Lookusi saab DNA-st välja lõigata ja paljundada väga kiiresti polümerasse ahelreaktsiooni (PCR) meetodit kasutades. Lõigatud fragmendid on erineva pikkusega, kuid lahuses segamini. See proov pannakse geeli, geel pannakse elektrolüüsi vanni. DNA-lõigud jooksevad + pooluse poole, seda kiiremini, mida lühemad nad on. PCR metoodika: Ependorfis segatakse kokku: nukleotiidid (kõiki nelja erinevat) DNA-polümeraas oma DNA lahus praimerid - lühikesed DNA lõigud, mis on komplementaarsed analüüsitava DNA- piirkonna mõlema “otsaga”. Ependorf pannakse 3 tunniks PCR-masinasse. PCR-masinas toimub DNA uuritavate lõikude paljundamine tänu pidevale temperatuuride vaheldumisele: 92oC - DNA denatureerub 58C - praimerid liituvad 72oC - DNA-polümeraas käivitab replikatsiooni. See tsükkel kordub masinas 34 korda. Fragment, mida tahetakse paljundada PCR
Võrreldakse 10 või enama lookuse pikkust: Lookusi saab DNA-st välja lõigata ja paljundada väga kiiresti polümerasse ahelreaktsiooni (PCR) meetodit kasutades. Lõigatud fragmendid on erineva pikkusega, kuid lahuses segamini. See proov pannakse geeli, geel pannakse elektrolüüsi vanni. DNA-lõigud jooksevad + pooluse poole, seda kiiremini, mida lühemad nad on. PCR metoodika: Ependorfis segatakse kokku: nukleotiidid (kõiki nelja erinevat) DNA-polümeraas oma DNA lahus praimerid - lühikesed DNA lõigud, mis on komplementaarsed analüüsitava DNA-piirkonna mõlema "otsaga". Ependorf pannakse 3 tunniks PCR-masinasse. PCR-masinas toimub DNA uuritavate lõikude paljundamine tänu pidevale temperatuuride vaheldumisele: 92oC - DNA denatureerub 58°C - praimerid liituvad 72oC - DNA-polümeraas käivitab replikatsiooni. See tsükkel kordub masinas 34 korda. Fragment, mida tahetakse paljundada PCR
"istutatamine" kummalegi üksikahelale, milleks temperatuur viiakse alla ca 50 °C juurde 30 sekundiks; 3) komplementaarse DNA ahela süntees DNA-polümeraasi toimel (72 °C juures aeg sôltub lôigu pikkusest, kuid ca 1-3 min). Ensüüm on termostabiilne ja on isoleeritud kuumavee allikates elavatest bakteritest (näit. Thermus aquaticus ja temalt saadud ensüümi nimetatakse TaqI). Reaktsioonis kasutatavad komponendid (maatriks DNA, praimerid, ensüüm ja vabad nukkleotiidid- viiakse kohe algselt ühte katsutisse. Kuna ahelreaktsiooni etapid toimuvad erineva temperatuuri juures, siis on kogu protsess juhitav temperatuuri abil ja vastavaid tsükleid vôib korrata kümneid kordi. Igas tsüklis DNA hulk teoreetiliselt kahekordistub. Praktiliselt hilisemates tsüklites on reaktsiooni efektiivsus väiksem, kuna ensüümi aktiivsus langeb, samuti lôpevad otsa vabad nukleotiidid. Neid juurde pole aga vôimalik lisada
Vajalik DNA lõik ühendatakse vektoriga ja moodustunud rekombinaat-DNA viiakse bakteri rakku , kus vektor asub paljunema tootes lühikesevajaga miljoneid koopiaid meid huvitavast DNA fragmendist. 35.Polümeraas-ahelreaktsioon (PCR). PCR vajaminevad põhikomponendid. PCR põhietapid. Milleks kasutatakse PCRi. PCR on DNA-molekuli paljundamine kunstlikes tingimustes. Reaktsiooni läbiviimiseks on eelnevalt vajalik teada uuritava DNA lõigu otste nukleotiidset järjestust, mille alusel disainida praimerid, mis on tavaliselt kuni 30 oligonukleotiidi pikkused. Reaktsioonis (PCRis) kasutatavad komponendid (maatriks DNA, praimerid, ensüüm ja vabad nukleotiidid) viiakse kohe algselt ühtebkatsutisse. PCR põhietapid on järgmised: 1) topeltahelalise DNA denaturatsioon kaheks üksikshelaks kõrge temperatuuriga (90-95C, 40-60 sek.). 2) praimerite seostamine (hübridiseerimine, anniilimine) DNA-le toimub tavaliselt temperatuuril 50-70C (ca 30 sek).
PCRi etapid · DNA denaturatsioon - kaksikheeliks laguneb kaheks üksikahelaks · Annealing e. praimerite seostumine DNA-le · DNA fragmendi süntees termostabiilse DNA polümeraasiga PCR-i eelised · Lihtne ja kiire kasutada · Väga tundlik meetod · DNA puhtus pole väga oluline · Võimalik kasutada algmaterjalina väga erinevaid asju ja aineid PCR-i puudused · Vajadus eelnevalt teada DNA järjestust,mille alusel sünteesida praimerid · PCR-i fragmendid jäävad suhteliselt lühikeseks · DNA replikatsiooni käigus võivad tekkida vead Isaduse tuvastamine · DNA analüüs on kättesaadav igaühele, kuid kulukas · Testimiseks võetakse koha peal süljeproov suust vatitampoonile · Isadustesti lõppjäreldus võib olla kahesugune: bioloogilise isaduse välistus ja bioloogilise isaduse kinnitus · Bioloogilise isaduse kinnituse puhul on mehel ja lapsel kõikides lookustes vähemalt üks ühine alleel
Võrreldakse 10 või enama lookuse pikkust: Lookusi saab DNA-st välja lõigata ja paljundada väga kiiresti polümerasse ahelreaktsiooni (PCR ) meetodit kasutades. Lõigatud fragmendid on erineva pikkusega, kuid lahuses segamini. See proov pannakse geeli, geel pannakse elektrolüüsi vanni. DNA-lõigud jooksevad + pooluse poole, seda kiiremini, mida lühemad nad on. PCR metoodika: Ependorfis segatakse kokku: nukleotiidid (kõiki nelja erinevat) DNA-polümeraas oma DNA lahus praimerid - lühikesed DNA lõigud, mis on komplementaarsed analüüsitava DNA- piirkonna mõlema "otsaga". Ependorf pannakse 3 tunniks PCRmasinasse. PCR-masinas toimub DNA uuritavate lõikude paljundamine tänu pidevale temperatuuride vaheldumisele: 92o C DNA denatureerub 58° C praimerid liituvad 72o C DNApolümeraas käivitab replikatsiooni. See tsükkel kordub masinas 34 korda.
PCR-reaktsioon toimub kolmes etapis: 1. DNA ahelate denatureerimine. Kui DNA on rakust eraldatud ja puhastatud, võib alustada PCR-analüüsi. DNA denatureerimiseks kuumutatakse DNA-d 9095 °C juures, mille käigus DNA biheeliks laguneb kaheks üksikahelaks. See on vajalik huvipakkuvate fragmentide paljundamiseks. PCR-i puhul on vaja teada lühikesi järjestusi kahel pool sünteesitavat piirkonda. Külgnevate järjestuste järgi on sünteesitud komplementaarsed praimerid, tavaliselt 1525 nukleotiidi pikkused oligonukleotiidid. Nende seondumine DNA-ga on vajalik, kuna alad, kuhu praimerid kinnituvad, on fragmentide sünteesi initsiaatoriteks. Praimerid seonduvad komplementaarsusprintsiibi alusel mõlemale poole piirkonda. 2. Praimerite seondumine DNA ahelatega. Praimerite seondumine ehk annealing toimub 5070 °C juures. Selleks, et kinnitustemperatuur mõistlik oleks, tulebki praimerid teha 20 nukleotiidi pikkused
Igal inimesel on pisut erinev genoom, need erinevused võivad mõjutada inimese tervist. Genoomi täispikka järjestust kasutades saab tegeleda personaalmeditsiiniga, sest on võimalik teada, kuidas patsient ravimile reageerib ja selle põhjal määrata just talle sobiv ravi. Polümeraasi ahelreaktsioon. Esmalt tuleb DNA denatureerida. PCR-i puhul on vaja teada lühikesi järjestusi kahel pool sünteesitavat piirkonda. Külgnevate järjestuste järgi on sünteesitud komplementaarsed praimerid, tavaliselt 15–25 nukleotiidi pikkused oligonukleotiidid. Nende seondumine DNA-ga on vajalik, kuna alad, kuhu praimerid kinnituvad, on fragmentide sünteesi initsiaatoriteks. Praimerid seonduvad komplementaarsusprintsiibi alusel mõlemale poole piirkonda. Kui praimerid on amplifitseeritava DNA järjestuse kahelt poolt kindlaks teinud ja piiranud, sünteesib termostabiilne DNA polümeraas praimerite 3’ otsast alates
küljest ära ja pärsivad aktiivust, fosfolüreelivad histooni. Promootor- TATA elementi sis geeni ala. Koht kuhu seondub RNA polümeraas. Ülavoolu asuv ala. DNA replikatsioon-Helikaas eraldab DNA ahelad. PolIII abil kodeeritakse probleemideta juhtiv ahel 5'-3'. Mahajäävat ahelat kodeeritakse fragmentide kaupa. Kõigepealt asetab RNA primaas RNA praimeri ning DNA pol III jätkab järjestuse kodeerimist nii mitu korda seejärel DNA Pol I asendab praimerid ja DNA ligaas ühendab fragmendid. Transkriptsioon- RNA tegemine DNAlt. Selles osalevad DNA, Tfid, RNA polümeraas ja ATP. Transkriptsiooniks on vaja DNA lõiku, mis koosneb osadest ( transkriptsiooni ühik ehk ala mida transkribeeritakse, sellest ülavoolu asub TATAbox ja enhanser). Edukaks transkriptsiooniks on vaja mõndasid TF´eid. Suurim TFIID sisaldades omakorda TBP (tata binding protein) mille kaudu kogu kompleks istub DNA transkriptsiooni initsiatsiooni saidile
- Embrüodiagnostika 2. DNA-sõrmejälgede metoodika: - Võrreldakse 10 või enama lookuse pikkust - Lookusi saab DNAst välja lõigata ja paljundada väga kiiresti põlumeraasse ahelreaktsiooni meetodit kasutades - Fragmendid erineva pikkusega, kuid lahuses segamini - Proov pannakse geeli-geel elektrolüüsi vanni - DNA lõigud jooksevad + pooluse poole seda kiiremini, mida lühemad nad on - PCR metoodika: 1. Ependorfis segatakse kokku: - Nukelotiidid - DNA-polümeraas - Oma DNA lahus - Praimerid-lühikesed DNA lõigud, mis on komplementaarsed analüüsitava DNA-piirkonna mõlema ,,otsaga" - Pannakse kolmeks tunniks PCR-masinasse - Toimub DNA uuritavate lõikude paljundamine tänu pidevate temp. Vaheldumistele - Ühte DNA lõiku kordistatakse palju kordi-võimalik saada miljonites uusi lõike - Kasutamine: kurjategijate ja isaduse tuvastamisek - GMOde plussid: - Suurem saagikus (võimalus leevendada inimkonna toiduprobleeme)
- Denaturatsioon 14. Kuidas nimetatakse PCR analüüsil praimerite seondumise etappi?- annealing 15. Millist kliinilist materjali saab kasutada PCR meetodil haigustekitaja tuvastamiseks?- röga, lima, seemnevedelik (DNA) 16. Millised on etapid haigustekitaja tuvastamiseks kliinilisest materjalist PCR meetodil?-algmaterjalisd DNA eraldamine ja puhastamine; PCR reaktsioon; restriktsioon; tulemuste visualiseerimine geelelektroforeesil 17. Nimeta PCR jaoks vajalikud komponendid?- DNA->praimerid->nukleotiidid->ensüüm Taq-> puhver ja MgCl 18. Mis on praimer ja milleks seda vaja on?- 15-30 nukleotiidi pikk üheahelaline DNA lõik; vajalik komplementaarsuse tõttu saavad seonduda uuritava DNA molekulile ja selle tähistada 19. Mille poolest erineb multiplex PCR tavalisest PCR-ist?-sama PCR ajal kasutatakse mitut praimerite paari, mitme erineva mikroobi tuvastamiseks samast DNA proovist 20. Mille poolest erineb real-time PCR tavalisest PCR-ist
DNA helikaas - Eraldab DNA ahelad teineteisest. DNA topoisomeraasid - katalüüsivad DNA ahelatesse ajutisi katkeid, et ei tekiks super- keerde. Superkeerd takistaks replikatsiooni jätkumist. Okazaki fragment - katkendlikult, lühikeste fragmentidena sünteesitav DNA Praimosoom - DNA sünteesi initsiatsiooniks on vaja valkkompleksi, mida nimetatakse praimosoomiks. · Praimosoom koosneb DNA helikaasist ja primaasist. · Primaas sünteesib RNA praimerid. (loeng 4 replikatsioon, transkr.) Nukleiinhapped - Kahte tüüpi nukleiinhapet · Deoksüribonukleiinhape (DNA) · Ribonukleiinhape (RNA) Nukleiinhapped rakus · DNA - Tuum, Mitokonder, Kloroplast · RNA - Kogu rakus Nukleiinhappe struktuur: nukleotiid Nukleotiidi struktuur: fosfaat, suhkur, lämmastikalus : Puriinid (Adeniin A, Guamiin G) Pürimidiinid (Tsütosiin C, Tümiin T,
• Uuritav DNA • Desoksüribonukleotiidid • Didesoksüribonukleotiidid (ddA,ddT,ddC,ddG) nt fluorestseeruva värviga märgitud • DNA polümeraas jt ensüümid, nt helikaasid jm, mis tekitavad DNA üksikahelad 13. PCR (polümeraasne ahelreaktsioon) - kuidas toimub, mida tarvis? Praimer. Tuubis segatakse kokku: nukleotiidid (kõiki nelja erinevat), DNA-polümeraas, oma DNA lahus, praimerid - lühikesed DNA lõigud, mis on komplementaarsed analüüsitava DNA-piirkonna mõlema “otsaga”. Tuub pannakse 3 tunniks PCR-masinasse. PCR-masinas toimub DNA uuritavate lõikude paljundamine tänu pidevale temperatuuride vaheldumisele Tulemus: uuritavaid DNA-lõike on paljundatud vähemalt 30 miljonile. Nii suurt kogust saab näha geelelektroforeesil. PCR-masinast võetud DNA-proovid pannakse geeli auku. • Geel asetatakse elektroforeesivanni,
uute ahelate tootmisele järgnevates etappides (ahelreaktsioon) - Paljundamine toimub eksponentsiaalselt: 2, 4, 8, 16…, pärast kolmekümnendat tsüklit oleme ühest molekulitst saanud juba 1 073 741 824 DNA lõiku. PCR-l vajalikud komponendid: - Uuritav DNA, mille piirkonda soovitakse paljundada - Nukleotiidid – uute DNA ahelate moodustamiseks - DNA-polümeraas – ensüüm, mis sünteesib DNA-d - Praimerid – lühikesed DNA lõigud, mis piiritlevad paljundatava piirkonna kogu DNA-st märgistavad sünteesi alguskoha Erinevaid praimereid saab sünteesida vastavalt soovitavale DNA lõigule. Geel – elektroforees: - DNA proov kantakse geeli “hambasse” koos lahust raskemaks tegeva värvainega - Elektroforeesil liiguvad eri pikkusega DNA järjestused erineva kiirusega, lühemad kiiremini
· lookust saab DNA-st välja lõigata ja paljundada väga kiiresti polümerasse ahelreaktsiooni (PCR) meetodit kasutades · lõigatud fragmendid on erineva pikkusega, kuid lahuses segamini · see proov pannakse geeli, geel pannakse elektrolüüsi vanni · DNA lõigud jooksevad pooluste poole, seda kiiremini, mida lühemad nad on · PCR meetod- ependorfis segatakse kokku: nukleotiidid, DNA polümeraas, oma DNA lahus, praimerid(lühikesed DNA lõigud, mis on komplementaarsed analüüsitava DNA-piirkonna mõlema otsaga · ependorf pannakse 3h PCR masinasse · toodetakse DNA lõiku miljonites kordades · PCR masin e termotsükler - - toimub DNA uuritavate lõikude paljundamine tänu pidevale temperatuuri vaheldumisele · uuritava DNA lõike on paljundatud vähemalt 30 miljonini · nii suurt kogust saab näha geelelektoforeesil
POLÜMORFISM- mitmekujulisus, varieeruvus isenditi. PCR- laialdaselt kasutatav meetod mingi kindla DNA lõigu paljundamiseks. Mitmeetapiline DNA süntees, kus eelnevates etappides sünteesitud ahelad on aluseks uute ahelate tootmisele järgnevates etappides. ● Paljundamine toimub eksponentsiaalselt: 2,4,8,16,32,64,128 PCR-i VAJALIKUD KOMPONENDID: ● uuritav DNA, mille piirkonda soovitakse paljundada ● nukleotiidid (kõik 4 erinevat)- uute DNA ahelate moodustamiseks ● praimerid (vasak- ja parempoolne)- lühikesed DNA lõigud, mis piiritlevad paljundatava piirkonna kogu DNA-st, märgistavad sünteesi alguskoha Erinevaid praimereid saab sünteesida vastavalt soovitavale DNA lõigule 6. Isiku molekulaarbioloogiline tuvastamine, DNA sõrmejälgede metoodika. Polümorfsed markerid; Tandem(kordus)järjestus (STR) ja SNP (ühenukleotiidne erisus/varieeruvus). Konspekt + Õp lk 50 - 56. Tuvastamine: vt vihikust STR, SNP jms.
pikenemise. Märgistatud DNA ahelda geel-elektrofreesis pikkuse järgi. Geenikogud 1. Genoomse DNA kogud 2. cDNA kogud (eri liigid ja koed) ainult eksoneid sisaldav, annab infot geenide avaldumise kohta. PCR(polümeraasi ahelreaktsioon Võimaldab eksponentsiaalselt paljundada uuritavat DNAd (miljardid molekulid 1-2 tunniga) Põhineb termostabiilsel DNA polümeraasil, kus luuakse komplementaarsed praimerid meid huvitavale järjestusele ja siis tsükleeritakse (ahelate lahtisulatus, praimerite paardumine, ahelate sünteesimine kokku 30-40 korda)
teha. Normaalseid protsesse ei saa uurida, kuna ei ole olemas vajalikke geene. Kasvajalises rakukultuuris on enamasti ekspresseerunud paljunemisega seotud geenid ja normaalsed ei toimi. Umbes midagi sellist. ! 12. Mis on, kus ja kuidas tekib Okazaki fragment? (М104) 67 ! Okazaki fragment on DNA replikatsioonis mahajääval ahelal DNA polümeraasi poolt sünteesitud DNA lõik. Kui fragmendi sünteesimine on lõppenud, eemaldatakse RNA praimerid ja ensüüm DNA ligaas seob üksikud Okazaki fragmendid ühtseks DNA ahelaks. ! 13. RNA sünteesi keemilised inhibiitorid loomses rakus. (М128) 80 ! Aktinomütsiin D (antibiootikum): ühineb eukarüoodi rakus DNA-ga ja takistab RNA polümeraaside liikumist, seega kõikide RNA tüüpide süntees on inhibeeritud. Alfa-amanitiin: valgekärbseseene alkaloid, inhibeerib rakus RNA polümeraas II, mRNA süntees muutub võimatuks. ! 14. Aminohapete aktiveerimine ja adapteerimine. (Б137) 84 ! !
valgumolekuli. In genoomis on cDNAd ainult 2%. 48. DNA sekveneerimise põhimõte. Sekveneerimine on DNA nukleotiidse järjestuse kindlakstegemine. 49. Mille poolest erineb automaatsekveneerimine klassikalisest manuaalsest sekveneerimisest? 50. Polümeraasi ahelreaktsioon. Kindla DNA lõigu kiireks paljundamiseks. Paljundada saab iga DNA lõiku, mille otsjärjestused on teada ning mille järgi on sünteesitud lühikesed 1-ahelalised DNA-lõigud(praimerid). Protsess on automatiseeritud vastava aparaadi, termotsükleri ja sellega ühendatud arvuti abil. Reaktsiooni 1 tsükkel kestab u 1min, tunni ajaga võib saada miljon koopiat. Reaktsioonisegus on uuritava isiku proovist eraldatud üliväike DNA kogus, desoksüribonukleotiidtrifosfaate, praimerid ja DNA polümeraas. Automatiseerumise on võimaldanud kuumaveebakterilt pärit nn Taq- polümeraas, mis säilitab aktiivsuse kuni 100 kraadi juures. Saadud DNA
PCR käigus viiakse DNA süntees läbi keskmiselt 20-40 korda järjest. Iga sünteesireaktsioon moodustab ühe “PCR tsükli”. Tsükkel koosneb sisuliselt kindlatest temp-muutustest, mis korduvad ja kus kindla temp. Juures leiab aset kindel osa DNA sünteesi reaktsioonist. Klassikaliselt koosneb 1 tsükkel kolmest erinevast protsessist kolmel erineval temp- il: 1. Enne kui saab alata DNA süntees, on vaja praimerite seondumine. Praimerid ei suuda aga seonduda kaksikheeliski kujul olevale DNA-le. Seetõttu on esimeseks etapiks DNA ahelate “lahti sulatamine” ehk denatureerimine → kuumutatakse segu lühidalt (20-30 sek) 94-98 kraadi juures. Sellisel temp-il katkevad H-sidemed, mis hoiavad DNA molekuli lämmastikaluseid koos ning kaksikahelisest DNA molekulist saab kaks üheahelalist DNA molekuli. 2. Üheahelalisele DNA molekulile saaks nüüd seostuda praimer aga nii kõrge temp
süntees. 2. Replikatsioon DNA täpse duplikaadi tegemine vajab 30 erineva ensüümi kaasabi Algab replikatsioon spets. genoomi lõikudelt nimetusega origin Helikaas keerab DNA topeltheeliksi lahti DNA polümeraas III lisab 5’ -> 3’ suunas nukleotiide: Juhtiv ahel – sünteesitakse järjest 5’ -> 3’ suunas Mahajääv ahel – sünteesitakse 5’ -> 3’ suunas lühikeste lõikudena; üldine suund on aga 3’ -> 5’ DNA polümeraas I eemaldab RNA praimerid ja asendab need DNAga Replikatsioonikahvi kokkusaamisel ligaasid liidavad mahajäävas ahelas olevad DNA fragmendid, et viia süntees lõpuni Tütarmolekulide lahknemine saab valmis 3. Transkriptsioon 1. RNA polümeraas seostub geenist ülal asuva promootoralaga. 2. RNA polümeraas lisab komplementaarseid nukleotiide märklaud DNA segmendile 5’ - 3’ direction. 3. Uratsiil on adeniinile komplementaarne. 4. Terminatsioonil, RNA polümeraas tunneb ära signaali ja transkript
fragmendid), mis seejärel ühendatakse. 2. DNA polümeraase tähistatakse I-V vastavalt avastamise järjekorrale. Polümeraas III on peamine DNA replikatsiooni ensüüm, I, II ja V osalevad pmslt vigade parandamisel. Replikatsioon bakterites: helikaasid keerutavad biheeliksi lahti; lahtikeerdumist kompenseerivad topoisomeraas; DNA polümeraas III kasutab RNA-praimereid; DNA primaas sünteesib oligonukleotiidsed RNA-praimerid. DNA polümeraas I lõikab praimerid välja. DNA ligaas täidab lüngad Okazaki fragmentide vahel. Replikatsiooni erinevused eukarüootides: eukarüootidel on mitu replikatsiooni saiti e replikaatorit. 3. Pöördtranskriptaas e RNA-juhitav DNA polümeraas retroviirustes, mis sünteesib RNA ahelale temaga komplementaarse DNA (cDNA) ahela. Pöördtranskriptaas on väga vigade aldis ensüüm, mille tõttu on viiruse genoom pidevas muutumises. Praimeriks on üks tRNA molekul, mille viirus haarab peremeesrakust. 4
suunas: lisades nukleotiide DNA ahela 3' otsale. DNA polümeraas DNA polümeraasid moodustavad ensüümiperekonna, mis viivad läbi igat DNA replikatsiooni.[3] DNA polümeraas saab lisada vabu nukleotiide ainult sünteesitava ahela 3' otsa, selle tõttu toimub uue ahela pikendamine 5'-3' suunas. Ükski teadaolev DNA polümeraas ei ole võimeline alustama täiesti uue ahela sünteesi, vajatakse vaba 3'-OH rühmaga praimerit, millele esimene nukleotiid liita. Praimerid koosnevad RNA ja/või DNA aluspaaridest. DNA replikatsiooni puhul on kaks esimest aluspaari alati RNAd ning neid sünteesib ensüüm nimega praimaas. Ensüümi nimega helikaas vajatakse kaheahelalise DNA struktuuri lahtikeerdumiseks üheahelaliseks. Lahtikeerdumine on vajalik, et replikatsioon saaks alata mõlemalt ahelalt. Paljudel DNA polümeraasidel on vigadeparanduse funktsioon, mida nimetatakse proofreadinguks. See protsess parandab vead vastsünteesitud DNAs. Vale aluspaari
vabast 3’ otsast ja seetõttu liikuda sünteesiga ainult ühes suunas. Tulemusena tekib mõlemale DNA üksikahelale komplementaarne ahel. 4) Eelpoolmainitud etappe (tsükleid) korratakse 20–30 korda, et amplifitseerida piisav arv DNA molekule. 18. Millist polümeraasi kasutatakse PCR protseduuril ja miks? Mikroorganismist Thermus aquaticus pärit DNA Taq polümeraasi, kuna see on kuumale vastupidav ning ei denatureeri 94º C juures. 19. Mis on praimerid? 15-25 nukleotiidi pikkused komplementaarsed oligonukleotiidid, mida kasutatakse PCR-is. Praimer on lühike (tavaliselt umbes kümme aluspaari pikkune) nukleiinhappe lõik, mis on DNA replikatsiooni alguskohaks. 20. Kes töötas välja PCR meetodi? 2:2-3. PCR meetodi leiutas 1983 Kary Mullis. 21. Mis on geel-elektroforees ja milleks seda kasutatakse? 2:11-15. Elektroforees on meetod mis võimaldab eri tüüpi molekule üksteisest
Blotipaberile oma nime ja mustrit pipeteerides jälgisin, et pipett ei läheks liiga sügavale lahusesse, et pipett oleks otse ning pipeteerimine toimuks sujuvalt, et kogused oleks võimalikult täpsed ning täpid tuleksid ühtlased. 1. Polümeraasi ahelreaktsiooni teostamine a) Paljundamiseks sain plasmiidi pEGFP-FoxO3a-wt, praimeritest kasutasin: · EGFP-3-s-170-F (5'-CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG-3') · SV40p-R (5'-GAAATTTGTGATGCTATTGC-3') Praimerid on valitud selliselt, et nad ei moodustaks omavahel dimeere (ehk ei oleks omavahel komplementaarsed) ning oleksid komplementaarsed lõiguga paljundataval DNA-l, millega praimerid seonduvad ning kust algab replikatsioon. b) Kasutatud PCR-i programm: 1. 95 o C 15 minutit ensüümi (polümeraasi) aktiveerimiseks 2. 95 o C 10 sekundit denatureerimine ehk ahelate lahku kuumutamine 3. 56 o C 20 sekundit praimerite hübridiseerumine DNAle (annealing) 4
12. Milline on nn. kolmanda põlvkonna sekvenerimismeetodite põhiline erinevus esimese ja teise põlvkonna meetoditest: a) Sekveneeritavat DNA-d ei amplifitseerita vaid järjestatakse otse reaal-ajas b) DNA sekveneerimiseks tekitatakse ensümaatiliselt erineva pikkusega fluorestsentsmärgisega fragmentide jadad, mis lahutatakse elektroforeesil c) DNA sekveneerimine toimub kloonide kaupa d) Kogu sekveneeritav DNA purustatakse, saadud fragmentidele liidetakse praimerid ning amplifitseeritakse sild- amplifikatsioonil kiibi pinnal 13. Restriktaas HindIII lõikab DNA-d järgmisest äratundmiskohast 5'AAGCTT3'. HindIII on seega: a) Tüüp 1 restriktaas, mis annab DNA lõikamisel 3' üleulatuva otsa b) Antud ensüüm annab DNA lõikamisel tömpotsa c) Tüüp 2 restriktaas, mis annab DNA lõikamisel 5' üleulatuva otsa d) Tüüp 1 restriktaas, mis annab DNA lõikamisel 5' üleulatuva otsa
ning moodustub n-ö replikatsiooni-mull (DNAd sünteesitakse bidirektsionaalselt ehk mõlemas suunas). Originid on tavaliselt A-T rikkad (sisaldavad palju adeniini-tümiini aluspaare) ja aitavad sellega lahtikeerdumisele kaasa, sest A-T aluspaaridel on kaks vesiniksidet (mitte kolm, nagu C-G paaridel). Seega on A-T sidemeid lihtsam lõhkuda, sest väiksema arvu vesiniksidemete lõhkumise jaoks kulub vähem energiat. Pärast DNA ahelate eraldamist luuakse algahelatele RNA praimerid. Juhtivale DNA ahelale sünteesitakse üks RNA praimer aktiivse origini kohta, mahajäävale ahelale sünteesitakse aga mitmeid praimereid, neid nimetatakse avastaja järgi Okazaki fragmentideks. DNA polümeraas pikendab juhtivat ahelat pidevalt, mahajäävat ahelat aga fragmentide kaupa. RNaas eemaldab replikatsiooni initsiatsiooniks kasutatud RNA praimerid, ning teist sorti DNA polümeraas liitub ahelatega, et täita sünteesimata fragmente. Pärast seda liitub DNAga ligaas, mis
järgmise praktikumini. 2. päev: lisasin PCR segule 4 μl 6x DNA värvi, et DNA nähtav oleks, ning kandsin kogu segu TAE geelile (hambasse). DNA lahutamine toimub elektrivoolu toimel (100 V 15 min) 25. 26. 27. 28. 29. 30. Kuna minu produkt ei ole üldse geelipildil nähtav, võin järeldada, et midagi tegin valesti PCR reaktsiooni teostamisel (nt. viga pipeteerimisel või mingi muu viga). Sain geelitükki teiste plasmiidi ja praimeritega. 31. Plasmiid mEB1 pEGFP-N1, praimerid mEB1F ja mEB1R. Oodatav pikkus – 700 aluspaari. 32. 33.PCR produkti puhastamine geelist Zymoclean kitiga. 34. Eesmärgiks on puhastada välja PCRi segust meid huvitav produkt, et vältida praimerite, nukleotiidide või erinevate soolade mõju järgmisele etapile. 35. Plasmiid mEB1 pEGFP-N1, praimerid mEB1F ja mEB1R. Oodatav pikkus – 700 aluspaari. 36. Puhastamine: 1. Saadud geelitükk kaalus 0,04 g. Lisasin 120 μl ADB-d (0,3 ml 0,1 g geeli kohta) 2
restriktsiooni kohad (,,site")? Võib sünteetiliselt luua need restriktsioonikohad. Või esineb ka meetod, mille kirjeldas Tsenq H 1999aastal. Meetod põhineb ,,sticky" otste moodustumisel kasutades praimeri disaini ja lambda eksonukleaasi PCR reaktsioonis. Moodustuvad otsad on natuke pikem, kui peavad olema ning tekkinud tühiku nende vahel täidetakse Klenow fragmendi abil. Samas kasutatakse topoisomeraaside toime; ka spetsiifilised praimerid. 14. Kirjelda filament bakteriofaagi M13 replikeerumist. Miks kasutatakse F-faktoriga peremees-rakke? F-faktoriga rakud on vajalikud, kuna nendega ühineb M13 faagis olev F- piili. Nende vahel
o - vigade parandus o - replitseeriv ensüüm mitokondrites o - peamine polümeraas! Omab 3'-eksonukleaasi aktiivsust, teeb vähem vigu · DNA-primaas sünteesib oligonukleotiidse praimeri · DNA-ligaas ühendab mahajääva ahela fragmente Okazaki fragmendid on lühikesed DNA jupid, millest pannakse kokku ahel, mis on komplementaarne DNA replikatsioonil mahajäävale ahelale. RNA-praimerid, millest fragmendid alguse saavad, lõigatakse ära ja asendatakse pikeneva DNA ahelaga. Fragmendid ühendatakse DNA ligaasi poolt. Pseudogeen - funktsionaalse geeniga homoloogiline järjestus, mida ei transkribeerita. Evolutsiooni käigus on lisandunud neisse geenidesse geneetilise triivi (genetic drift) tulemusena rida muutusi, mis translatsiooni enneaegselt termineerivad või inhibeerivad mRNA protsessingut, nii et need alad on
sünteesib 5´-3´sidemeid. Arvutused: Kokku soovime saada 20µl 3 1 Polümeraas: ×20=2 µ l Magneesiumkloriid: 10 ( 2,5× 10−3 ) ×(20 × 10−6) = 2µl 25 ×10−3 0,5 x 20 × 240 Praimerid: = , x=1 µ l dNTP: =2,4 µl 10 20 2000 Template DNA lõppkontsentratsioon: 25 ×0,2 ÷ 20=0,25 ng /µ l Polümeraasi ühikud: 5 ×0,1=0,5U Vesi: 20 – 2 – 2 – 1 – 1 – 2,4 – 0,2 – 0,1 = 11,3µl Töö käik: Segan kokku eelnimetatud komponendid Tsentrifuugin ja asetan PCR masinasse PCR programm: a
40-60 sek); 2) praimerite hubridiseerimine e "istutatamine" kummalegi uksikahelale, milleks viiakse temperatuur alla ca 50 °C juurde 30 sekundiks; 3) komplementaarse DNA ahela suntees DNA-polumeraasi toimel (72 °C juures, aeg soltub loigu pikkusest, kuid ca 1-3 min). Kasutatav ensuum on termostabiilne ja on isoleeritud kuumaveeallikates elavatest bakteritest (nt Thermus aquaticus, temalt saadud ensuumi nimetatakse TaqI). Reaktsioonis (PCRis) kasutatavad komponendid (maatriks-DNA, praimerid, ensuum ja vabad nukleotiidid) viiakse kohe algselt uhte katsutisse. Kuna ahelreaktsiooni etapid toimuvad erineva temperatuuri juures, siis on kogu protsess juhitav temperatuuri abil ja vastavaid tsukleid voib korrata kumneid kordi. Igas tsuklis DNA hulk teoreetiliselt kahekordistub. Praktiliselt hilisemates tsuklites on reaktsiooni efektiivsus vaiksem, kuna ensuumi aktiivsus langeb, samuti lopevad otsa vabad nukleotiidid. Neid juurde pole aga voimalik lisada
fermentas.com/; vt lisa) Restriktaasi 10 x puhver (lisatakse 1/10 reaktsiooni mahust) Agaroos (FMC) 1 x TBE foreesi puhver (TBE, 50 mM Tris-boraat, pH 8,3; EDTA-Na2) 1 x TBE foreesi pealekandmis-puhver Molekulmassi marker (DNA, 1 kb või 100 bp "ladder"; 100-200 ng raja kohta) H2O 10 x PCR puhver (Fermentas) 25 mM MgCl2 Taq DNA polümeraas, 5 u/l (Fermentas) 2 mM dNTP (Fermentas) T3 ja T7 RNA polümeraasi promootori praimerid AATTAACCCTCACTAAAGGG ja TAATACGACTCACTATAGGG, 100 ng/l Töö käik: A: Restriktsioon ei tee (1) Saadud rekombinantse DNA restriktsiooniks Cfr42I-ga: võta ~500 ng miniprep DNA-d (5 l), lisa 4 l H2O-d ja 1 l 10 x puhvrit (kokku 10 l). Jaga lahus kahte tuubi (5 l mõlemasse), ühte lisa restriktaasi (0,5-1 l) ja teise mitte. Kontroll (miinus ensüüm) on vajalik selleks, et veenduda kas restriktaas töötas. Inkubeeri 30-60 min 37 oC juures nii restriktsioon, kui ka kontroll.
üleulatuvate otstega. Mõned restriktaasid tekitavad 5' (EcoRI), teised 3' (PstI) üleulatuva otsaga fragmente. On ka restriktaase, mis tekitavad tömpotsalisi fragmente (SmaI). 44. DNA kloneerimise etapid. bläblä 45. DNA sekveneerimise põhimõte. Erinevad DNA molekulid liiguvad erineva kiirusega ja siis mingi lahe süsteem oli. http://www.biotech.ebc.ee/praktikum/juhend3.html 46. Polümeraasi ahelreaktsioon. Äö, praimerid ja värk! Pannakse vajalik(?) jama lahusesse ja imeväel toimub DNA kloneerimine. 47. Kromatograafia. Kromatograafiline meetod põhineb erinevate keemiliste ühendite erinevale tasakaalule kromatograafilise kolonni materjali (sorbendi) pinnale adsorbeerunud ja liikuvas kandevkeskonnas (vedelik või gaas) lahustunud molekulide vahel. Tulemusena liiguvad erinevad molekulid kandevkeskonna voos erineva kiirusega ja lahutuvad seetõttu ruumiliselt. 48. Elektroforees. 49
mutatsioonianalüüsi meetodid (3 erinevat), nende eelised ja puudused, restriktaasid ja nende kasutamine DNA analüüsil. Kasutatakse puhastatud DNA polümeraasi, oligonukleotiidseid parimereid ja dNTP-sid. Põhineb kolmel järjestikulisel reaktsioonil erinevatel temperatuuridel ning tsükleid korratakse umbes 30 korda. Kõigepealt denatureeritakse temperatuuri tõstmisega (tavaliselt 95C kraadi). Mahajahtumisel saavad praimerid seonduda komplementaarselt, see on annealing. Järgneb uue DNA fragmendi süntees DNA polümeraasi ja dNTP-de lisamisega. qPCR – DNA ja RNA paljundamiseks. Hinnatakse automaatselt kohe tekkiva amplifikatsiooni produkti hulka. Kasutatakse fluoressentsi detekteerivat termotsüklerit. Kasutatakse geeni ekspressiooni hindamiseks ning mutatsioonide ning SNPde leidmiseks RT-PCR – reverse transcriptase PCR, RNA kopeeritakse
fermentas.com/; vt lisa) Restriktaasi 10 x puhver (lisatakse 1/10 reaktsiooni mahust) Agaroos (FMC) 1 x TBE foreesi puhver (TBE, 50 mM Tris-boraat, pH 8,3; EDTA-Na2) 1 x TBE foreesi pealekandmis-puhver Molekulmassi marker (DNA, 1 kb või 100 bp "ladder"; 100-200 ng raja kohta) H2O 10 x PCR puhver (Fermentas) 25 mM MgCl2 Taq DNA polümeraas, 5 u/l (Fermentas) 2 mM dNTP (Fermentas) T3 ja T7 RNA polümeraasi promootori praimerid AATTAACCCTCACTAAAGGG ja TAATACGACTCACTATAGGG, 100 ng/l Töö käik: A: Restriktsioon (1) Restriktsioon: 1) 20 µl plasmiidsed DNA-d 22 µl 2) 2 µl 10x restriktaasi puhvrit Saadud 22 µl lahust jagan kaheks tuubiks, mõlemad 11 µl. Ühele tuubisse lisan 1 µl Cfr 421, teisele ei lisa, see on kontroll proov. Mõlemad tuubid inkubeerin 37 kraadi juures 1 tund.
puhul võib DNA vabastamiseks bakterirakku kuumutada üle 90°°C. PRAIMERI SEOSTUMINE (ANNEALING). Praimer on lühike nukleiinhappe lõik (oligonukleotiid pikkusega 20-30 nukleotiidi), mis vastavalt komplementaarsusele seostub (annealing) teatud kindla nukleiinhappe järjestusega. Igal mikroorganismi liigil, geenil, operonil on mingi unikaalne järjestus, mida on võimalik määrata sekveneerimisel, leida need andmed andmebaasidest (GENBANK jne.). Praimerid valitakse ja disainitakse nii, et nad asetseksid huvipakkuvast geenist või nukleotiidide järjestusest „väljaspool“ ja nende vahele jääks 50 kuni 1000 nukleotiidipaari. Kui praimerid panna koos denatureerunud sihtmärk-DNA-ga lahusesse, seostub üks praimer ahela ühele spetsiifilisele kohale (sait S1), samas kui teine ahela teisele kohale (sait S2). Praimerite seostumise protsess toimub temperatuuril ≥50º-58ºC. KOMPLEMENTAARSE AHELA SÜNTEES
alleeli pikkuse erinevus, seda väiksem võib lahutustundlikkus olla. Näiteks 1 nukleotiidilise erinevuse nägemiseks peab suurem lahutusvõime olema agaroosgeelil paarinukleotiidilist erinevust ei erista. Kordused->kordusühikud->kordusjärjetused. Kordused võivad ka järjetuse siseselt natuke erineda. Korduste arv lookuses on erinev alleelid erinevad teineteisest selle poolest, mitu korda seda kordust seal on. Sellega külgnev ala pole polümorfne ja selle vastu disainitakse praimerid. Kui saame vanematelt täpselt samasugused alleelid samade korduste arvuga, on nad sama lookuse suhtes homosügootsed. Tavaanalüüsil kasutatakse erinevaid lookusi eri kromosoomides. Võrdluseks kasutatakse erinevatest proovidest võetud samu lookusi. 4. Mikrovariantsed STR alleelid (definitsioon, tähistamine) ja null-alleelid (esinemine, miks probleemsed). Kõigil alleelides ei ole täispikka kordusühikut osaliste kordusühikutega alleelide tähistamine:
"istutatamine" kummalegi üksikahelale, milleks temperatuur viiakse alla ca 50 °C juurde 30 sekundiks; 3) komplementaarse DNA ahela süntees DNA-polümeraasi toimel (72 °C juures aeg sôltub lôigu pikkusest, kuid ca 1-3 min). Ensüüm on termostabiilne ja on isoleeritud kuumavee allikates elavatest bakteritest (näit. Thermus aquaticus ja temalt saadud ensüümi nimetatakse TaqI). Reaktsioonis kasutatavad komponendid (maatriks DNA, praimerid, ensüüm ja vabad nukkleotiidid- viiakse kohe algselt ühte katsutisse. Kuna ahelreaktsiooni etapid toimuvad erineva temperatuuri juures, siis on kogu protsess juhitav temperatuuri abil ja vastavaid tsükleid vôib korrata kümneid kordi. Igas tsüklis DNA hulk teoreetiliselt kahekordistub. Praktiliselt hilisemates tsüklites on reaktsiooni efektiivsus väiksem, kuna ensüümi aktiivsus langeb, samuti lôpevad otsa vabad nukleotiidid. Neid juurde pole aga vôimalik lisada
Nii saame ahelaid üksteisest eraldad sõltuvalt nende suurusest//. Sandler pani katseklaasides sünteesitud ahelad geelile ja lahutas nad. (mingi radade jama). POLÜMERAASI AHELREAKTSIOON - PCR 12/11/09 Garry Mullis sai Nobeli preemia selle meetodi väljatöötamise eest. DNA sünteesi reaktsiooni jaoks oli vaja DNA polümeraasi (ensüümi), matriits-DNA, dNTP (4). Tegelikult sellisel kombel reaktsiooni ei toimu. Puudu on praimerid (lühike DNA lõik). DNA polümeraas ei suuda hakata nullist DNA ahelat sünteesima, küll aga olemasolevat ahelat pikemaks tegema. Denatureerides (lahti keerutades) kaheahelalist DNA molekuli temperatuuri toimel saame kaks üheahelalist DNA molekuli. Lisades nüüd katseklaasi sobivaid praimereid, suudab polümeraas sünteesida uue ahela ja saame kaks kaheahelalist DNA molekuli. Esimese tsükli alguses DNA proov toatemperatuuril. Tahtes ahelaid lahku viia tuleb proovi tõsta ~100 o ni
(rasvhappe molekulile lisatakse CoA molekul, mille tulemusel tekib atsüül-CoA). Atsüül-CoA transporditakse mitokondrite maatrikssise karnitiini abil. Mitokondrite maatriksis algab -oksüdatsioon. Rasvhapete kataboliseerimine b-oksüdatsioonil toimub: · Maksas · Südames · lihastes 12. Selgitage DNA polümeraaside rolli replikatsiooniprotsessis. Miks vajavad DNA polümeraasid toimimiseks praimereid ja mida praimerid endast kujutavad? DNA-polümeraas sünteesib mõlema DNA ahelaga komplementaarsed uued DNA ahelda, peale seda kui helikaas on DNA kaksikahel lahti keeranud. DNA primaas sünteesib replikatsiooni alguskohale praimeri. DNA polümeraas jätkab praimeri lõpust edasi, liites praimeri 3'-OH otsa järgmise nukleotiidi, selle vabasse otsa järgmise jnejne. 13. Loetlege ja kirjeldage eukarüootse mRNA transkriptsioonijärgse modifitseerimise käigus
51. Erinevate DNA polümeraaside funktsioonid bakterites. Mis mehhanismidega on tagatud DNA replikatsiooni täpsus? Bakteritel on lisaks DNA polümeraasidele I ja III veel vähemalt 3 DNA polümeraasi: Pol I ja Pol II: DNA reparatsioonilised polümeraasid. Lisaks 5' 3' polümeraassele aktiivsusele on Pol I ka 5' 3' ja 3´ 5' eksonukleaasne aktiivsus DNA Pol I osaleb DNA sünteesil mahajäävalt ahelalt, kus see toimub Okazaki fragmentidena, asendades seal RNA praimerid DNA-ga DNA güraas (topoisomeraas II) on tetrameerne valk, mis koosneb kahest subühikust. DNA güraasi on vaja E. coli DNA replikatsioonil vähendamaks replikatsioonikahvli ees tekkivat positiivset superspiralisatsiooni Pol III: põhiline DNA replikatsiooni läbiviija. Polümeraasi õlad sünteesivad erinevaid ahelaid: vasak õlg – juhtivat. Parem õlg – Mahajääva ahela Okazaki fragmente. Pol IV ja Pol V: DNA reparatsioonilised polümeraasid
Esimene aste PRCis on polümerasi aktiveerimine(15min), mis toimub 955С juures. 2. DNA kaksikahela denatureerimine (10 sek) 955С juures 3. Pärast masin jahtub 56 С 5 – ni (sõltub praimeri pikkusest ning CG nukleotiitide sisaldusest) , et praimerid hübridiseeruksid DNAle (20sek). 4. 20 sekundi möödudes, masin soendub 72 С 5 –ni. Selle temperatuuri juures 3 min
paljundatava DNA piirkonna mõlemast otsast.PRC toimub kolmeetapiliselt: 1. Amlifitseeritava DNA denatureerimine emperatuuri toimel (92-95 kraadi juures) 2. DNA renatureerimine temperatuuri langetamisel ülehulgas lisatud sünteetiliste oligonukleotiidsete praimerite juuresolekul, millest üks on komplementaarne amplifitseeritava DNA ühele ahelale, teine selle vastasahelale.Selle toimel hübridiseeruvad praimerid amplifitseeritava DNA ahelatega. 3. DNA replikatsioon ahelate kinnitunud 47.Kromatograafia Keemiliste ühendite füüsikalis-keemiline ükteisest lahutamine, mis põhineb aineosakeste korduval ümberjaotumisel liikuva ja liikumatu faasi vahel. Liikuvas faasis olevas aineosakesed kanduvad selle vooluga kaasa järjekordse siirdumiseni liikumatusse faasi. Viimase põhjustatud liikumispauside kestus
(miljonites koopiates) mõne tunniga. PCR tüüptsüklis võib eristada järgmisi etappe: DNA ahelade lahutamine lühiajalise denatureeriva kuumutamisega. Praimerite hübridisatsioon lahutatud ahelatele. Komplementaarsete praimerite lisamine. PCR puhul pole vaja teada paljundatava DNA-lõigu järjestust. Peab teadma lühikesi järjestusi mõlemal pool paljundatavat lõiku, sest nende järjestuste vastu on loodud komplementaarsed oligonukelotiidid (praimerid). Denatureeritud DNA jahutamisel hübridiseeruvad lisatud oligonukleotiidipraimerid ahelatega, piiritledes paljundatava fragmendi. DNA süntees kuumakindla DNA polümeraasiga. Järgneb uus tsükkel. PCR on DNA-diagnostikas igapäevaselt kasutatav vahend. 1. Võimaldab detekteerida väga vähese DNA materjali olemasolu. 2. Sobiv rohkete mutantsete alleelide kiireks kindlaks tegemiseks geneetiliste haiguste puhul. 3
PCR tüüptsüklis võib eristada järgmisi etappe: DNA ahelade lahutamine lühiajalise denatureeriva kuumutamisega. Praimerite hübridisatsioon lahutatud ahelatele. Komplementaarsete praimerite lisamine. PCR puhul pole vaja teada paljundatava DNA-lõigu järjestust. Peab teadma lühikesi järjestusi mõlemal pool paljundatavat lõiku, sest nende järjestuste vastu on loodud komplementaarsed oligonukelotiidid (praimerid). DNA süntees kuumakindla DNA polümeraasiga. Järgneb uus tsükkel. PCR on DNA-diagnostikas igapäevaselt kasutatav vahend. 1. Võimaldab detekteerida väga vähese DNA materjali olemasolu. 2. Sobiv rohkete mutantsete alleelide kiireks kindlaks tegemiseks geneetiliste haiguste puhul. 3. Vajalik geneetilise polümorfismi uuringute läbiviimisel 4. Vajalik kohtumeditsiinilistes uuringutes. 60
kopeerub katkematult, mahajääv ahel kopeerub segmentide kaupa (Okazaki fragmendid), mis seejärel omavahel ühendatakse Replikatsiooni ensüümid: DNA polümeraasid - katalüüsivad 3'®5' fosfodiester- sidemete sünteesi : DNA polümeraas III - peamine replikatsiooni ensüüm, vajab RNA praimereid ; 10 subühikut, kiirus kuni 1 kb/s DNA polümeraasid I, II ja V - osalevad peamiselt vigade parandamisel DNA Polümeraas I lõikab praimerid välja ja täidab lüngad Helikaasid kaksikheeliksi lahtikeeramine DNA güraas e. topoisomeraas lahtikeerdumisest tingitud pingete kompenseerimine, st DNA ahela läbilõikamine ja taas-ühendamine DNA primaas oligonikleotiidsete RNA-praimerite süntees DNA ligaas ühendab Okazaki fragmendid DNA polümeraas I liidab desoksüribonukleosiid-monofosfaadi (dNMP) ühikud praimeri (ssDNA) 3'-otsa. Telomeerid eukarüootsete kromosoomide lõpus paiknevad G-rikkad, 5...8 bp
koopiates) mõne tunniga. PCR tüüptsüklis võib eristada järgmisi etappe: 1. DNA ahelade lahutamine lühiajalise denatureeriva kuumutamisega. 2. Praimerite hübridisatsioon lahutatud ahelatele. Komplementaarsete praimerite lisamine. PCR puhul pole vaja teada paljundatava DNA-lõigu järjestust. Peab teadma lühikesi järjestusi mõlemal pool paljundatavat lõiku, sest nende järjestuste vastu on loodud komplementaarsed oligonukelotiidid (praimerid). Denatureeritud DNA jahutamisel hübridiseeruvad lisatud oligonukleotiidipraimerid ahelatega, piiritledes paljundatava fragmendi. 3. DNA süntees kuumakindla DNA polümeraasiga. Järgneb uus tsükkel. PCR on DNA-diagnostikas igapäevaselt kasutatav vahend. 1. Võimaldab detekteerida väga vähese DNA materjali olemasolu. 2. Sobiv rohkete mutantsete alleelide kiireks kindlaks tegemiseks geneetiliste haiguste puhul. 3. Vajalik geneetilise polümorfismi uuringute läbiviimisel 4
"istutatamine" kummalegi üksikahelale, milleks temperatuur viiakse alla ca 50 °C juurde 30 sekundiks; 3) komplementaarse DNA ahela süntees DNA-polümeraasi toimel (72 °C juures aeg sôltub lôigu pikkusest, kuid ca 1-3 min). Ensüüm on termostabiilne ja on isoleeritud kuumavee allikates elavatest bakteritest (näit. Thermus aquaticus ja temalt saadud ensüümi nimetatakse TaqI). Reaktsioonis kasutatavad komponendid (maatriks DNA, praimerid, ensüüm ja vabad nukkleotiidid- viiakse kohe algselt ühte katsutisse. Kuna ahelreaktsiooni etapid toimuvad erineva temperatuuri juures, siis on kogu protsess juhitav temperatuuri abil ja vastavaid tsükleid vôib korrata kümneid kordi. Igas tsüklis DNA hulk teoreetiliselt kahekordistub. Praktiliselt hilisemates tsüklites on reaktsiooni efektiivsus väiksem, kuna ensüümi aktiivsus langeb, samuti lôpevad otsa vabad nukleotiidid. Neid juurde pole aga vôimalik lisada
41.DNA sekveneerimine. Järjestuse määramine. Praegu on kasutusel ensümaatiline meetod, kus DNA polümeraas lisab vahetevahel ahela sünteesi käigus dNTP asemel didesoksünukleotiidi, mis lõpetab antud ahela pikenemise. Märgistatud DNA aheladtuvastatakse geel-elektroforeesi pikkuse järgi. 42.Polümeraasi ahelreaktsioon. PCR. Võimaldab eksponentsiaalselt paljundada uuritavad DNA-d. Põhineb: termostabiilne DNA polümeraas; komplementaarsed praimerid meid huvitavale järjestusele; tsükleerimine (ahelate lahtisulatamine 95o 20 s; praimerite paardumine 50-650 20 s; ahelate sünteesimine 72o 1 min; seda kokku 30-40 korda). 43.Elektroforees. 44.Nukleiinhapete hübridiseerimine. Kindla NA järjestuse tuvastamine NA molekulide segust kasutades komplementaarsusel põhinevat üksikahelate paardumist. 1) geelis lahutatud DNA/RNA kantakse üle (nailon)membraanile, nii et nad oleksid üksikahelad. 2) meid huvitav
annaabi.ee 
