanismid
Ehkki reoviiruse dsRNA paikneb alati partiklites toob reoviiruse infektsioon kaasa nakatatud
rakkude poolse interferoonide sünteesi ja eraldamise. Võimalik, et see on seotud viiruse
mRNAdes asuvate dsRNA segmentidega. Peale selle on interferooni sünteesi indutseerimisel
oluline roll ka virioni valkudel (2, µ2, 2).
Interferoonid mõjutavad reoviiruse replikatsiooni mitmete mehhanismide kaudu:
- PKR aktivatsiooni kaudu (sellele seisab vastu reoviiruse 3-valk, vt. ülal);
- 2'-5'A/RNAse L süsteemi kaudu. Ka sellele süsteemile võivad vastu seista viiruse poolsed
mehhanismid: on teada, et mitmed reoviirused võivad efektiivselt replitseeruda
interferoonidega töödeldud rakkudes.
3.2. PEREKOND ROTAVIRUS
Rotaviirused on olulised inimese patogeenid, mille arvele langeb suurem osa laste (palju
harvemini täiskasvanute) raske viirusliku gastroenteriidi juhtumitest. Esimene inimese
rotaviirus kirjeldati 1972 aastal, loomade rotaviirused olid tuntud juba varem. Tänapäeval
klassifitseeritakse tuntud rotaviirused seitsmesse alagruppi (A kuni G):
16
LIISI KINK
17
VIROLOOGIA
- kolme alagruppi (A, B, C) kuuluvad nii inimese kui ka loomade rotaviirused;
- ülejäänud nelja alagruppi (D, E, F, G) kuuluvad praegusel ajal ainult loomade rotaviirused.
Alagrupid jagunevad omakorda serotüüpideks. Kõige enam on uuritud A alagrupi rotaviiruseid,
kuna nad paljunevad kõige paremini rakukultuuris.
3.2.1. Virion
Rotaviiruste virion meenutab pealtvaates ratast (ladina keeles rota, siit ka perekonna nimetus)
ja omab diameetrit 76 nm. Virion omab pseudo T=13 sümmeetriat (väliskiht) ning koosneb
kuuest struktuurvalgust (VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 ja VP7), mis moodustavad kolmekihilise
kapsiidi:
1. Sisemine kiht koosneb:
- 120-st VP2 subühikust, mis omakorda moodustavad 60 dimeeri (T=1 sümmeetria).
Sisemine kiht koos pakitud dsRNA genoomiga moodustab nn. single-layered particle
struktuuri.
- Selle struktuuriga ga assotsieeruvad valgud VP1 (transkriptaas) ja VP3 (GT/MT), mis
asuvad "core" sisemuses.
Seega, erinevalt reoviirustest, asuvad kõik rotaviiruste ensüümid "core" struktuuris
(reoviiruste MT/GT - 2 on väliskapsiidi valk).
2. VP6 (780 subühikut, moodustavad 260 trimeeri) moodustab vahepealse kihi (T=13).
Partikleid, milles on olemas sisemine ja vahepealne kiht nimetatakse double-layered
particle'ideks (diameeter 70 nm) ja sellised partiklid on transkriptsiooniliselt aktiivsed.
3. Väliskihi moodustavad:
- VP7 (780 subühikut, trimeerne glükoproteiin) ja
- VP4 (120 subühikut). VP4 dimeerid moodustavad virioni pinnal 60 "oga" (pikkusega ca
10 nm).
Rotaviiruse kapsiidis paikneb ka 132 kanalit (kokku 3 tüüpi, 12 + 60 + 60). I-st tüüpi kanalid
(neid on 12) asuvad ikosaeedri tippudes ja on olulised RNA-metabolismiks (substraatide ja
kofaktorite juurdepääs kapsiidis asuvale polümeraaskompleksile). Nende kanalite kaudu toimub
ka sünteesitava mRNA väljumine kapsiidist.
17
LIISI KINK
18
VIROLOOGIA
3.2.2. Genoom
Genoomis on 11 dsRNA segmenti (667-3302 bp), kokku on genoomi mõõtmed ca 18.5 kbp.
Täielikult on sekveneeritud inimese rotaviiruse K8 ja mitmete teiste rotaviiruste (SA11, Rf)
genoomid. Segmentide organisatsioon sarnaneb reoviiruse genoomi segmentidele:
- lühikesed NTR-id;
- enamasti on segmendis ainult üks ORF.
Konserveerunud terminaalsed konsensused on (positiivset ahelat pidi vaadatuna):
5'-UGU....GACC-3'
Kümme rotaviiruste genoomset segmenti on mono- ja üks (segment 11) bitsistroone.
Mittekodeerivate järjestuse funktsioonid on sarnased reoviirustele (neis paiknevad
transkriptsiooni, replikatsiooni ja pakkimise signaalid), peale selle on leitud, et iga segmendi
positiivse ahela 5'-NTR-is (täpsemalt selle 5'-otsas) asub ka translatsiooniline enhanser.
18
LIISI KINK
19
VIROLOOGIA
3.2.3. Valgud
Struktuursed valgud
Rotaviirused kodeerivad kuute struktuurset ja kuute mittestruktuurset valku. Struktuursete
valkude (tähistatakse VP1 ­ 6, virion protein) funktsioonidest on teada et:
- VP1 on rotaviiruse RdRp; seondab järjestus-spetsiifiliselt viiruse RNAd;
- VP2 (core struktuuri peamine valk) on järjestus-mittespetsiifiliselt RNA-d siduv valk, mis on
vajalik replikatsiooniks ja võib olla ka segmentide sorteerimiseks;
- VP3 on GT/MT (cap-sünteesi ensüüm).
Vähemalt üks rotaviiruse "core" struktuuri valk (siiani ei ole teada, milline nendest) omab
arvatavasti ka RNA-trifosfataaset, NTP-aaset ja RNA helikaaset aktiivsust.
- VP4 on partikli väliskihi valk, üks rotaviiruse peamisi antigeene. Funktsionaalselt on VP4
hemoglutiniin ja rotaviiruse antiretseptor. Virioni valgud VP5* ja VP8* on VP4
lõikamisproduktid (lõikamist teostavad raku trüpsiin-tüüpi proteaasid). Nagu ka
reoviirustel, on ka rotaviirustel kapsiidi valgu proteolüüs oluline virionide rakkudesse
sisenemiseks (kuid mitte rakkudele seondumiseks);
- VP6 on rotaviiruste virionide üks peamisi struktuurvalke, interageerub VP4 ja VP7
valkudega ning VP2 "core" valguga. VP6 on vajalik transkriptaasi aktiivsuseks (pole teada
kas VP6 omab ise ensümaatilist aktiivsust või ainult hoiab funktsionaalset transkriptaasi
koos);
- VP7 on virioni väliskihi glükoproteiin. Tänu VP7 N-terminaalsele membraan-seondumise
signaalile (50 ah jääki) toimub selle valgu süntees ER membraanidel, mistõttu toimub VP7
ko-translatsiooniline N-glükosüleerimine (erinevate rotaviiruste VP7 sisaldab 1-3
glükosüleerimise saiti). Ka peale signaaljärjestuse eemaldamist jääb VP7, kuna ta sisaldab ka
ER-is püsimise signaali, ER membraanidega seotuks.
Mittestruktuursed valgud
Mittestruktuursed valgud (puuduvad valmis virionides, tähistatakse NSP1 - 6) osalevad kas
replikatsiooni protsessis (NSP1, 2, 3, 5, 6; seondavad kõik nukleiinhappeid) ja/või virionide
moodustamisel (NSP4):
- NSP1 on vähe konserveerunud valk mis ei ole replikatsiooniks (rakukultuuris) absoluutselt
vajalik;
- NSP2 on oligomeerne NTP-aas, lokaliseerub viroplasmades (täpsemalt, NSP2 on koos NSP5
ja NSP6-ga vajalik ja piisav viroplasmade moodustamiseks), võib osaleda RNA pakkimisel;
- NSP3 toimib sarnaselt raku polü(A)-d siduvale valgule ja on oluline rotaviiruse mRNA
translatsiooniks:
a. NSP3 seob ühelt poolt viiruse RNA 3'-otsi (täpsemalt nelja 3'-terminaalset alust) ja
teiselt poolt transkriptsioonifaktorit eIF-4G;
b. tänu rotaviiruse mRNA 5'- ja 3'- otste omavahelisele interaktsioonile (tuleneb nendes
leiduvatest inverteeritud järjestustest) aktiveerib NSP3 poolne eIF-4G sidumine viiruse
mRNAde translatsiooni;
19
LIISI KINK
20
VIROLOOGIA
c. samal ajal surub NSP3 maha peremehe mRNAde translatsiooni (samuti eIF-4G sidumise
tõttu).
- NSP4 on glükoproteiin (homotetramer), mis transpordib subviraalseid partikleid (double-
layered particles) läbi ER membraanide; sellega kaasneb ajutise membraani omandamine ja
hiljem selle eemaldamine (ka selles osaleb NSP4).
Peale selle toimib NSP4 kui rotaviiruse enterotoksiin (moduleerib kaltsiumi ja kloori ioonide
eraldumist ning glükoosi omastamist rakkude poolt). NSP4 poolt tekitatud efekt on sõltuv
viiruse peremeesorganismi vanusest: see on seotud spetsiifilise CFTR kanali puudumisega
noorte peremeeste rakkudel (katseliselt on seda seost tõendatud CFTR knock-out hiirtega);
- NSP5 on fosforüleeritud (autokinaas) ja O-glükosüleeritud valk, interageerub NSP2 valguga,
lokaliseerub viroplasmades;
- NSP6 (mõnedel rotaviirustel see valk puudub) interageerub NSP5 valguga ja lokaliseerub
viroplasmades.
3.2.4. Seondumine retseptorile ja sisenemine rakku
Rakule seondumiseks kasutatakse:
- siaalhapet sisaldavat retseptorit (osa rotaviiruseid). Võimalik, et nende viiruste puhul
kujutab seondumine siaalhappe jäägile rakule seondumise esimest etappi ning sellele
järgnevad interaktsioonid teiste retseptoritega;
- mingit muud, siiani identifitseerimata retseptorit (suurem osa inimese rotaviiruseid).
Võimalik, et ka nende rotaviiruste seondumine rakule on mitmeastmeline protsess, mille
käigus leiavad aset interaktsioonid erinevate retseptoritega.
Rotaviiruse antiretseptor on VP4 (hemoglutiniin), kuid seondumises rakule osaleb ka VP7
glükopropteiin (seondab teist retseptorit?).
Rakku ja tsütoplasmasse sisenemise mehhanismid on rotaviirustel sarnased reoviiruste
vastavatele mehhanismidele, v.a. asjaolu, et rotaviiruste sisenemine endosoomidest
tsütoplasmasse on pH-sõltumatu. Selle asemel on sisenemine rakku sõltuv Ca2+ ioonidest:
endosoomides valitseval madalal Ca2+ kontsentratsioonil toimub rotaviiruse virioni väliskihi
dissotsieerumine.
3.2.5. Transkriptsioon
Transkriptsioon on sarnane reoviirustele:
- transkriptsioon aktiveerub virioni väliskihi eemaldamisel;
- virionis sisalduvad samad ensümaatilised aktiivsused;
- RNA replikatsioon ja sekundaarne transkriptsioon leiavad aset moodustunud partiklites, mis
lokaliseeruvad viroplasmades. Nendes partiklites osalevad peale "core" valkude ka NSP2,
NSP3 ja NSP5 valgud (hiljem tõrjutakse NSP valgud partiklitele lisanduvate VP2 ja VP6
valkude poolt välja).
20
LIISI KINK
21
VIROLOOGIA
3.2.6. Translatsioon
Translatsioon toimub enamike valkude puhul vabadel ribosoomidel. Vaid kaks valku, VP7 ja
NSP4 (rotaviiruse glükoproteiinid) transleeritakse ER ribosoomidel ja seonduvad ER-
membraanidega (nende valkude N-terminustes on vastav signaal).
3.2.7. Replikatsioon
Suurem osa rotaviiruste replikatsioonitsüklit puudutavast informatsioonist on saadud ahv
neerurakkude kultuuri kasutades. Nendes rakkudes on rotaviiruse replikatsioonitsükkel kiire
(10-12 tundi) samal ajal kui soolerakkudes (loomulikud peremeesrakud) on
replikatsioonitsükkel veidi aeglasem (kestab ca 24 tundi). Rotaviiruste replikatsiooniprotsessi
iseloomustab viirus-spetsiifiliste struktuuride ­ viroplasmade ­ moodustumine nakatatud
rakkudes (nendes moodustuvad uued subviraalsed partiklid)
3.2.8. Virionide moodustamine ja vabanemine
Rotaviiruse virionide moodustumine on erinevalt reoviirustest seotud membraanidega.
Subviraalsed partiklid (double-layered particles) moodustuvad viroplasmas ja punguvad läbi ER
membraani, omandades ajutise membraani. See toimub tänu VP6 interaktsioonile
membraanides asuva NSP4 valgu tsütoplasmaatilise (C-terminaalse) domääniga. Järgnevalt
ajutine membraan eemaldatakse ja asendatakse valgukihiga (virioni väliskiht, VP4 ja VP7). VP7
seondamine (ER-ist virionidele) sõltub Ca2+ ioonidest (Ca2+ puudumisel virionide väliskiht ei
moodustu).
Virionide vabanemine võib toimuda sarnaselt reoviirustele rakkude lüüsimisel. Andmed
rotaviiruse infektsioonist polaarsetes epiteelrakkudes lubavad aga oletada, et eksisteerib ka
alternatiivne viiruse vabanemise tee ­ vabanemine mittestandardse vesikulaarse transpordi
abil.
3.2.9. Infektsiooni mõju peremeesrakule
Rakukultuuris (mittepolariseeritud rakkudes) on rotaviirused tsütotoksilised, kuid kas see on
sama moodi ka loomulikus infektsiooniks (seal on rotaviiruse peremeesrakkudeks
polariseeritud peensoole epiteeli rakud) ei ole päris selge. Tsütotoksilisus tuleneb:
- rotaviiruse mõjust peremeesraku biosünteesidele ­ sarnaselt reoviirusele inhibeerivad ka
rotaviirused raku DNA, RNA ja valkude sünteesi;
- NSP4 valgu toimest (mõjutab Ca2+ ja Cl- ioonide kontsentratsiooni rakus).
Rotaviiruse infektsiooniga rakus kaasnevad ka struktuursed ümberkorraldused:
- toimub vimentiin-tsütoskeleti ümberkorraldamine;
- moodustuvad viirus-spetsiifilised struktuurid ­ viroplasmad.
21
LIISI KINK
22
VIROLOOGIA
3.3. PEREKOND ORBIVIRUS
Orbiviirused on tähtsad koduloomade (bluetongue virus, BTV) või suhteliselt vähetähtsad
inimeste (Great Island virus) nakkushaiguste tekitajad. Orbiviiruste põhjustatud haiguseid
iseloomustavad nakatunute kõrge suremus ja suur tekitatud majanduslik kahju (ehkki
orbiviirused võivad põhjustada ka sümptoomideta infektsioone). Seetõttu olid orbiviirused
ajalooliselt ühed esimesed kirjeldatud loomaviirused üldse (esmakordselt kirjeldatud aastal
1900).
Erinevalt reo- ja rotaviirustest omavad orbiviirused lülijalgset vektorit (moskiitod, puugid).
Praeguses süstemaatikas eristatakse 19 orbiviiruste gruppi (liiki), mis omakorda jagunevad
paljudeks serotüüpideks. Enim on uuritud BTV (perekond Orbivirus tüüpesindaja, teada on 24
erinevat BTV serotüüpi) molekulaarbioloogiat ja virionide struktuuri.
Veel üheks lülijalgset vektorit omavaks sugukonna Reoviridae perekonnaks on coltiviirused
(Colorado tick fever, CTF). Coltiviirused nakatavad enamasti närilisi, kuid võivad nakatada ka
inimesi (tupikperemees). Lastel põhjustab CTF raskeid haigusi, millega võivad kaasneda
närvisüsteemi kahjustused.
3.3.1. Virion
Orbiviiruste virionid (86 nm) on ikosaeedrilised, ilma membraanita ning koosnevad 10-st
dsRNA segmendist ja kahekihilisest kapsiidist:
1. Välimine kapsiid (T=13) koosneb kahest valgust (VP2 ja VP5), mis katavad virioni tiheda
kihina (märgatavad kanalid asuvad vaid ikosaeedri tippudes):
a. VP2 (millel on hemoglutiniin-aktiivsus) moodustab 180 virionist väljaulatuvat (umbes 4
nm võrra) ogalaadset struktuuri;
b. VP5 (360 koopiat, moodustavad 120 trimeeri) moodustab virioni pinnal asuvad
globulaarsed struktuurid.
2. Core (diameeter 69 nm, T=13) koostisesse kuulub kaks mazoorset (VP3, VP7) ja kolm
minoorset (VP1, VP4, VP6), mis moodustavad kaks kihti:
a. ringikujulistest kapsomeridest (ladina keeles on ring orbis, siit perekonna nimetus)
koosnev väliskiht. See kiht koosneb VP7 trimeeridest (260 trimeeri), mille vahel on 132
kanalit (8 nm sügavad, 8 nm diameetriga);
b. Sisestruktuur (sub-core), mille karkass on moodustunud 120-ne VP3 valgu subühiku
poolt (moodustavad 60 dimeeri, T=1 sümmeetria) ja millesse kuuluvad ka minoorsed
valgud VP1, VP4 ja VP6. VP1, VP4 ja VP6 paiknevad VP3-est moodustunud karkassi
sisemuses ja moodustavad five-fold telgede kohal paiknevad transkriptaas-kompleksid.
22
LIISI KINK
23
VIROLOOGIA
3.3.2. Genoom
Genoom koosneb kümnest dsRNA segmendist, mis jagunevad kolme suurusklassi (L1-3, M4-6,
S7-10). BTV (kokku 19,218 bp, segmendid 3954 ­ 822 bp) ja mitmete teiste orbiviiruste
genoomide täielikud järjestused on teada. Oma organisatsioonilt sarnaneb orbiviiruste genoom
teiste sugukonna Reoviridae esindajate genoomidel:
- positiivsete ahelate 5'-otstes asub cap-1 struktuur;
- kõikide genoomsete segmentide kuus 5'-terminaalset (5'- GUUAAA) ja kaheksa 3'-
terminaalset (ACACUUAC-3') nukleotiidi (positiivse ahela järgi) on konserveerunud;
- 5'- ja 3'-terminaalsed järjestused on osaliselt komplementaarsed (inverteeritud järjestused),
mistõttu RNA-d võivad moodustada "panhandle" struktuure (samas ei ole konserveerunud
5'- ja 3'- nukleotiidid teineteise suhtes inverteeritud ja jäävad sellistes struktuurides
paardumata);
- ka iga ahela siseosades leidub inverteeritud elemente, mis võimaldavad stem-loop
struktuuride moodustamist mRNAdes;
23
LIISI KINK
24
VIROLOOGIA
- mRNAd on monotsistroonsed (mõnes mRNAs kasutatakse kahte samas raamis asuvat AUG
koodonit, sünteesimaks C-koterminaalseid valke), nende 5'- ja 3'-mittekodeerivad
järjestused on lühikesed (vastavalt 8-34 ja 31-116 bp).
3.3.3. Valgud
Orbiviiruse genoom kodeerib seitset struktuurset ja kolme mittestruktuurset valku. Orbiviiruste
struktuurseid valke (ja nende poolt moodustatud multimeerseid komplekse) on nii struktuurselt
(kristallstruktuur) kui ka funktsionaalselt hästi uuritud.
VP2 (111 kDa) väliskapsiidivalk. Väliskapsiidi kuulub 180 VP2 subühikut. VP2 on orbiviiruse
antiretseptor (omab hemoglutiniin aktiivsust) ja peamine antigeen. Sisaldab arvukalt
proteaaside (trüpsiin, kemotrrüpsiin, plasmiin) lõikamissaite.
VP5 (59 kDa) väliskapsiidivalk, omab globulaarst struktuuri ja võib olla glükosüleeritud. VP5 on
samuti üks orbiviiruse peamiseid antigeene. VP5 sisaldab oma N-terminuses kahte
potentsiaalset amphipaatilist heeliksit ja on oluline orbiviiruste rakku sisenemiseks (endosoomi
membraanide läbimiseks).
VP3 (103 kDa) on mazoorne core valk, mis on erinevatel orbiviirustel väga konserveerunud.
Core struktuuri kuulub 120 VP3 subühikut (moodustavad 60 dimeeri). Omab olulist osa virioni
moodustamisel ja virionide rakku tungimisel.
VP7 (39 kDa) on väga konserveerunud mazoorne core valk: core koostisesse kuulub 780 VP7
subühikut (moodustavad 260 trimeri). Kui rakkudes ekspresseerida samaaegselt VP3 ja VP7
valke, siis moodustavad need valgud core-sarnaseid ikosaedrilisi partikleid.
VP1 (150 kDa) on orbiviiruse RdRp. VP1 on minoorne valk ja on virionis esindatud vaid 12
koopiaga,
VP4 (76 kDa) on minoorne sisekapsiidi valk (ca 24 koopiat virioni kohta), mis moodustab nii
lahuses kui ka virionides homodimere ja on orbiviiruse cap-sünteesi ensüüm, mis omab:
- GT aktiivsust;
- kahte tüüpi MT aktiivsuseid nagu (ka teiste Reoviridae esindajate MT-d);
- NTP-aaset aktiivust;
- RNA-trifosfataaset aktiivsust.
24
LIISI KINK
25
VIROLOOGIA
Seega paiknevad orbiviirustel (erinevalt reoviirustest) kõik cap-sünteesiks vajalikud aktiivused
ühes ja samas valgus.
VP6 (36 kDa) on väga aluseline virioni sub-core valk (60-72 koopiat virioni kohta), mis seondab
nii ss- kui ka dsRNAd. Pealse selle omab VP6 ka:
- RNAst sõltuvat ATP-aaset aktiivsust;
- RNA-helikaaset aktiivsust (heksameerne VP6).
Nende aktiivsuste olemasolu lubab arvata, et VP6 osaleb nii orbiviiruse transkriptsioonis kui ka
genoomi segmentide selektsioonil ja pakkimisel.
NS1 (64 kDa) on väga mazoorne valk, moodustab nakatatud raku tsütoplasmas tubulaarseid
struktuure (kujutavad endast NS1 multimeere). Need struktuurid (diameeter 52 nm, pikkus ca
1000 nm) võivad olla seotud virionide moodustumisega (teadmata mehhanism).
NS2 (41 kDa) on ainus orbiviiruse fosfoproteiin (seriin-jääkide fosforüleerimine); NS2 sisaldab
palju laetud aminohappejääke ja seondab ssRNAd (võib osaleda viiruse genoomi pakkimises).
NS2 põhjustab BTV poolt nakatatud rakkudes inklusioonkehade (inclusion body, IB)
moodustamist (eksperimentaalselt on näidatud, et ainult NS2 ekspressioon rakus on IB-sarnaste
struktuuride moodustamiseks piisav).
NS3 ja NS3A (ca 25 kDa) on orbiviiruse minoorsed mittestruktuursed valgud (samas on nad
nakatatud putukvektori rakkudes mazoorsed valgud) ning kujutavad endast ühe ja sellesama
mRNA (S10 mRNA) translatsiooniprodukte (erinevad AUG koodonid samas raamis). NS3 ja
NS3A kujutavad endast integraalseid membraanivalke (glükoproteiinid), millel on kaks
hüdrofoobset transmembraanset domääni. Need valgud sünteesitakse ER membraanil,
modifitseeritakse ja transporditakse Golgi kompleksi kaudu rakkude plasmamembraanile.
Eksperimentaalsed andmed näitavad, et NS3-valgud osalevad orbiviiruste virionide rakust
vabanemisel (seega on nad funktsioonilt sarnased rotaviiruste NSP4 valguga), modifitseerides
raku eksotsütoosi rada (interageeruvad eksotsütoosis osalevate valkudega).
3.3.4. Seondumine retseptorile ja sisenemine rakku
BTV retseptoriks imetajarakkudel on tõenäoliselt siaalhapet sisaldavad glükoproteiinid, viiruse
antiretseptor on VP2 valk. Seondumine rakkudele võib olla, sarnaselt reoviiruste seondumisele,
kaheetapiline protsess:
­ kõigepealt toimub seondumine siaalhappe jäägile;
­ järgneb seondumine retseptori valgu-osale (pole teada, kas see valk-osa on sama
glükoproteiin või mingi teine membraanvalk).
Putukarakkude nakatamise puhul võib orbiviiruse antiretseptor olla core-valk VP7. Seda
kinnitavad andmed, mis näitavad et orviviiruste core-struktuur on putukarakkude (kuid mitte
imetajate rakkude jaoks) jaoks kõrgelt infektsiooniline.
BTV sisenemine imetajate rakkudesse toimub retseptor-vahendatud endotsütoosi teel.
Endotsütootilistes vesikulides toimub väliskapsiidi valkude degradeerumine (madalast pH-ist
sõltuv protsess):
- VP2 degradeeritakse ja eemaldatakse;
25
LIISI KINK
26
VIROLOOGIA
- toimub VP5 struktuurne ümberkorraldus (amphipaatiliset fusion-heeliksite vabanemine?).
Nende protsesside tulemusena liigub virionist järele jäänud core-partikel läbi endosoomi
membraani raku tsütoplasmasse.
3.3.5. Transkriptsioon ja translatsioon
Rakus aktiveerub BTV transkriptaas. See on seotud virioni väliskapsiidi eemaldamisega, mis
võimaldab:
- nukleotiidide juurdepääsu core partiklis asuvale transkriptsiooni-kompleksile;
- genoomsete RNA segmentide liikumist partiklis ja
- sünteesitava mRNA väljumist partiklist.
Erinevate sünteesitavate mRNAde (capeeritud ja polüadenüleerimata) proportsioonid on
sarnased kogu infektsiooniprotsessi jooksul. Erinevalt reoviirustest ei ole sünteesitud mRNAde
hulk pöördvõrdelises seoses vastavate segmentide pikkusega (nt. segmenti M6
transkribeeritakse tunduvalt aktiivsemalt kui segmenti S10).
Translatsioon on detekteeritav 2-4 tundi peale rakkude nakatamist ning saavutab maksimaalse
aktiivsuse umbes 12 tundi peale infektsiooni algust (ja kestab kuni rakkude surmani).
3.3.6. Replikatsioon
Orbiviiruste looduslikud isolaadid replitseeruvad rakukultuuris halvasti ja seetõttu pärineb
enamus andmeid orbiviiruste replikatsiooni kohta BTV laboratoorsete tüvedega tehtud
uurimustest (need tüved replitseeruvad hästi paljude selgroogsete ja selgrootute rakkudes).
Orbiviiruste replikatsioonist on vähe teada, arvatavasti on see sarnane reoviiruste vastavale
protsessile.
3.3.7. Virionide moodustamine ja vabanemine
IB-d on core partiklite moodustumise kohaks:
- IB maatriksiga seondunud VP3- ja VP7-valgud moodustavad core-partikli karkassi (selles
paiknevad RNA-d ja minoorsed kapsiidivalgud);
- VP2- ja VP5-valgud asuvad IB-de välispinnal ja nende liitumine moodustuvatele virionidele
(väliskapsiidi moodustamine) toob kaasa partiklites asuva transkriptaasi aktiivsuse
mahasurumise ja virionide lõpliku valmimise.
Virionide väljumine nakatatud rakust sõltub nakatatud rakkude tüübist. Paljudel juhtudel on
kirjeldatud, et orbiviiruse virionid jäävad rakuga seotuks kuni selle surmani. Siiski on võimalik
ka vironide varasem rakkudest vabanemine ja seda kahel erineval moel:
1. Pungudes läbi rakumembraani ja omandades sellel moel ajutise membraani. Selline
vabanemine on iseloomulik infektsiooni varasematele staadiumitele.
2. Hilises infektsioonis toimub virionide massiline väljumine (üksikult või kogumite kaupa)
läbi plasmamembraani lokaalsete katkestuste (ilma pungumiseta, nn. extrusion protsess).
26
LIISI KINK
27
VIROLOOGIA
Need protsessid ei mõjuta olulisel määral raku elutegevust ning mõlemas protsessis omab
olulist rolli NS3 valk:
- NS3 lokaliseerub samades rakumembraani regioonides kus toimub ka virionide väljumine;
- NS3 rolli virionide vabanemisel kinnitab ka fakt, et putukarakkudes, kus NS3 ekspressioon
toimub palju kõrgemal tasemel, on virionide vabanemine nakatatud rakkudest oluliselt
efektiivsem.
3.3.8. Infektsiooni mõju peremeesrakule
BTV replikatsioon toob kaasa peremeesraku makromolekulide sünteesi kiire mahasurmise,
toimuvad muutused raku tsütoskeletis (eriti vahepealsetes filamentides). Nakatatud rakkudes
moodustuvad:
- viirus-spetsiifilised tubulaarsed struktuurid (NS1-valk) ja
- viiruse replikatsioonisaidid (IB-d), milles asuvad viiruse ssRNA, NS2-valk (ka mingil hulgal
NS1-valk) ja struktuursed valgud.
3.4. Taimede reoviirused ­ PEREKONNAD PHYTOREOVIRUS, FIJIVIRUS,
ORYZAVIRUS
Taimede reoviiruseid iseloomustab segmenteeritud dsRNA genoom ning replikatiivne ja
permessiivne vektorülekanne (esineb ka viiruse ülekanne ühelt vektori põlvkonnalt teisele
vektori põlvkonnale). Iga viirus on vektorspetsiifiline (üks või väike arv liike), mehhaaniline
ülekanne taimelt taimele puudub. Taimede reoviiruseid iseloomustab veel seotus floeemkoega ja
võime tekitada nakatatud taimedes (replikatsioonisaitides) kasvajaid. Sugukonda Reoviridae
kuulub vähemalt kolm perekonda taimeviiruseid:
1. Phytoreovirus. Genoomis on 12 dsRNA segmenti, virioni kapsiididel puuduvad ogad,
ülekanne toimub tirtsudega (leafhopper). Kokku kolm liiki, tüüpesindaja wound tumor virus
(WTV). Kõigi selle perekonna viiruste genoomide segmendid omavad identseid
terminaalseid järjestusi:
(+) 5'-GGU/CA-----U/CGAU-3'
2. Fijivirus. Genoomis on 10 dsRNA segmenti, ülekanne toimub tsikaadidega (planthopper).
Perekonnas on kolm kindlat liiki (ja hulk võimalike liike), tüüpesindaja Fiji disease virus
(FDV). Genoomi segmentide terminaalsed järjestused on:
27
LIISI KINK
28
VIROLOOGIA
(+) 5'-AAGUUUU---GUC-3'
3. Oryzavirus. Genoomsis on 10 dsRNA segmenti (erinevad eelmise perekonna genoomsetest
RNAdest mõõtude ja struktuuri poolest), ülekanne toimub tsikaadidega (planthopper).
Perekonda kuulub kaks liiki, tüüpesindaja rice ragged stunt virus (RRSV). Genoomi
segmentide terminaalsed järjestused on:
(+) 5' ­GUAAA----GUGC-3'.
Hulgaliselt leidub ka veel seni üheselt klassifitseerimata taimede reoviiruseid.
3.4.1. Virion
Taimede reoviiruste virionid sarnanevad muude reoviiruste virionidele: neil on kahekihiline
kapsiid (T=13 väliskapsiid ja T=1 sisekapsiid) (RRSV virionil arvatavasti välimine kiht puudub)
ning igas virionis paikneb üks koopia igast genoomi segmendist. Virionides asuvad ka kõik RNA
replikatsiooniks, transkriptsiooniks ja modifitseerimiseks vajalikud ensümaatilised aktiivsused.
Enim on uuritud perekonna Phytoreovirus virione. Rice dwarf virus'e (RDV) virioni diameeter on
70 nm, on tehtud röntgenstruktuuranalüüs:
- RDV virioni "core" koosneb genoomist ja sellega assotsieerunud kolmest struktuursest
valgust;
- "core" partiklit ümbritseb kapsiid (780 P8 valgu subühikut, mis moodustavad 260 trimeerset
kapsomeri);
- kapsiidi ümbritseb väliskest (koosneb kahest struktuurvalgust).
Teiste perekondade virione iseloomustavad väljaulatuvad "ogad" (sisemise kapsiidi osad).
PHYTOREOVIRUS
28
LIISI KINK
29
VIROLOOGIA
FIJIVIRUS
ORYZAVIRUS
3.4.2. Genoom
Täielikult on sekveneeritud kaks viirust: RDV (12 segmenti) ja Nilaparvata lungens reovirus
(NLRV, perekond Fijivirus, 10 segmenti). Segmentide struktuurid on mõlemal viirusel sarnased:
- segmentidel on sarnased terminaalsed struktuurid;
- kodeeriva ahela 5'-otsas on cap-struktuur, 3'-otsas puudub polü(A);
- konserveerunud terminaalsetele järjestustele järgnevad igas segmendis segment-
spetsiifilised inverteerunud kordusjärjestused (3-17 b);
- suurem osa segmente kodeerib ühte valku;
- 5'-mittekodeeriv järjestus on 18-63 b pikkune;
- 3'-mittekodeeriv järjestus 93-492 b pikkune.
29
LIISI KINK
30
VIROLOOGIA
WTV ja RTV genoomide segmendid 12 on struktuurselt vastavalt bi- ja tritsistroonsed (peale
peamise ORF-i sisaldavad veel väiksemaid teises faasis olevaid ORF-e, mis tõenäoliselt kujutavad
endast ekspresseeritavaid geene).
Ka mõne teise taimede reoviiruse mõningad segmendid on struktuurselt bitsistroonsed. Kas ja
kuidas ekspresseerub in vivo nende teine ORF pole enamasti selge.
Pole täiesti selge, kuidas saavutatakse genoomi pakkimine virionidesse, nii et igas partiklis oleks
üks koopia igast segmendist. Teada on, et iga fragment sisaldab vähemalt kahte
äratundmisregiooni, millest üks eristab viiruse RNAsid raku RNA-dest ja teine iga segmenti
teistest segmentidest.
3.4.3. Geeniekspressioon ja replikatsioon
Reoviiruste replikatsiooni protsessist taimes on teada väga vähe, enamus andmeid pärineb
putukarakkude (leafhopper) kultuuris toimuvast replikatsioonist. Taimede reoviiruste
infektsioon vektorirakkudes on mittetsütopatogeene. Replikatsioon toimub rakkude
tsütoplasmas ja replikatsioon skeem on sarnane loomade reoviirustele ja dsRNA genoomsetele
bakteriofaagidele:
a) nukleokapsiidis asuvalt dsRNA-lt transkribeeritakse mRNAd;
b) mRNAdelt sünteesitakse nukleokapsiidi/polümeraase kompleksi valgud, mis moodustavad
prokapsiidi;
c) 12 (või 10) erinevat mRNAd (vastavalt segmentide arvule) pakitakse prokapsiidi;
d) sünteesitakse teine RNA ahel (selleks on olulised segmentide inverteeritud järjestused). Võib
järgneda uus transkriptsiooniraund või toimuda virionide lõplik moodustumine.
Replikatsioonitsükli iseärasused on tingitud dsRNA genoomist - ühelgi viiruse
replikatsioonitsükli etapil dsRNA rakus ei vabane (dsRNA on enamikes rakkudes häiresignaaliks
ja aktiveerib raku/organismi kaitsemehhanisme) ja jääb kogu aeg seotuks nukleokapsiidiga, kus
toimub ka transkriptsioon.
30