Kombineeritud meetodid: kromatograafia ja massispektromeetria (0)

Kombineeritud meetodid: kromatograafia ja massispektromeetria
see võiks olla vedelikkromatograafia + massispektromeetria.
Kõigepealt peaks tutvustama mõlemat meetodit 1-2 kausega, Siis mainima ära, et kuna töö teema on 2 meetodi ühendusest, siis on valitud kummastki meetodiklassist üks esindaja pidades silmas, et need omavahel sobiksid .
Siis võib rääkida vedelikkromatograafiast - mis head seal on, kuidas seda keeruliste segude lahutamisel toimib ja ka mis seal puudu jääb (vahel ei lahutu piigid hästi, ainete identifitseerimiseks on vaja standardeid). Massispektromeetria lisamine toob sisse lisavõimalusi nende puuduste ületamiseks.
Edasi peaks pisut lähemalt rääkima massist. Valida võiks näiteks ESI ioonallikaga massi, selgitades, et see on tavaliselt esimene ioonallika valik koos vedelikkromatograafiga kasutatvatel süsteemidel. Rääkida natuke ESI massist (1 slaid). Ja siis tuua välja, mis toredaid tulemusi on saadud LC-ESI-MS-ga. 
Kuna kuulamas on ka Kaspar Vulla, siis võiks massisosa läbi lugeda, et osata küsimustele vastata.
Kromatograafia
Kromatograafia on meetod (meetodite grupp) komponentide eraldamiseks ainete segudest. Meetod
baseerub segu komponentide erineval liikuvusel mobiilsest ja statsionaarsest faasist koosnevas süsteemis.
Liigid:
Kromatograafilisi meetodeid võib liigitada eesmärgi, tehnilise teostuse, mobiilse faasi oleku ja muude
parameetrite alusel.
Kromatograafilise ainete eraldamise eesmärgiks võib olla üksikute komponentide kättesaamine, et
nendega midagi edasi teha (nt kasutada ravimi koosseisus). Sellist kromatograafiat nimetatakse
preparatiivseks.
Analüütilise kromatograafia puhul on eesmärgiks aine olemasolu ja hulga määramine segus.
Statsionaarne faas võib olla paber (paberkromatograafia) või õhuke poorse aine kiht metall - või
klaasplaadil (õhukese kihi kromatograafia), täidisena kolonnis (kolonnkromatograafia) või kantud peene
toru siseseintele (kapillaarkromatograafia).
Mobiilne faas võib olla vedel (vedelikkromatograafia), gaasiline (gaaskromatograafia) või superkriitilises
olekus (superkriitilise fluidumi kromatograafia).
http://tera.chem.ut.ee/~koit/arstpr/krom.pdf
Kromatograafia on andnud väga efektiivsed meetodid, mida kasutatakse peaaegu kõigis keemialaborites. Umbes kolmandik kõigist analüüsidest tehakse tänapäeval kromatograafia abil. Välja on arendatud automatiseeritud ja arvuti poolt juhitavad kromatograafilised seadmed spetsiifiliste ülesannete lahendamiseks, sealhulgas gaaside, anorgaaniliste ioonide, mitmesuguste orgaaniliste ühendite ja biokeemiliste segude lahutamiseks. Kromatograafiat kasutatakse ainete puhtuse kontrolliks, keskkonna reostuse määramisel, keemiliste protsesside kontrolliks jne.
http://et.wikipedia.org/wiki/Kromatograafia
Massispektromeetria
Vedelate ja tahkete proovide ioniseerimiseks on teiste hulgas kasutusel elektropihustusionisatsioon (ESI – leiutaja John Fenn)
Massispektromeetria (MS) on analüütilise keemia meetod, millega on võimalik mõõta osakeste massi ja elektrilaengu suhet (m/z, kus m on iooni mass, z on iooni laeng).
Seda meetodit kasutatakse osakeste molekulmasside määramiseks, proovi või molekuli elemendilise koostise määramiseks ning peptiidide või teiste keemiliste ühendite struktuuri välja selgitamiseks. Massispektromeetria põhimõte seisneb keemiliste ühendite ioniseerimises, et tekitada laetud molekulid või molekulide fragmendid , ning nende massi ja laengu suhte määramises.
Sparkman, O. David (2000). Mass spectrometry desk reference. Pittsburgh: Global View Pub
Fenn, J. B.; Mann, M.; Meng, C. K.; Wong, S. F.; Whitehouse, C. M. (1989). "Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules". Science 246 (4926): 64–71.
Põhimõte: analüüsimeetod, mille puhul:
– Uuritavad molekulid (molekulmassiga M) aurustatakse
– Need molekulid/ aatomid ioniseeritakse
– Tekivad ioonid M+, MH+ vms (molekulaarioonid)
– Tekkinud ioonid on tihti kõrge energiaga ning fragmenteeruvad osaliselt, tekivad mitmesugused väiksema massiga ioonid (ja neutraalsed fragmendid)
– Kõik ioonid suunatakse massianalüsaatorisse, mis registreerib nende masside ja laengute suhted m/z
• Massispektromeeter registreerib ainult laetud osakesi.
Vedelikkromatograafia
Kromatograafiline kolonn on tihedalt täidetud statsionaarse faasiga (liikumatu faasiga):
See toob kaasa vajaduse kasutada kõrget rõhku eluendi surumiseks läbi kolonni. HPLC - kõrgsurve vedelikkromatograafia.
HPLC aparatuuri ehitus skemaatiliselt, kus 1 – pudelid eluentidega, 2 – eluendi degaseerija, 3 – gradientkraan, 4 – eluendi sisestamise nõu, 5 – kõrgsurve pump , 6 – kraan sisestamise asendis, 6’ – kraani laadimisasend, 7 – silmus , 8 – eelkolonn, 9 – kromatograafiline kolonn, 10 – detektor , 11 – andmete töötlemise seade, 12 – jääkide või fraktsiooni koguja.

• Statsionaarsed faasid :
  
  • Pöördfaas - silikageeli külge on keemiliselt seotud alküülrühmad (terakese läbimõõt ca 5 mikromeetrit)
    
  • Ioonkromatograafia - polümeeri terakesed, mille külge on seotud ioonvahetusrühmad
    
    • Katioonvahetuskolonn
      
    • Anioonvahetuskolonn
      

• Nõuded eluendile:
  
  • Peab lahustama proovi
    
  • Peab analüüte läbi kolonni kandma
    
  • Ei tohi olla viskoosne
    
  • Pöördfaas sageli puhverlahuse segu mõne orgaanilise lahustiga (metanool, atseetonitriil)
    
  • Ioonkromatograafias - hape , alus või karbonaat .
    

• Eluent on pidevas voolamises ja spetsiaalse kraani abil sisestatakse eluendi voolu uuritavat lahust.
  
• Proovi sisestatakse tavaliselt mõnikümmend mikroliitrit.
  

• Eelised:  võimaldab analüüsida aineid mis ei lendu ega ole temperatuuristabiilsed.
  
• Puudused:
  
  • vajadus kasutada kõrget rõhku
    
  • aparatuur kapriisne
    

Proov süstitakse sisesti ehk injektori kaudu kromatograafilisse süsteemi, ning viiakse eluendivoolus analüütilisse kolonni.
Kolonnis toimub segu komponentide lahutamine.
Seejärel liigub analüüt läbi detektori, kus mõõdetakse analüüdi poolt tekitatav signaal ja digitaliseeritakse see.
Tulemusi näeme arvutiekraanil piikidena, mille pindala alusel arvutatakse analüüdi kontsentratsioon.
Liikuvaks faasiks on (erinevalt gaaskromatograafias kasutatavast gaasist) vedelik, mida nimetatakse eluendiks.
Olenevalt analüütide omadustest, kasutatakse vedelikkromatograafias erinevaid detektoreid
Detektorid:

• UV-VIS ( ultravioleti või nähtava valguse),
  
• elektrokeemiline,
  
• mass-spektromeetriline,
  
• konduktomeetriline,
  
• RI,
  
• Fluorestsents
  

http://www.ttk.ee/~laine/kromatograafia/vedelikkromatograafia_tphimte.html
Vedelik-kromatograafiliste ja massispektromeetriliste (LC-MS) ning ioonkromatograafiliste metoodikate arendamine saasteainete määramiseks mitmesugustes maatriksites. See on rakenduslik uurimissuund, milles suur osa tööd käib mitmesuguste koostööprojektide raames. Koostöös Soome Tollilaboriga juurutati metoodika 14 pestitsiidijäägi analüüsiks puu- ja köögiviljades ning akrediteeriti see. Pestitsiidijääkide määramise alal on käimas terve rida koostööprojekte ja lepinguid, kus partneriteks on Põllumajandusuuringute keskus, EV Tervisekaitseinspektsioon, Eesti TA Keemilise ja Bioloogilise Füüsika Instituut ja Soome Vabariigi Tollilabor. Osaletakse EV Keskkonnaministeeriumi Keskkonnainvesteeringute Keskuse rahastatavas projektis reoveesettemuda ja -komposti ohutuse uurimiseks, mille raames määratakse antibiootikumijääkide sisaldust kasutades proovide ekstraheerimiseks ASE meetodit ja analüüsiks LC-MS-i jne. (K. Herodes, A. Kruve, K. Kipper , T. Haljasorg)
Vedelik-kromatograafia (LC) ja massispektromeetria (MS) alane uurimistöö.
Vedelikkromatograafia ja massispektromeetria (LC-MS) on praeguseks kinnistunud orgaaniliste ainete madalate sisalduste määramisel analüüsimeetodiks No 1 ja see on ka meie õppetooli kõige mitmekesisem ja ulatuslikum uurimissuund. Põhiliseks massispektromeetri ioonallikaks kasutame elektropihustust (ESI).
ESI massispektromeetrias esinevate maatriksiefektide uurimine. Tõsiseks probleemiks LC-ESI-MS analüüside juures on maatriksiefekt, mis võib viia vigaste analüüsitulemusteni. Parimaks maatriksiefekti vähendamise viisiks on efektiivsemate proovi ettevalmistusmeetodite kasutuselevõtt. Samas, alati pole see võimalik. Sellisel juhul tuleb kasutada mitmesuguseid muid võtteid (ekstrapolatiivne lahjendamine, Multilineaarne regressioon jne), mille väljatöötamises meie grupp on maailmas juhtivate hulgas. (A. Kruve, K. Herodes, I. Leito)
http://tera.chem.ut.ee/~ivo/tudengile/LCMS.html
ESI – (electrospray ionization) Elektropihustus-ionisatsioonESI – (electrospray ionization) Elektropihustus-ionisatsioon
MS – massispektromeetria
LC – vedelikkromatograafia
ESI ionisatsioon ja maatriksiefekt
ESI kasutamisel võib sageli kohata segavat fenomeni ehk niinimetatud maatriksiefekti. Maatriksiefektiks nimetatakse analüüdiga kooselueeruvate ühendite mõju analüüdi ionisatsiooni efektiivsusele. Maatriksiefekt võib olla nii positiivne kui negatiivne. Esimesel juhul suurendavad proovimaatriksi komponendid analüüdi ionisatsioonimäära, teisel juhul surutakse analüüdi ionisatsioon tagasi [58]. P. J. Taylor, Matrix effects : Matrix effects: The Achilles heel of quantitative high- performance
liquid chromatography–electrospray– tandem mass spectrometry. Clinical Biochemistry 38 (2005)
328.
Maatriksiefekti tagamaad pole lõplikult selged, kuid sagedamini selgitatakse seda kolonnist elueeruvate ühendite omavahelise konkurentsiga ionisatsiooniallikas – erinevate keemiliste omadustega ained konkureerivad nii tilgas leiduvate prootonite pärast (ESI+ korral) kui ka koha pärast aerosoolitilga pinnal. Konkurents prootonile on esimeses lähenduses määratud ühendite prootonafiinsusega – pH alandamisega on võimalik suurendada neutraalsetele ühenditele vastavate konjugeeritud hapete määra tilgas. Konkurents tilga pinna pärast on aga seotud ainete pindaktiivsete omadustega. Üldiselt on leitud, et vähepolaarsete ühendite puhul on maatriksiefekti mõju väiksem kui polaarsete ühendite korral. [57] E. de Hoffmann, V. Stroobant, Mass Spectrometry principles and applications. Second Editon.
Wiley. Chichester 2002. lk 11-99
Maatriksiefekti ei ole enamasti võimalik täielikult kõrvaldada, kuid tema vähendamiseks on mitmeid mooduseid:
1. Täiustatud proovipuhastus, mis vähendab maatriksikomponentide sisaldust lõppekstraktis, on eelistatuim lähenemisviis. Sealjuures tuleb siiski arvestada, et lisapuhastusetapp võib vähendada saagiseid ja pikendada analüüsiks kuluvat aega ning samuti on võimalik, et lisaetapi korral maatriksiefekt hoopis suureneb.
2. Kromatograafi süstitava lahuse lahjendamine või süsti ruumala vähendamine. Süstitava ekstrakti lahjenemisel väheneb koos analüüdi kontsentratsiooniga ka segavate komponentide kontsentratsioon. Puuduseks on määramispiiri tõus.
3. Isotooplahjendus. Kasutades sisestandardina analüüdi isotopomeeri on võimalik enamikul juhtudest elimineerida või vähemalt tuntavalt vähendada maatriksiefekti mõju. Kuid vähempolaarsete analüütide korral tuleb mängu sekundaarne isotoopefekt (kromatograafiline isotoopefekt), mis on tingitud isotopomeeri/analüüdi natuke erinevatest füsikokeemilistest omadustest. Kromatograafilise isotoopefekti tulemusena võib analüüdi ja isotopomeeri retentsioon kolonnis tuntavalt erineda – sellest tulenevalt võib erineda ka maatriksi mõju kummagi ühendi ionisatsiooniefektiivsusele. Lisaks on isotopomeerid ka suhteliselt kallid ning multimeetodite korral, kui ühe kromatograafilise tsükli käigus püütakse analüüsida paljusid ühendeid korraga, ei pruugi isotooplahjendus otstarbekas olla [59]. S. Wang, M. Cyronak, E. Yang, Does a stable isotopically labeled internal standard always
correct analyte response? A matrix effect study on a LC/MS/MS method for determination of
carvedilol enantiomers in human plasma . J. Pharm. and Biomed. Anal. 43 (2007) 701.
4. Ekstraktsioonijärgne rikastamine . Kui prooviekstrakti rikastada analüüdiga otse enne kromatograafi süstimist, on võimalik hinnata maatriksi mõju analüüsi tulemusele. Omavahel võrreldakse kindla analüüdikontsentratsiooniga kalibreerimislahuse ning prooviekstrakti kromatograafilisi piike ja määratakse maatriksiefekt [58]. P. J. Taylor, Matrix effects: Matrix effects: The Achilles heel of quantitative high-performance
liquid chromatography–electrospray–tandem mass spectrometry. Clinical Biochemistry 38 (2005)
328.
5. Lisamiskatsed. Reaalse prooviga sarnanevat nullmaatriksit rikastatakse analüüdilahusega ning proovi töödeldakse vastavalt ettevalmistuseeskirjadele. Antud juhul hinnatakse prooviettevalmistuse ja analüüsimeetodi summaarset efektiivsust , kus on kokku võetud nii maatriksimõjud kui ka analüüsi saagis.
[60]. A. Kruve, A. Künnapas, K. Herodes, I. Leito, Matrix effects in pesticide multi-residue analysis
by liquid chromatography–mass spectrometry. J. Chrom . A 1187 (2008) 58. Rutiinanalüüsidega tegelevates laborites on otstarbekas kasutada maatriksiefekti olemasolu kindlakstegemiseks lisamiskatseid ning efekti esinemisel analüüsida lahjendatud prooviekstrakti.