9. Lasime alumise kihi ehk veekihi ja 1-2 tilka orgaanilisest kihist jaotuslehtri all olevasse keeduklaasi. 10. Ülejäänud orgaanilise kihi ehk ekstrakti ehk planaarkromatograafia proovi lasime Eppendorfi tuubi. Taimelehtedes leiduvate värvainete eraldamine planaarkromatograafilisel meetodil: 1. Valmistasime elueerimisnõusse (siin keeduklaas) heksaanist ja etüülatsetaadist (suhtes 3:1 ehk ~3ml heksaani ja ~1ml etüülatsetaati) eluendi. Jälgisime, et eluenti oleks keeduklaasi põhjas kindlasti alla 1cm ( ~0,5 – 0,7 cm). 2. Sulgesime elueerimisnõu voolutusnõu kaanega, et et keeduklaas saaks eluendi aurudega küllastuda (protsessi kiirendamiseks võis ka elueerimisnõud kaanega vaikselt loksutada). 3. Valmistasime ette planaarkromatograafiaplaadi. Tõmmates hariliku pliiatsiga plaadile ~1 cm kaugusele alumisest servast stardijoone ja märkides sellele väikese ristikesega
elueerimistmaht. Ained, mis täielikult difundeeruvad geeli pooridesse, väljuvad kolonnist kõige aeglasemalt ja maksimaalse elueerimismahuga. See on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule. Seega saab protsessi lugeda lõppenuks, kui kolonnist väljunud vedeliku maht võrdub ligikaudu kolonni kogumahuga. Eluaadi fraktsioonides sisladuva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vaheline graafiline sõltuvus on kromatogramm. Tüüpiline kromatografeerimissüsteem:kolonn, eluendi reservuaar ja automaatne fraktsioonikogur. Kolonni ülaosa on suletud korgiga, mida läbib klaastoru, mis ühendatakse kolonnist kõrgeval asetseva eluendi reservuaariga siis algab kolonni väljavoolukraani avamisel kohe eluendi kogumine. Meie töös kasutame: klaaskolonn, mis on eelnevalt täidetud pundunud dekstraangeeliga Sephadex. Kolonn on kinnitatud statiivi külge ja selle alumine osa on täidetud klaasvillaga.Täidise kõrgus
Ainete väljumis- ehk elueerimismahtusid näitavad nende fraktsioonide elueerimismahud, milles vastava aine kontsentratsioon on kõige kõrgem (graafikul tipule vastav maht). Kromatografeerimissüsteem koosneb kolonnist, eluendi reservuaarist ja automaatsest fraktsioonikogurist ehk kollektorist. Kolonni ülaosa on suletud korgiga, mida läbib klaastoru, mis ühendatakse kolonnist kõrgemal aletseva eluendi reservuaariga. Väljavooliukraani avamisel hakkab koheselt eluendi pealevool kolonni täidisele ja fraktsioonikoguri käivitamisel algab
1. AINE: Suurte, geeli pooridesse mittemahuvate molekulide elueerumisprofiilid 2. AINE: geeli pooridesse osaliselt difundeeruvate molekulide elueerumisprofiilid 3. AINE: pooridesse täielikult difundeeruvate molekulide elueerumisprofiilid Ainete väljumis- ehk elueerumismahtusid näitavadnende fraktsioonide elueerumismahud, milles vastava aine kontsentratsioon on kõrge (,,tipule" vastav maht) Tüüpiline kromatografeerimissüsteem koosneb: - Kolonnist - eluendi reservuaarist - automaatsest fraktsioonikogurist ehk kollektorist PÕHILINE MEHHANISM: Kolonni ülaosa on suletud korgiga, mida läbib klaastoru, mis ühendatakse kolonnist kõrgemal asetseva eluendi reservuaariga. Kolonni väljavoolukraani avamisel algab kohe eluendi pealevool kolonni täidisele ja fraktsioonikoguri käivitamisel on võimalik kolonnist välja voolavaid fraktsioone automaatselt õiges mahus koguda.
läbi kolonni transportida ja erineva molekulmassiga ained saaksid üksteisest eralduda, voolitatakse ehk elueeritakse kolonni sobiva vesilahusega. Kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Igat ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimis-ehk väljumismaht Vx , millearvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Erineva molekulmassiga ainete väljumismahte tähistatakse V x1,Vx2 jne. Vx- eluendi maht, mille juures väljuv fraktsioon on maximaalne. Liiga suured molekulid, mis ei mahu geeli pooridesse, väljuvad kolonnist kõige kiiremini, st et neil on minimaalne elueerimismaht V x min , see on võrdne vaba vedeliku mahuga. Vx min= Vv Need ained, mis on liiga väikse molekulmassiga, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse, liiguvad kolonnis aegaselt ja väljuvad kõige hiljem, need väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, milline on arvväärtuselt lähedane kasutatava
rõhku ja suuremaid vooluskiiruseid. 26. Vedelikkromatograafi ehitus Koosneb solvendist, degasaatorist, pumpadest, sisestus, kolonn, detektor. 27. Tugevad ja nõrgad mobiilsed faasid (tooge näide) Tugev mobiilne faas - solvent, mis viib kiiresti analüüdi läbi kolonni. Nt vesi Nõrk mobiilne faas - solvent, mis viib aeglaselt analüüdi läbi kolonni. Nt Heksaan 28. Isokraatne ja gradientelueerimine Isokraatne elueerimine - eluendi koostis analüüsi käigus ei muutu. Gradient elueerimine - eluendi koostis muutub analüüsi käigus. Sobib väga hästi keerulistele ainete segule; hea lahutuvus terve kromatogrammi ulatuses; parem tundlikkus hiljem elueeruvatel piikidel. Kuid kromatograaf vajab binaarseid pumbasüsteeme ja meetodi väljatöötamine nõuab aega. 29. Normaalfaasi kromatograafia põhimõte Statsionaarne faas on polaarne ja mobiilne faas on mittepolaarne.
maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on arvuliselt lähedane kolonni kogumahule Vt. Seega võib kromatograafilise protsessi lugeda lõpetatuks, kui kolonnist väljunud vedeliku üldmaht võrdub ligikaudu kolonni kogumahuga. Kromatogrammiks nimetatakse eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust. Kromatografeerimissüsteem koosneb kolonnist, eluendi reservuaarist ja automaatsest fraktsioonikogurist. Selles praktikumis kasutatakse klaaskolonne, mis on eelnevalt täidetud pundunud dekstraangeeliga Sephadex. Vältimaks täidise väljavoolamist on kolonni alumine osa täidetud klaasvillaga. Kolonn on kinnitatud statiivi külge nii, et selle alla mahuks katseklaas. Täidise kõrgus on tavaliselt 25- 30 cm, täidise kohal umbes 3-4 cm kõrgune vaba eluendi kiht. Eluendi lisamine ja fraktsioonide kogumine toimub käsitsi.
Tekkinud ioonid on tihti kõrge energiaga ning fragmenteeruvad osaliselt, tekivad mitmesugused väiksema massiga ioonid (ja neutraalsed fragmendid) Kõik ioonid suunatakse massianalüsaatorisse, mis registreerib nende masside ja laengute suhted m/z · Massispektromeeter registreerib ainult laetud osakesi. Vedelikkromatograafia Kromatograafiline kolonn on tihedalt täidetud statsionaarse faasiga (liikumatu faasiga): See toob kaasa vajaduse kasutada kõrget rõhku eluendi surumiseks läbi kolonni. HPLC - kõrgsurve vedelikkromatograafia. HPLC aparatuuri ehitus skemaatiliselt, kus 1 pudelid eluentidega, 2 eluendi degaseerija, 3 gradientkraan, 4 eluendi sisestamise nõu, 5 kõrgsurve pump, 6 kraan sisestamise asendis, 6' kraani laadimisasend, 7 silmus, 8 eelkolonn, 9 kromatograafiline kolonn, 10 detektor, 11
k = 0.1 Vg = k*Vt = 0,1* 78,85 = 7, 885 cm3 Geelimatriksi mahust lähtuvalt leiame antud kolonnile iseloomulik maksimaalne elueerimismaht V xmax Vxmax =Vt-Vg = 78.85 7,886 = 70,96 cm3 Kui fraktsioonide mahuks võtta 2 ml, siis peaks kokku saama 71/2=35 fraktsiooni. Kromatografeerimissüsteemi koostamine Kolonni üleosa suletakse korgiga, mida läbib klaastoru. Kolonni hoidva statiivi külge kinnitakse kolonnist kõrgemale eluendi reservuaar ja ühendatakse kolonniga. Kontrollitakse, et reservuaaris oleks küllaldaselt vedelikku. Avades kollondi ja eluendi resesrvuaari vahel oleva kraani ning seejarel kolonni väljavooluava, hakkab vedelik aeglaselt läbi kolonni voolama. Proovide ettevalmistamine ja sisestamine Uuritav segu koosnes kolmest ainest: Dekstraansinine, müoglobiin ja DNP-aspartaat, millest kõik ained on värvilised. Proovi doseerimiseks ja kolonni sisestamiseks kasutasin süstalt
Optiline tihedus määrab aine kontsentratsiooni. Väljunud vedelik kogutakse 2ml fraktsioonidena katseklaasidesse, et neid saaks spektromeetriliselt mõõta. Vastavalt fraktsiooni värvile mõõdetakse tema optiline tihedus kindlal lainepikkusel. Optiline tihedus määrab aine kontsentratsiooni. Töö käik Ettevalmistus · Kolonni üleosa suletakse korgiga, mida läbib klaastoru. · Kolonni hoidva statiivi külge kinnitakse kolonnist kõrgemale eluendi reservuaar ja ühendatakse kolonniga. Kontrollitakse, et reservuaaris oleks küllaldaselt vedelikku. · Avades kollondi ja eluendi resesrvuaari vahel oleva kraani ning seejarel kolonni väljavooluava, hakkab vedelik aeglaselt läbi kolonni voolama. Lahuse sisestamine kolonni . · lahuse kolonni sisestamiseks kasutasin süstalt. Süstal täidetakse prooviga ja viiakse kolonni, juhtides vooliku otsa läbi voolukihti umbes 5mm kaugusele geeli pinnast. Elueermine
geelimatriksi maht Vg k = 0.1 Vg = k*Vt = 0,1* 97,37 = 9,734 cm3 Geelimatriksi mahust lähtuvalt leiame antud kolonnile iseloomulik maksimaalne elueerimismaht Vxmax Vxmax =Vt-Vg = 97.37 9,734 = 87,6= 88 cm3 Kui fraktsioonide mahuks võtta 2 ml, siis peaks kokku saama 88/2=44 fraktsiooni. Kromatografeerimissüsteemi koostamine Kolonni üleosa suletakse korgiga, mida läbib klaastoru. Kolonni hoidva statiivi külge kinnitakse kolonnist kõrgemale eluendi reservuaar ja ühendatakse kolonniga. Kontrollitakse, et reservuaaris oleks küllaldaselt vedelikku. Avades kollondi ja eluendi resesrvuaari vahel oleva kraani ning seejarel kolonni väljavooluava, hakkab vedelik aeglaselt läbi kolonni voolama. Proovide ettevalmistamine ja sisestamine Uuritav segu koosnes kolmest ainest: Dekstraansinine, müoglobiin ja DNP-aspartaat, millest kõik ained on värvilised. Proovi doseerimiseks ja kolonni sisestamiseks kasutasin süstalt. Süstal täidetakse
see ,,tipule" vastav maht. Praktikumis kasutatakse klaaskolonne, mis on juba eelnevalt täidetud pundunud dekstraangeeliga Sephadex. Väiksema poorsusega, st tihedamad, Sephadex'i margid on mehaaniliselt tugevamad ja võimaldavad kolonni suhteliselt kiiret voolutamist. Kolonni alumine osa on täidetud klaasvillaga, et täidis ei saaks välja voolata. Kolonn on statiivi küljes ning selle alla peab mahtuma katseklaas. Täidise kõrgus on tavaliselt 25-30 cm ja täidise kohal on tavaliselt 3-4 cm eluendi kiht. Ainete kontsentratsioonide kindlaks määramiseks eluaadi fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrilist meetodit. Katse käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine Kolonni täidis: Sephadex G-75, mis on dekstraantäidis, fraktsioneerimispiirkonnaga 3000- 80000 daltonit. Kolonni iseloomustav tegur k=0,1 Geelisamba kõrguseks mõõtsin: L=18 cm Geelisamba diameetriks mõõtsin: d=2,8 cm r=1,4 cm Arvutan täidise kogumahu: Vt=r2**L Vt=1,42*3,14*18=110,78 cm3
ja kolmas täpp 1 x Black GSP. Seejärel asetatakse plaat klaasnõusse, kuhu on eelnevalt lisatud eluent 80%-line 2-propanool- vesi, vahekorras Töövahendid: Värvained, värvainete lahusti 75% etanool, eluent: 80 4:1 (40 ml + 10 ml). Klaasinõus jälgitakse eluendi tõusmist %-line 2-propanool-vesi, õhukesekihi plaat (silikageel 60 lõpujooneni, mis asub plaadi stardijoonest 70 mm kõrgusel. Plaat alumiiniumfoolium, tootjafirma MERCK), põleti, klaastoru, viil, eemaldati anumast, kui eluent oli jõudnud 68 mm kõrgusele. Plaat joonlaud, harilik pliiats, suletav klaasnõu, filterpaber. kuivatati peale klaasnõust eemaldamist ning sellel teostati mõõtmised ja
suurusi ning arve töö käigust arusaamiseks ning hilisemate arvutuste tegemiseks. Samuti valmistan kolonni tööks ette, et töö kulgeks sujuvalt ning ilma takistusteta ja asjaoludeta, mis võikisd katseandmeid moonutada. Seejärel hakkan segu komponente lahutama, et saaksin määrata eluendi mahud kuni segus sisalduvate ainete kõrgeimate kontsentratsioonidega fraktsiooni väljumiseni. Seejärel sisestan proovi, et saaks alata vedeliku voolamine läbi kolonni ning ained segust saaksid hakata eralduma. Vaatlesin oma uuritava segu koostist, et teaksin mis ained ja mis järjekorras hakkavad kolonnist väljuma. Seejärel asun kolonni voolutama, et ained kanduksid koos voolutiga
Teoreetilised alused: Geelkromatograafia kromatograafia meetod, mille põhjuseks on lahuses sisaldavate ainete lahutamine nende moleekulmassi suuruse järgi. Põhiliselt kasutatakse erinevate biomolekulide lahutamiseks orgaanilistest lahustest. Meetodi põhimõte: lahuse sisaldavad molekulid liiguvad läbi geeli erinevate kiirusega sõltuvalt molekuli suurusest. Tüüpiline kromatografeerimissüsteem koosneb kolonnist, eluendi reservuarist ja kollektorist. Kolonn süsteem, kus viiakse geelkromatograafia protsess. Kolonn on täidetud geeligraanulitega, mille pooride mõõtmed on samas suurusjärgus lahuses sisaldavate makromolekulide dimensioonidega. Selleks, et transpordita uuritava segu läbi kolonni ja lahutada teineteisest erinevate massidega molekulid, elueeritakse lahuse läbi kolonni ja kogutakse kindla fraktsiooni mahuga (meie juhul 2 ml).
elueerimismaht Vx vaadeldavas kolonnis on kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf, mis arvutatakse vastavalt valemile: Rf = Vx Vxmin / Vxmax Vxmin Rf arvväärtused jäävad vahemikku 0....1 (0 < Rf < 1). Kromatogreerimissüsteem Tüüpiline kromatogeerimissüsteem koosneb kolonnist, eluendi reservuaarist ja kollektorist(fraktsioonikogur). Kolonni ülaosa on suletud korgiga, mida läbib klaastoru, mis ühendatakse kolonnist kõrgemal asetseva eluendi reservuaariga. Sellisel juhul algab kolonni väljavoolukraani avamisel kohe eluendi pealevool
Vxmax=Vt Vg
Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille
elueerimismaht Vx on kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf: ,kus (0
puhastatud osa satuks UV-kiirguse ja fotoelemendi vahele. Tänu erinevate ainete erinevale neelduvusele on võimalik neid detekteerida. Fluoresentsdetektor- detekteeritakse aineid, mis fluoretseeruvad. Kui aine ei fluoretseeru lisatakse talle fluoretseeruvat märgist. Massispektromeetriline detekor- mõõdetakse analüüsitava aine massi- laengu suhet. 6 Koduktomeetriline detektor- mõõdetakse eluendi elektrijuhtivust. Mitteselektiivne massitundlik detektor; tundlikus kahaneb, kui eluent juhib voolu; temperatuuritundlik. Praktiline töö: Seadmed: kapillaarelektroforees LED fluorestsentsdetektoriga Valguse allikas: LED (light emitting diode) Ergastamine (Ex): 280 nm Emissioon (Em): 307 nm Temperatuur: toatemperatuur Pinge: 16.3 kV Vool: 6.3 A Kapillaar: kvarstkapillaar, sisediameetriga 75 m, 50/62 cm
maksimaalse elueelirimismahu Vxmax = Vt - Vg Vg = 0,1 · 124,4 cm3 = 12,44 cm3 Vxmax = 124,4 cm3 12,44 cm3 = 111, 96 cm3 Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2ml; seega n = Vxmax / 2 = 111,96 cm3 / 2 = 55, 98 56 Katseklaasistatiivi asetasin fraktsioonide arvule vastava hulga kindla mahu järgi ( 2ml ) kalibriitud katseklaase ja numereerisin need. Kolonni lähedusse paigutasin voolutuslahutuse ehk eluendi pudeli ja märkisin üles voolutuslahuse koostise: 50 mM Tris HCl 150mM NaCl pH = 7,5 Varusin väikse keedkulaasi, kuhu kogusin kolonni täidise pinnal oleva eluendi, mis enne uuritava segu sisestamist kolonnist välja lasin. 2.2. Segu komponentide lahutamine Avasin ettevaatlikult kolonni väjavooluava ja täidise kohal olev voolutuslahus hakkas aeglaselt kolonnist välja tilkuma. Reguleerisin kolonni voolukiiruse optimaalseks. Kui
elueerimismaht Vx vaadeldavas kolonnis on kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf, mis arvutatakse vastavalt valemile: Rf = Vx Vxmin / Vxmax Vxmin Rf arvväärtused jäävad vahemikku 0....1 (0 < Rf < 1). Kromatogreerimissüsteem Tüüpiline kromatogeerimissüsteem koosneb kolonnist, eluendi reservuaarist ja kollektorist(fraktsioonikogur). Kolonni ülaosa on suletud korgiga, mida läbib klaastoru, mis ühendatakse kolonnist kõrgemal asetseva eluendi reservuaariga. Sellisel juhul algab kolonni väljavoolukraani avamisel kohe eluendi pealevool
eelnevalt valmis. Mõlemast lahusest ja reaktsioonisegust (eelnevalt pipeteeritud väike kogus klaasplaadile) võetakse klaaskapillaariga väike kogus ainet plaadile. Proovid kantakse varem märgistatud täppidele. Lahustil lastakse plaadilt aurustuda. Järgmiseks asetatakse plaat eluenti (voolutisse). Eluendina on kasutusel tolueeni ja etüületanaadi lahus (95:5), mis on samuti eelnevalt valmis tehtud. Plaat asetatakse mõne millimeetri kõrgusesse eluendi kihti, klaaspurk suletakse kaanega, et kogu plaat oleks eluendi aurudes. Elueeritakse seni, kuni solvendi nivoo jõuab umbes 5 mm kaugusele plaadi ülemisest servast. Plaat võetakse eluendi purgist välja ja fikseeritakse hariliku pliiatsiga frondi piir. Plaat kuivatatakse kuuma elektripliidi kohal. Keemiliseks ilmutamiseks asetatakse plaat eksikaatorisse, mis on küllastunud joodiautudega. Jälgitakse laikude ilmumist ja küllaldase tumeduse saavutamisel
HPLC-s kasutatakse edasi-tagasi liikuva kolviga pumpasid, mis varustavad kolonni eluendiga kindlal sagedusel. HPLC-s kasutatakse roostevabast terasest 2,1-4,6 mm sisediameetriga ja 30-300 mm pikkust kolonni, mille täidiseks on 3-10 μm läbimõõduga ebaregulaarse kujuga silikageeli osakesed. Retentsiooniaeg (tR) – aeg, mis kulub ainel kolonni sisenemise hetkest detektorini jõudmiseks. Retentsiooniaeg kasvab proportsionaalselt kolonni pikkusega. Eluendi retentsiooniaeg (t0) – aeg, mis kulub mobiilse faasi frondil kolonni läbimiseks. Teoreetiliste taldrikute kõrgus (H) – iseloomustab kolonni efektiivsust pikkusühiku kohta. Sõltub osakeste diameetrist. L- kolonni pikkus (mm): L H= N Teoreetiliste taldrikute arv ehk efektiivsus (N) - kolonni lahutamise efektiivsus. Mida suurem arv, seda kitsamad piigid. Sõltub kolonni pikkusest, statsionaarse faasi osakeste suurusest ja eluendi voo kiirusest: 2
Rf = Vx Vxmin / Vxmax - Vxmin Töö käik · Kontrollitakse kolonni vertikaalsust · kolonni täidis: Sephadex G-75, tegur k = 0,1 · geelisamba kõrgus l = 31,4 cm · diameeter d = 1,6 cm · täidise kogumaht Vt = 63 ml · geelimaatriksi maht Vg = 0,1 63 = 6,3 ml · maksimaalne elueerimismaht Vxmax = 63 6,3 = 56,7 ml · fraktsioonide üldarv n = 56,7 / 2 = 29 · statiivi võetakse vastav arv katseklaase · eluendi koostis: 50nM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH = 7,5 · uuritav segu: o dekstraansinine (6mg/ml) o müoglobiin (6mg/ml) o 2,4-dinitrofenüülaspartaat (0,6mg/ml) · kolonni täidise pinnal olev eluent lastakse välja · kolonni voolukiirus reguleeritakse piiridesse 0,7 1,0 ml/min · kui vedeliku tase langeb täidise pinnani, suletakse kolonni väljavooluava
Kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Molekulid, mis ei mahu geeli pooridesse väjuvad kõige esimesena, st minimaalse elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdne kolonni vaba mahuga. V xmin = Vv Ained, mis mahuvad geeli pooridesse, liigavad kõige aeglasemalt ja väjuvad maksimaalse elueerimismahuga V xmax, milline on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule. Et täidis väja ei voolaks, on kolonni alumine ots täidetud klaasvillaga. Eluendi lisamine kolonni ja eluaadi fraktsioonide kogumine toimub käsitsi. Ainehulkade kindlakstegemiseks kogutud fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrit. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine · Kontrollitakse, et kolonn oleks vertikaalne. · Märgitakse üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex'i mark ja seda iseloomustav tegur k. · Mõõdetakse geelisamba kõrgus L ja ja diameeter d. · Arvutatakse täidise kogumaht Vt
Kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Molekulid, mis ei mahu geeli pooridesse väjuvad kõige esimesena, st minimaalse elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdne kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv Ained, mis mahuvad geeli pooridesse, liigavad kõige aeglasemalt ja väjuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, milline on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule. Et täidis väja ei voolaks, on kolonni alumine ots täidetud klaasvillaga. Eluendi lisamine kolonni ja eluaadi fraktsioonide kogumine toimub käsitsi. Ainehulkade kindlakstegemiseks kogutud fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrit. Töö käik Kontrollisin kolonni vertikaalsust. Tegin vastavaid mõõtmisi (kõrgus L ja diameeter d) ja kirjutasin endale Sephadex'i mark ja seda iseloomustav tegur k. Avasin kolonni väljavooluava ja täidise kohal olev voolutuslahus hakkas aeglaselt kolonni alla asetatud anumasse tilkuma
faasi ruumala K – koefitsient. Aine tsooni laiust määravad faktorid kapillaar ja pakitud kolonnides Pakitud kolonnides - molekulide erinevad teepikkused, kuna kolonni täidise mõõtmed pole ühtlased, difusioon e tsooni laienemine. Massivahetus mobiilse ja stats.faasi vahel; difusioon mobiilsest statsionaarsesse st täidise pooridesse; difusioon statsionaarsest tagasi mobiilsesse. Kapillaarkolonnis - mobiilse faasi kiiruse paraboolne jaotus eluendi laminaarsel voolamisel. Kandilisem. GC - Erinvad teepikkused täidiskolonnidest, sõltudes pakkimisest ja osakeste läbimõõtudest. Difusioon mõjutab nii täidis kui kapillaarkolonne, sõltudes difusiooniko-efist ja analüüsiajast. Massivahetus liikuva ja liikumatu faasi vahel mõjutab mõlema kolonni puhul, sõltudes analüüsiajast. Selgitage mõisteid selektiivsus ja efektiivsus ja lahutuvus; kuidas neid arvutatakse’
· Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k * Vt = 9,1296 ja kolonnile iseloomuliku max elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 82, 16665. · Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 41,08. · Nummerdasin vajaliku arvu kaliibritud katseklaase, märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine: · Segu nr. I: Dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat. · Avasin kolonni väljavooluava ja reguleerisin voolutuslahuse tilkumiskiiruse klambri abil piiridesse 0,7 1,0 ml/min (eesmärgiks koguda iga fraktsioon ubmes 2-3 minutiga). Proovi sisestamine ja kolonni voolutamine: · Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin 1 ml pipetti. Võtsin 0,5 ml uuritavat segu ja tilgutasin geeli pinnale.
2,8 cm. Arvutasin täidise kogumahu Vt = = 76,49 cm3 Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k Vt = 7,65 cm ja kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 68,84 cm. Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 34,42. Nummerdasin kaliibritud katseklaase (35t) Märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, Panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine Segu koostis: deksatraansinine 3 mg/ml; müoglobiin 6 mg/ml; DNP-aspartaat 0,3 mg/ml Ettevatlikult avasin kolonni väljavooluava, voolukiirus oli juba reguleeritud 1 ml/min Proovi sisestamine Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin 1 ml pipetti. Võtsin 1 ml uuritavat segu ja tilgutasin geeli pinnale. Alguses kogusin ühendatud fraktsiooni (sest kuni kolonni alaossa jõuab kõige
2,7 cm Vt = × ( 2 )2 × 15,5 cm = 88,7 cm3 Siit saan arvutada geelimaatriksi mahu Vg. Vg = k × V t Vg = 0,1 × 88,7 cm3 = 8,87 cm3 = 8,9 cm3 Ning kolonni maksimaalse elueerimismahu Vxmax Vxmax = Vt - Vg Vxmax = 88,7 cm3 8,9 cm3 = 79,8 cm3 Siit arvutan fraktsioonide üldarvu, kus ühe fraktsiooni mahuks on 2 ml max Vx n= 2ml 79, 8 ml n= 2 ml = 39,9 = 40 Seejärel lasen eluenti (0,15 M NaCl lahus) kolonnist keeduklaasi, kuni eluendi tase kolonnis langeb täidise piirini. Pean silmas, et vedelikunivoo alla täidise piiri ei langeks, muidu satub geelikihti õhk, mis võib katsetulemusi mõjutada. Hoides kolonni väljavooluava suletuna, pipeteerin 0,5 ml uuritavat ainet ühtlaselt geeli pinnale ning lasen sellel valguda läbi geeli. Uuritav lahus sisaldab dekstraansinist, müoglobiini ja DNP-aspartaati (vedelik on algul rohelist värvi). Seni, kuni dekstraansinine (mis on kõige kiiremini liikuv aine) jõuab kolonni
Kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Molekulid, mis ei mahu geeli pooridesse väjuvad kõige esimesena, st minimaalse elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdne kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv Ained, mis mahuvad geeli pooridesse, liigavad kõige aeglasemalt ja väjuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, milline on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule. Et täidis väja ei voolaks, on kolonni alumine ots täidetud klaasvillaga. Eluendi lisamine kolonni ja eluaadi fraktsioonide kogumine toimub käsitsi. Ainehulkade kindlakstegemiseks kogutud fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrit. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine 1. Kontrollitakse, et kolonn oleks vertikaalne. 2. Märgitakse üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex’i mark ja seda iseloomustav tegur k. 3. Mõõdetakse geelisamba kõrgus L ja ja diameeter d. 4. Arvutatakse täidise kogumaht Vt 5
voolukiirus piiridesse 0,7-1,0 ml/min. Kui vedeliku tase langeb täidise pinnani, suletan kolonni väljavooluava . Uuritav segu: 1.segu: Dekstraansinine (sinine), müüoglobiin (punane), DNP-aspartaat (kollane). Proovi sisestamine: Doseerimiseks kasutan automaatpipetti mahuga 0,5 ml. Viin 0,5 ml uuritavad segu kolonni vastu seina. Proov voolab geeli pinnale ühtlaselt. Avan kolonni väljavooluava ja kui uuritav segu on geeli sees lisan 2 ml eluenti.Kui kogu eluent on geeli sees ,lisan veel eluendi. Geelis olev proov moodustab sinist ja kollast kihti(punane oli nähtav ainult siis,kui kogusin katseklaasi. Kolonni voolutamine: Kolonnist tuleb puhas vooluti, mida kogun mõõtsilidrisse. Kokku tuli 20 ml ühendatud fraktsiooni. Kui tuli sinine riba asendasin mõõtsilinder katseklaasiga ja hakkasin koguma fraktsioonid. Kokku tuli 42 fraktsiooni. Fraktsioonide analüüsimine: Analüüsin saadud fraktsioonide absortsiooni tihedused spetrofotomeetril. Dekstraansinine
Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k ∙ Vt = 0,1*46,85= 4,685 cm ja kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismahu Vxmax = Vt – Vg = 42,162 cm. Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 42,165/2≈21. Võtsin 21 kaliibritud katseklaasi Märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, Panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine Segu koostis: deksatraansinine 3 mg/ml; müoglobiin 6 mg/ml; DNP-aspartaat 0,3 mg/ml Ettevatlikult avasin kolonni väljavooluava, voolukiirus oli juba reguleeritud 1 ml/min Proovi sisestamine Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin 1 ml pipetti. Võtsin 1 ml uuritavat segu ja tilgutasin geeli pinnale. Alguses kogusin ühendatud fraktsiooni (sest kuni kolonni alaossa jõuab kõige
kogumahuga. Kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kahte parameetrit: kolonni vaba mahtu (eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis geeli pooridesse ei mahu) ja maksimaalset elueerimismahtu ( eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid mis geeli pooridesse täielikult sisenevad). Kromatogrammiks nimetatakse eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja mahu vahelist graafikut. Kromatografeerimissüsteem koosneb kolonnist, eluendi reservuaarist ja fraktsioonikogurist. Tihti on kasutusel automaatkolonnid, mis automaatselt lisavad kolonni eluenti, antud töös on aga kasutusel klaaskolonnid, mis on eelnevalt täidetud pundunud dekstraangeeliga Sephadex G - 75. Kolonn on kinnitatud statiivile sellisele kõrgusele, et alla mahuks katseklaas. Käsitsi tuleb lisada nii eluenti kui ka fraktsioone koguda. Ainete kindlakstegemiseks eluaadi fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrit. Töö käik
kogusin eeljooksuna keeduklaasi, et seda hiljem arvestada eluaadi kogumahu arvutamisel. Pärast mõõtmist ühendatud fraktsiooni maht 33 ml. 7. Proovis sisalduvad ained andsid kolonnis erineva värvuse- sinine, pruun ja kollane, mida kogusin 2 ml fraktsioonidena kaliibritud katseklaasidesse. Katseklaase sain kokku 38. 8. Kui uuritavad ained mööda kolonni allapoole liikusid, lisasin ülevalt pidevalt eluenti, et eluendi nivoo oleks kolonni peas koguaeg sama, sest see tagab uuritav lahuse ühtlasema kiirusega läbivuse kolonnist. 9. Lõpetasin elueerimise, kui eluaadi summaarne maht oli sama, mis arvutuslik kogumaht. Proovide analüüsimine Selleks, et teada saada aine kontsentratsiooni mõõtu, mõõtsin kõikide proovide (va täiesti värvusetute) optilise tiheduse ehk absorbtsiooni. Optilist tihedust määratakse aine neeldumis- maksimumile vastaval lainepikkusel spektrofotomeetri abil.
· Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k * Vt = 11,44 ja kolonnile iseloomuliku max elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 103,01 · Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 53 · Nummerdasin vajaliku arvu kaliibritud katseklaase, märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine: · Segu nr. I: Dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat. · Avasin kolonni väljavooluava ja reguleerisin voolutuslahuse tilkumiskiiruse klambri abil piiridesse 0,7 1,0 ml/min (eesmärgiga koguda iga fraktsioon umbes 2-3 minutiga). Proovi sisestamine ja kolonni voolutamine: · Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin automaatpipetti. Võtsin 0,5 ml uuritavat segu ja tilgutasin geeli pinnale.
Rf = (Vx Vxmin) / (Vxmax Vxmin) Rf arvväärtused jäävad vahemikku 0....1. Eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nimetatakse kromatogrammiks. Ainete väljumis- ehk elueerumismahtusid näitavad nende fraktsioonide elueerumismahud, milles vastava aine kontsentratsioon on kõige kõrgem (,,tipule" vastav maht). Kromatografeerimissüsteem: Tüüpiline kromatografeerimissüsteem koosneb kolonnist, eluendi reservuaarist ja fraksioonikogurist ehk kollektorist. Töös oli kasutatud klaaskolonne, mis juba eelnevalt oli täidetud pundunud dekstraangeeliga Sephadex. Vältimaks täidise väljavoolamist on kolonni alumine osa täidetud klaasvillaga. Kolonn on kinnitatud statiivi külge sellisele kõrgusele, et selle alla mahuks katseklaas. Täidise krgus kolonnides on 2530 cm. Ainete kontsentratsioonide kindlakstegemiseks eluaadi fraktsioonides kasutati spektrofotomeetrilist meetodit.
seob teatud proovi komponendid. Ülejäänud proov elueerub kolonnis sorbeerumata. Väga suur selektiivsus, mis on kasulik preparatiivseks tööks. Tahked kandjad on hüdrofoobsed: agaroos, tselluloos, polüakrüülamiid. Ligandid: ensüümid, antikeha. Seotud ühendite elueerimine: ligandi lahuse abil. Kasutatakse biokeemilistes rakendustes, kus analüüt seostub statsionaarse faasiga, kõik muu ei seostu. Valides sobiva eluendi saame analüüdi statsionaarse faasi küljest lahti VEDELIKKROMATOGRAAFIA 116. Kõrgefektiivne vedelikkromatograafia (HPLC), selle aparatuur. Ainete eraldamine võib toimuda mitmete erinevate omaduste järgi. Tavalisim: Polaarsus ("tavaline" vedelik-kromatograafia), Iooni laengu ja suuruse suhe (ioonkromatograafia). Vaatleme siin vedelik-kromatograafiat ja ioonkromatograafiat koos. Et eraldamine oleks efektiivne, peab kolonn olema statsionaarse faasiga täidetud väga tihedalt. See toob kaasa
Lora Sulg, Proviisor II, sügis 2010 molekulaareksklusioonkromatograafia (geelkromatograafia) size-exclusion chromatography. Ehk suuruse järgi ellimineeriv kromatograafia. Väiksemad osakesed, mis läbivad kapillaare, läbivad pikema tee. Suuremad osakesed jõuavad kolonnist enne välja. 2) Kemosorptsioonkromatograafia tekivad keemilised reaktsioonid aine, sorbendi ja eluendi vahel, mis võivad olla pöördumatud või pöörduvad. ioonvahetuskromatograafia ioonvahetuskolonniga võimalik ioniseeruvaid aineid lahutada. Kolonni liikumatu faasi pind sisaldab nt. katioone. Need tinglikult hoiavad kinni anioone. Mida paremini hoitakse anioone kinni, seda aeglasemalt anioon liigub. afiinsuskromatograafia seda kasutatakse enamasti bioloogiliste objektide korral. Antikehad seotakse liikumatule faasile. Kolonnist lastakse veri läbi
pooridesse täielikult difundeeruvate (aine 3) molekulide elueerumisprofiilid. 49 Ainete väljumis- ehk elueerumismahtusid näitavad nende fraktsioonide elueerumis-mahud, milles vastava aine kontsentratsioon on kõige kõrgem (,,tipule" vastav maht). Tüüpiline kromatografeerimissüsteem koosneb kolonnist, eluendi reservuaarist ja automaatsest fraksioonikogurist ehk kollektorist (vt joonis). Kolonni ülaosa on suletud korgiga, mida läbib klaastoru, mis ühendatakse kolonnist kõrgemal asetseva eluendi reservuaariga. Sellisel juhul algab kolonni väljavoolukraani avamisel kohe eluendi pealevool kolonni täidisele ja fraktsioonikoguri käivitamisel ka automaatne fraktsioonide kogumine. Kuna antud praktikumis viivad segude geelkromatograafilist lahutamist korraga
2. Kõrgel temp (6000-8000K)- proovis olevad ühendid atomiseeruvad 3. Aatomid ioniseeruvad ja hakkavad footoneid kiirgama 4. Emiteeritud valgus fokusseeritakse dispergeeriva elemendi abil (MK või polükromaator) Kromatograafia. Seletage mõisted ,,elueerimine", ,,eluent", ,,eluaat", ,,statsionaarne faas", ,,mobiilne faas" Elueerimine on protseduur, mille korral rakendatakse täidiskolonnis toimuvaid sorptsiooni ja desorptsiooni protsesse kasutades eluendi (gaas, vedelik) kolonni täidisest läbivoolutamist. Eesmärgiks võib olla ainete puhastamine või kuivatamine (adsorptsiooni- ja adsorptsiooni kolonnis), ainete segu lahutamine (kromatograafilises kolonnis) täidise regenereerimine. Eluent on gaas või vedelik (vesi, vesilahus, solvent, solventide segu), mis kannab keemilised ained läbi kolonni, seejuures toimuvad molekulide sorptsiooni ja desorptsiooni aktid.
omakorda neljaks kodeerivate geenide päritolu põhjal (katselooma, kimäärsed, inimese ja humaniseeritud, vt 04.04 slaid 15). 67. Mis on biopannimine? Biopannimine ehk ristamine on antikeha- raamatukogu faagikuva kolmandas etapis kasutatav protsess, kus faagid valitakse välja märklaud antigeenide suhtes, seondunud faagid elueeritakse (keemias kasutatav protseduur, mille korral rakendatakse täidiskolonnis toimuvaid sorptsiooni ja desorptsiooni protsesse kasutades eluendi (gaas, vedelik) kolonni täidisest läbivoolutamist. Eesmärgiks võib olla ainete puhastamine või kuivatamine (adsorptsiooni- ja absorptsioonikolonnis), ainete segu lahutamine (kromatograafilises kolonnis) või kolonni täidise regenereerimine), paljundatakse bakterites ja korratakse 2-4 korda, kuni saadakse ainult antigeeniga seonduvad faagid. 68. Mis on optimeeritud efektorfunktsioonidega terapeutilised antikehad? Antikehad, mille Fc regiooni on modifitseeritud lisaks
alaserva lähedale stardijoonele. Seejärel asetatakse plaat püstiselt elueerimisnõusse, mille põhjas on eluent (lahusti või lahustite segu), ja nõu suletakse. Eluent tõuseb kapillaarjõudude mõjul piki plaati ülespoole ja sellega koos hakkavad ülespoole liikuma ka stardijoonele kantud ained, kusjuures komponendid, liikudes erineva kiirusega, eralduvad üksteisest laikudena. Plaat võetakse nõust välja, kui eluendi tase on jõudnud plaadi ülaserva lähedale. Plaat kuivatatakse ja vajadusel komponentide laigud ilmutatakse näiteks joodi aurudega või fosformolübdeenhappe lahusega. Planaarkromatograafia on kromatograafia liik, mille puhul statsionaarseks faasiks on adsorbendi õhuke kiht (paber, metall-lehele kantud silikageel vmt), milles mobiilne faas (ehk vooluti ehk eluent) liigub kapillaarjõudude toimel. Kolonn-kromatograafia.
iooni laengu ja suuruse alusel - ioon(vahetus)kromatograafia, IC Vedelikkromatograafias on liikuvaks l faasiks (eluent) vedelik.. Kasutatakse täidiskolonne osakeste diam.-ga diam. 3-10 µm, sisemine diam.-ga 1-5 mm ja pikkusega 5- 30 cm. HPLC ehk kõrgefektiivne vedelikkromatograafia - efektiivsekss eraldamiseks peab kolonn olema stats. faasiga tihedalt täidetud, seetõttu vajalik eluendi läbisurumiseks kõrge rõhk. Kaks variatsiooni: · Polaarne liikuv faas, vähe-(mitte-)polaarne vähe statsionaarne faas · Mittepolaarne liikuv faas, polaarne statsionaarne faas. faa 24 Siiri Velling (Tartu Ülikool), 2011
annaabi.ee 
