Molekulaarbioloogia konspekt (1)

1
Õppevahend: Molekulaarbioloogia üldkursuse lühikonspekt
Põhiline õpik on B. Lewin “ Genes ” V ja VI väljaanne, edasises tekstis on viiteid Genes
VI joonistele (kui pole eraldi märgitud) ja üksikutel teemadel detailsematele
materjalidele. Kursiivis on esitatud lõigud, mis on mõeldud täindavaks lugemiseks aga
ei ole “kohustuslikud”.
Sissejuhatus
Molekulaarbioloogia on termin, mis võeti kasutusele selle sajandi teisel
poolel peale esimeste makromolekulide ruumilise struktuuri kindlakstegemist. Esialgu
tähistaski see termin just struktuurset bioloogiat molekulaarsel tasemel. Seega on
molekulaarbioloogia oma algses tähenduses keemia ja füüsika meetodeid kasutav
bioloogia osa, mis tegeleb bioloogiliste makromolekulide ruumilise struktuuri ja
struktuuri ning funktsiooni vaheliste seoste kindlakstegemisega. Hiljem, kui sama
teaduse piirid on ähmastunud seoses teadmiste laienemisega ja uute probleemide
kerkimisega, on kasutusele võetud termin - molekulaargeneetika. Sisulist vahet nende
kahe termini vahele ei ole. Molekulaarbioloogia (või molekulaargeneetika) tegeleb
päriliku informatsiooni kodeerimise, säilitamise ja ülekande mehhanismide uurimisega,
aga samuti päriliku informatsiooni realiseerumise molekulaarsete mehhanismidega st.
kuidas geenides sisalduv informatsioon määrab elusorganismide ehituse ja nende
funktsioneerimise . Seejuures ongi molekulaarbioloogia üks keskseid probleeme
füüsikalis-keemiliste struktuuride ja biokeemilis-füsioloogiliste funktsioonide
vastavuse uurimine . Molekulaarbioloogia sündi on kirjeldanud J. Watson oma raamtus
“ Double helix ” (e. k. Kaksikspiraal, “Loomingu” Raamatukogu, 1972). DNA on ilus
näide selle kohta kuidas makromolekuli struktuuri tundmaõppimine lõi eelduse pärilike
protsesside - geneetilise informatsiooni säilitamise ja paljundamise
kindlakstegemiseks. Just DNA komemõõtmelise struktuuri kindlakstegemine pani aluse
molekulaarbioloogiale.
1. Molekulaarbioloogia dimensioon
Molekulaarbioloogia on suures osas struktuurne teadus, mis tegeleb
bioloogiliste makromolekulide ja nende funktsionaalsete komplekside struktuuriga ja
uurib nende struktuuride tekke füüsikalis-keemilisi aluseid. See osa
molekulaarbioloogiast on analoogiline anatoomiale, ainult et molekulaarbioloogia
tegeleb molekulide ehitusega ja seega mikromaailmaga. Kovalentse keemilise sideme
pikkus on keskmiselt 1,4 Å (ongströmi, 1 Å = 10-10 meetrit). Sellest piirist väiksemate
suurustega molekulaarbioloogia reeglina ei tegele. Suuremad makromolekulide
kompleksid on kuni 300 Å läbimõõduga, mis on enamasti molekulaarbioogia ülemine
piir. Suuremate struktuuridega tegeleb juba rakubioloogia .
Järelikult on molekulaarbioloogia dimensioon ühest kuni mõnesaja ongströmini ehk
10-10 - 3·10-8 meetrit.
 Mõned näited:
kaheahelaline DNA ja kaheahelaline RNA, biheeliksi (kaksikspiraali) diameeter - 20 Å
keskmine  globulaarne valk, molekulmassiga 50 000 daltonit, diameeter - 50 Å
bakteriaalne RNA polümeraas (koosneb neljast globulaarsest valgust) molekulmassiga
500 000 daltonit, dimensioonid 90x90x160 Å
nukleosoom (DNA valkudega pakitud struktuuriüksus kromosoomides), molekulmassiga
300 000 daltonit, dimensioonid 60x110x110 Å
2
bakteriaalne ribosoom , molekulmass 2,5 megadaltonit, dimensioonid 200x200x230 Å
Rakubioloogia väiksemad uurimisobjektid on näiteks tuumapoorid, molekulmassiga
100 megadaltonit ja dimensioonidega 120x120x75 nm (1 nm = 10 Å).
Teine osa molekulaarbioloogiast sarnaneb füsioloogiale ja tegeleb vastavalt
molekulide funktsioonidega ja omavaheliste seostega. Nii nagu füsioloogiat ei saa
mõista ilma anatoomiat tundmata, ei saa ka molekulide funktsioone uurida ilma nende
struktuuri tundmata. Molekulaarbioloogia põhiline ülesanne ongi tundma õppida
molekulide “anatoomiat” ja “füsioloogiat” ehk nende struktuure ja funktsioone ja eriti
struktuuri ning funktsiooni vahelisi seoseid .
2. Molekulaarbioloogia põhidogma
Geneetilise informatsiooni ülekande suunda DNA ↔ RNA → valk nimetatakse
oma keskse tähtsuse tõttu molekulaarbioloogia põhidogmaks. Kuni 1969. aastani oli
molekulaarbioloogia põhidogma DNA → RNA → valk. 1969. aastal avastati uus
ensüüm - RNA-sõtuv DNA polümeraas ehk pöördtranskriptaas ehk revertaas, mis
katalüüsib DNA sünteesi RNA matriitsilt ja seega sai selgeks, et DNA’d sünteesitakse
nii DNA kui RNA alusel. Revertaas leiti esialgu imetajate RNA viirustest
(retroviirustestest), aga hiljem selgus, et see ensüüm on looduses väga laialt levinud nii
eu- kui prokarüootides.
Geneetilise informatsiooni ülekande kolm põhilist protsessi on:
1. Replikatsioon  - päriliku materjali (mis võib olla nii DNA kui RNA)
kahekordistumine. Elusorganismide geneetiline informatsioon on säilitatud
kaheahelalise DNA kujul. Erandi moodustavad mõned RNA viirused , mille geneetilise
materjali kandjaks on RNA. RNA viiruste puhul on replikatsioon RNA
kahekordistumine. Ülejäänud organismidel on replikatsioon DNA kahekordistumine.
Replikatsioon on DNA süntees. DNA süntees toimub liskas replikatsioonile veel
rekombinatsiooni ja reparatsiooni käigus. Teiselt poolt on replikatsioon laiem mõiste
kui DNA süntees hõlmates ka RNA praimeri sünteesi, DNA ja kromosoomi struktuuri
muutusi ja replikatsiooni regulatsiooni. DNA sünteesi viib läbi ensüüm - DNA-sõltuv
DNA polümeraas, kusjuures substraatideks on desoksü- nukleosiid 5’-trifosfaadid.
2. Transkriptsioon  - RNA süntees. Transkriptsioon tähendab mahakirjutamist ja
tähistab molekulaarbioloogias RNA sünteesi DNA matriitsi alusel. RNA sünteesi
regulatsioon on geeni aktiivsuse regulatsiooni põhiline tase. Seega on transkriptsiooni
regulatsioon väga oluline makromolekulide sünteesi kontrollmehhanism.
Transkriptsiooni viib läbi DNA-sõltuv RNA polümeraas. RNA polümeraase on väga
palju erinevaid tüüpe. Eukarüootides on kolm erinevat RNA polümeraasi, mis
sünteesivad erinevaid RNA molekule. RNA sünteesil on substraatideks (ribo-)
nukleosiid 5’-trifosfaatidest. Sünteesitud RNA ahel vastab üks-üheselt temaga
antiparalleelsele DNA matriitsahelale komplementaarsusprintsiibi alusel. RNA
järjestusega identset DNA ahelat nimetatakse kodeerivaks ahelaks. RNA sünteesi
käigus toimub DNA ahelate lahtiharutamine. Algne DNA struktuur taastub peale
transkriptsiooni lõppu. Transkriptsiooniga on seotud RNA protsessing ja
modifitseerimine.
3. Translatsioon  - valgu biosüntees. Translatsioon tähendab tõlkimist.
Molekulaarbioloogias tähendab translatsioon RNA (seega ka DNA) nukleotiidse
järjestuse tõlkimist valkude aminohappeliseks järjestuseks. Valkude sünteesiks
vajalikku geneetilist informatsiooni kannab mRNA (matriits- ehk informatsiooniline -
RNA). Valgu biosünteesi viib läbi ribosoom - RNA’st ja valkudest koosnev organoid .
3
Aminohapped seatakse ribosoomi abil vastavusse mRNA’s sisalduva geneetilise
informatsiooniga tRNA (transport-RNA) vahendusel. Aminohappe sidumine vastava
spetsiifilise tRNA molekuliga toimub ensüümide - aminoatsüül-tRNA süntetaaside ehk
aminoatsüül-tRNA ligaaside (ARS e. ARL) vahendusel. Aminoatsüül-tRNA (aa-tRNA)
süntees on valgu biosünteesi esimene, preribosomaalne etapp. Ribosoomides, kus
toimub valgusünteesi teine ehk ribosomaalne etapp, seatakse vastavusse mRNA’s
paiknev kolmest järjestikusest nukleotiidist koosnev  koodon  tRNA’s sisalduva
antikoodoniga. Ribosoom sünteesib tRNA küljes olevate aminohapete vahele
peptiidsideme. Kasvav peptiidahel on sünteesi käigus tRNA’ga kovalentselt seotud.
Valgu biosünteesil osalevad veel paljud valgulised faktorid , ATP ja GTP ning veel
mitmed molekulid, mida käsitleme valgusünteesi peatükis. Valkude ruumilise struktuuri
moodustumine toimub nii translatsiooni käigus kui peale seda. Valgud viiakse
organismis vajalikesse kohtadesse  valkude transpordi teel.
Geen - pärilikkuse ühik. DNA lõik, mis kodeerib eralduvat produkti
RNA genoomide puhul RNA lõik.
Eraldub produkt võib olla nii RNA kui valk. Algselt sünteesitakse valkude puhul
mRNA, mis aga ei ole info ülekande mõttes lõplik produkt. mRNA alusel sünteesitakse
valk.
DNA kodeerib eelkõige iseennast , aga see ei ole eralduv produkt, kuna jääb DNA
poolkonservatiivse replikatsiooni tõttu matriitsahelaga seotuks.
Geenid on kodeeritud ühe ahela poolt ja vastasahel kodeerimisel ei osale. Pikema
DNA lõigu ulatuses võivad siiski mõlemad ahelad kodeerida, osa geene paikneb ühel
ja osa teisel ahelal.
Geenid on DNA nukleotiidsed järjestused ja koosnevad mitmetest osadest:
-regulaatorpiirkonnad, mis paiknevad tavaliselt geeni alguses, aga võivad asetseda ka
geeni sees või osaliselt väljaspool geeni, geenist endast kaugel. Regulaatoralade hulka
kuuluvad ka terminaatorjärjestused, mis määravad RNA sünteesi lõpetamise.
- kodeeriva osa, millelt sünteesitakse RNA.
-nn., struktuurne osa mis vastab produktis sisalduvale pärilikule infole. Kuna peale
RNA sünteesi läbib RNA protsessingu, mille käigus osa järjestustest eemaldatakse, siis
ei satu kogu DNA kodeeriv osa produkti.
Prokarüootide geenid on tavaliselt pidevad , DNA järjestuse struktuurne osa paikneb
pideva järjestusena ja kopeeritakse produkti. Prokarüootsed geenid on enamasti
organiseeritud operonidesse, milles on mitut produkti kodeerivad järjestused ühise
regulaatori kontrolli all.
Eukarüootide geenid on enamasti katkendlikud, sisaldavad introne ja eksone. Geeni
primaarne produkt mRNA, läbib splaissingu, mille käigus osa RNA järjestusest
eemaldatakse. Intronid eemaldatakse. Eksonid jäävad alles ja nende ühendamise
(splaissingu) tulemusel tekib küps mRNA. (Inton- ekson skeem)
Ka küpses mRNA's on mittekodeerivad järjestused, nn liider ja treiler vastavalt mRNA
alguses (5' osas) ja lõpus (3' osas).
Ka ühe geeni intronid võivad kodeerida produkte, nn. intron kodeeritud produktid . Siia
kuuluvad mitmed väikesed RNA molekulid (snoRNA).
Imetajate geenides on paljude eksonite ühendamine võimalik mitmel erineval viisil,
mõned intronid on võimalik välja jätta. See protsess on alternatiivne splaissing , mille
4
puhul on ühel geenil mitu võimalikku produkti. Seega geenid ei ole alati
ühetähenduslikud.
Funktsionaalselt on geenid struktuursed ja regulaatorgeenid : struktuurgeenid kodeerivad
valke ja RNA molekule, mis viivad läbi rakkudes eluprotsesse. Regulaatorgeenide
poolt kodeeritud produktid, mis võivad samuti olla nii RNA kui valgulised,
reguleerivad teiste geenide avaldumist .
Eriline geenide rühm on nn. koduhoidjad geenid (housekeeping), mis avalduvad
hulkraksetes organismides igas rakus ja ainuraksetes organismides avalduvad nad
konstitutiivselt st. pidevalt (kui organism ei ole stressis ja geenid represseeritud).
Koduhoijatel geenidel on eriline struktuur, nende 5' osas paikneb oligopürimidiin
järjestus nn. TOP geenid. Just TOP geenide intronites on sageli veel teisigi kodeerivaid
järjestusi, mis samuti kuuluvad koduhoidjate geenide hulka. See on omamoodi geenide
kattumine, kus informatsioon küll füüsiliselt ei kattu. Siiski on mõlema geeni produktid
reguleeritud ühise kontrolljärjestuse poolt.
Geenide kattumine esineb väga ulatuslikult prokarüootides, esineb nii mRNA tasemel
geeni kattumist (siin on oluline lugemisraam , mida käsitleme lähemalt geneetilise koodi
juures) kui DNA tasemel kattumist, mis viib erinevate mRNA molekulide sünteesile.
Eriti oluline on geenide kattumine viiruste juures (parasiteerivad molekulid aga siiski
mikro -organismid).
DNA järjestuste võrdlemine:
4st nukleotiidist koosnevate DNA järjestuste võrdlemisel on igas positsioonis iga
nukleotiidi formaalne tõenäosus 25% ja seega on minimaalne kahe järjestuse vaheline
homoloogia st. homoloogia puudumine 25%. Järjestuse homoloogia alusel jagatakse
geenid perekondadesse ja superperekondadesse.
Geenid jagatakse järjestuse ja funktsiooni sarnasuse alusel Homoloogideks - järjestus
homoloogiline ja funktsioon sarnane, paraloogideks - järjestus homoloogiline,
funktsioon erinev ja ortoloogideks.
Tuleb teha vahet DNA homoloogia geeni homoloogia vahel.
Tüüpiline paraloogsete geenide näide on pseudogeenid , mis moodustavad suure osa
hulkraksete genoomidest.
Geenide võrdlemisel on oluline osa mitte kogu järjestuse globaalsel homoloogial vaid
lõikude leidmisel, mis on suure homoloogiaga. Eriti olulised on sellised kõrge
homoloogiaga lõigud valgu geenide võrdlemisel. Valkudes on järjestuse motiivid,
perekondade piires konserveerunud järjestuse elemendid, mis sageli koosnevad
lühikestest lõikudest, aga need lõigud peavad olema kindals järjestuses. Näiteks DEAD
motiiv on omane RNA (ja vahel ka DNA helikaasidele). Järjestuse võrdlemise alusel
on võimalik tundmatu funktsiooniga geenile ennustada tema produkti võimalikku
funktsiooni. Siit tuleneb pööratud geneetika . Tavaline geneetika otsib mutatsioone
funktsiooni muutuse kaudu, siis pööratrud geneetika otsib funktsiooni muutust järjestuse
muutmise tulemusel. Teiselt poolt otsib ta funktsioone olemasolevatele järjestustele.
DNA järjestuste võrdlemine on aluseks molekulaarsele evoltusiooniteooriale. Näiteks
tuleb tuua eksonid, mis ei varieeru kuigi suures ulatuses ja intronid, mis on suure
järjestuse varieeruvusega. Oletatavasti hoiab eksonite järjestusi varieerumast looduslik
valik.
5
I Bioloogiliste makromolekulide struktuur ja seda mõjutavad jõud
Geneetiliselt kodeeritud makromolekulid ( nukleiinhapped ja valgud) on polümeerid,
mis koosnevad suhteliselt väikesest arvust monomeeridest. Monomeerid sisaldavad
identset osa, mis omavahel ühendatuna moodustavad polümeeri selgroo . Viimase
küljest hargnevad monomeeride külgahelad. Geneetiliselt on kodeeritud
biopolümeeride monomeeride järjestus ehk primaarstruktuur . Samast järjestusest võib
moodustuda mitu erinevat ruumilist struktuuri ( sekundaar - ja tertsiaarstruktuuri
tasemel). Praeguste teadmiste juures ei ole veel võimalik täpselt ennustada valkude
(aga ka RNA) ruumilist struktuuri tuginedes üksnes nende primaarstruktuurile. Mitme
valgu puhul on ka teada, et nad võivad looduses eksisteerida mitmes erinevas ruumilise
struktuuri vormis (kuigi primaarstuktuur on sama).