Koostu tegemine algusest peale: mida iga bioloog peaks teadma (0)

TARTU ÜLIKOOL
LOODUS- JA TEHNOLOOGIATEADUSKOND
MOLEKULAAR - JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT
Koostu tegemine algusest peale: mida iga bioloog peaks teadma
Referaat
TARTU 2014
Sissejuhatus
Esimene täielikult sekveneeritud genoom kuulub bakteriofaagile Φ-X174. Edukas viirusegenoomi DNA järjestuse kindlaks tegemine kannustas ette võtma mahukamaid projekte ja üks kulukamaid nende seas on „Inimese genoomi projekt“ (HGP, inglise keeles the Human Genome Project ). Tänaseks on välja töötatud järgmise põlvkonna sekveneerimismeetodid (NGS, inglise keeles next-generation high-throughput sequencing), mis nõuavad üha vähem ajalisi ja rahalisi ressursse. Selline soodus olukord on vallandanud sekveneerimisbuumi, mis on tõstatanud uue probleemi – mida teha saadud andmetega ? Üha rohkem tuntakse vajadust sekveneeritud DNA järjestusi analüüsida ja tõlgendada. Paralleelselt sekveneerimismeetodite arenguga proovitakse välja töötada üha täiustatumaid programme andmete töötlemiseks. Spetsiifilisele andmemassiivile sobiva programmi leidmine on oluline ülesanne võimalikult täpseks andmetõlgenduseks.
Keeruliseks on osutunud ülesanne leida selline kombinatsioon sekveneerimisandmetest ja arvutialgoritmidest, mille väljundiks oleks võimalikult kõrge kvaliteediga koostu ( assembly ). Koostu peab olema kõrgkvaliteediline, sest vastasel juhul osutuksid selle informatsiooni põhjal tehtavad järjeldused vääraks. Genoomi funktsionaalsete elementide ennustamine , kodeerivate geenide ülesleidmine, evolutsioonilise päritolu selgitamine – kõiki neid protseduure mõjutab oluliselt koostu kvaliteet.
Koostu kvaliteedi probleemi muudab komplekssemaks järjest uuemate sekveneerimistehnoloogiate väljatöötamine. Uued sisendandmed, mis söödetakse programmidele, on teistsuguste iseärasuste ja vigadeprofiiliga kui sekveneerimise teerajajaks osutunud Sangeri meetodi lugemid (read). Seega peavad tarkvarade loojad pidevalt olema arengutega kursis ja kohastuma nii, et loodavad programmid suudaksid andmeid õigesti töödelda. Kuna sisendandmed on kiires muutumises, on keeruliseks osutunud ka seniste koostute kvaliteedi hindamine. Kui genoom saab assembleeritud ehk taas kokkupandud, mille alusel võivad teadlased väita, et tegemist ongi absoluutselt õige koostuga? Meetrikud, mille alusel antakse koostutele kvaliteedihinnanguid ei ole sugugi mitte alati üksteist võimendavad. Esineb lõivsuhe õigsuse ( vigade puudumise) ja pikkuse parameetrite vahel. Järgmiseks oluliseks hetkeks on otsuse langetamine, kumb iseloomustaja on olulisem, kas pikkus või vigade puudumine?
Koostu tegemine algusest peale ehk de novo assembly

Koostuid on võimalik üles ehitada kahel erineval viisil. Vastavalt sellele, kas on olemas referents- sekventsid , jagatakse koostuid referentsi alusel koostatuks või de novo-ks (ld „uus“). De novo lähenemisviisi juures on tegemist organismiga, kelle enda ja lähisugulaste genoomi ei ole veel sekveneeritud. Teine lähenemisviis kasutab võrdlust, mille puhul kasutatakse lähisugulase sekveneeritud genoomi koostu tegemise protsessi giidina. Siiski kogu genoomi jaoks seda kasutada ei saa ja unikaalsete järjestuste jaoks tuleb rakendada de novo lähenemisviisi. De novo genoomi koostu koostamine on ajaliselt ja rahaliselt kulukam, sest eelduseks on suur mate- pair raamatukogu olemasolu .
Esmalt on vaja lähteandmeid, mida pakub DNA sekveneerimine . Sekveneerimine (inglise keeles sequencing) tähendab bioloogilises ja biokeemilises kontekstis meetodit, mis võimaldab määrata biopolümeeride (valkude ja nukleiinhapete) primaarstruktuuri. Sekveneerimise tulemiks on sekvents, mis sisaldab endas kindlatest märkidest koosnevat biopolümeeri jada. Tänasel päeval on sekveneerimine jagunenud kahte suunda - esimene (Sangeri ahela terminatsioon) ja järgmine põlvkond (NGS, inglise keeles the next generation sequencing). Nõudlus efektiivsemate tehnoloogiate järele tekkis juba HPG kestel. Sangeri meetod on kahtlemata oluline saavutus bioteaduste vallas, kuid perspektiivitu - meetod nõuab mahukaid ajalisi ja rahalisi ressursse. Nüüdseks on arendatud Sangeri meetodist järgmise põlvkonna sekveneerimismeetodid. Sünonüüm NGS-le ehk massiivne paralleelne sekveneerimine tähendab antud meetodi puhul, et terve genoom eraldatakse väiksemateks ühikuteks ning seejärel ligeeritakse adapterjärjestusele DNA sünteesi käigus – sekveneerimine ja DNA süntees toimuvad üheaegselt. Sekveneerimisprotsess on muudetud kiiremaks, odavamaks ja täpsemaks.
Pärast genoomi sekveneerimist on järgmiseks etapiks koostute (assembly) ülesehitamine.
Kui genoomi sekveneerimine andis informatsiooni nukleotiidse järjestuste kohta, siis koostute arvutiprogrammid proovivad rekonstrueerida erinevaid pikemaid biopolümeeride järjestusi kasutades selleks sekveneeritud järjestuste joondamist mitmesuguste algoritmide alusel. Assemblerid tööpõhimõte eeldab, et kui kahel lugemil esineb nukleotiidiline ühisosa , siis pärinevad nad tõenäoliselt genoomi samast kromosoomi piirkonnast . Kui selline kattuvus on tuvastatud, siis joondab programm lugemid vastavalt kontiigideks. Kontiig ehk piirnevaid järjestusi moodustavad komplekt ülekattuvaid DNA segmente (lugemid), mis üheskoos moodustavad ühe DNA regiooni konsensuspiirkonna.
Kontiigide puhul ei ole teada, kummast DNA ahelast on nad rekonstrueeritud. Asukoha määratlemiseks viiakse kontiigidega läbi protseduur, mida nimetatakse skäffoldimiseks. Skäffoldimisetapil kasutatakse kahte tüüpi järjestusi: kontiige (liidetud lugemeid) ja lugemite paare (mate pair). Toimub kontiigide järjestamine ning orienteerimine kasutades lugemite paarist pärit lisainformatsiooni, mis leidub nende järjestuse mõlemas otsas ( paired end). Paariliste lugemite tegemisel fragmenteeritakse DNA ja saadakse järjestusi, mille otsi sekveneeritakse – genereeritakse lugemid. Fragmentide keskmine piirkond jääb tavaliselt sekveneerimata. Skäffold koosneb kontiigidest ja kontiigide vahele jäävatest tühimikest (gaps). Paralleelselt termini paired end kõrval kasutatakse ka mate pair, mis täidavad mõlemad sama eesmärki ehk annavad informatsiooni kahe lugemi vahelisest füüsilisest kaugusest. Erinevus nende vahel seisneb raamatukogu tegemise metodoloogias. Kuigi tühimiku (gap) järjestus ei ole teada, on võimalik hinnata selle pikkust kontiigide endi pikkuste järgi, mis on umbkaudu teada.
Koostuprogrammid jagunevad skäffoldimisetapi läbiviimisel kahte erinevasse suunda. Esinevad nii kaks-ühes koostud, mis sisaldavad juba skäffoldimismoodulit, kuid nende kõrval esineb programme, mis on just spetsiaalselt skäffoldimise jaoks disanitud. Kuigi pakub kaks-ühes programm kasutajamugavust, ei ole see alati kõige õigem viis genoomi järjestuse lõpetamiseks, sest universaalset, kõikidele genoomidele sobivat lähenemisviisi, ei ole veel leitud. Sellise programmi rakendamisel on kasutajatel vähe kontrolli skäffoldimisprotsessi üle ja informatsiooni tootmise suunamist ei saa kontrollida. Eraldiseisvad skäffolderid on paindlikumad ja võimaldavad kontrollida skäffoldimisparameetrite rakendamist.
Esimene täielikult lõpetatud elusorganismi genoom kuulub Haemophilus influenzaele, kelle genoomi suuruseks on 1,89 Mb. Shotgun genoomi projekt hõlmab endas mitut järku: DNA murdmine juhuslikest punktidest, saadud järjestuste sekveneerimine ja assambleerimisprogrammidega esialgse molekuli taastamine kasutades selleks eelnevalt sekveneeritud fragmentide liitmist. Skäffoldimist peetakse vajalikuks etapiks kogu genoomi shotgun projekti jaoks, kuna võimaldab kõrgkvaliteedilise mustandgenoomi järjestuse loomist, millelelt edasiselt on võimalik andmete edasine analüüs ja tulemuste tõlgendamine.
Joonis 1. Genoomi koostu paneb genoomi kokku lühikestest DNA sekventsijuppidest.
Koostu kvaliteet
Kuigi esineb teravaid probleeme koostute tegemisel, ei takista see asjaolu uute genoomiprojektide alustamist. Projekt i5k alustati aastal 2009 ja selle eesmärgiks on 5000 putukagenoomi sekveneerimine. Sellele järgneb Genome 10K projekt, mille eesmärk on sekveneerida 10 000 selgroogse genoomi. Ulatuslikuma eesmärgi on seadnud Hiinas asuv globaalne sekveneerimiskeskus BGI Shenzhen, mille sooviks on sekveneerida nii miljoni inimese, taime, mikroobi kui ka looma genoomi.
Põhjused, miks koostus vead esinevad, on mitmesugused. Järjestusetükid on koostu ülesehitamisel kõrvale heidetud (märgistatud kui viga või kordus), tükkide ühinemine on toimunud vales asukohas või tükkide suund on vääralt määratud. Lugemite ühendamisel saadud kontiigid on tihtipeale lühemad, kui nad võiksid olla. Seda põhjustavad koostute jaoks raskemad piirkonnad genoomis : kordusjärjestused, polümorfismid. Samuti teatud piirkonna andmete puudumine ja vead lugemites mõjutavad kontiigide moodustamist.
Genoomide hindamine toimub enamasti skäffoldide ja kontiigide arvu alusel. Teatud piisav arv pikemaid järjestusi on vajalik genoomi esindamiseks. Samuti kasutatakse nende järjestuste absoluutset ja pikkust kogu genoomi suhtes.
Koostu kvaliteeti hindamiseks on enimlevinud N50 suurus, mida määratletakse kui kontiigi vähimat pikkust, millest võrdsed või pikemad kontiigid katavad 50% kogu genoomsest järjestusest. Seega laialdasemalt kasutusel olevad meetrikud hindavad koostuid kontiigide suuruse, mitte kontiigide kvaliteedi ja täpsuse alusel, mis kajastaksid paremini koostu väärtust. Ebaõnnestunud koostute hulka kuulub esialgne mantellooma genoom. Hilisem koostu laiendas N50 väärtust kümnekordselt ja paljastas konserveerunud geene, mida varasemas koostus esindatud polnud. Sama selgus kana genoomse koostu uurimisel.
Vajalik on võrrelda erinevaid programme samade andmete alusel. Iga uue programmi kirjeldamisel, jooksutatakse seda kasutades konkreetseid andmeid ehk omavahel on keeruline programme võrrelda, kui igaüks jooksutab erineva andmete alusel. Assemblathon 1 ja 2, GAGE (Genome Assembly Gold -standard Evaluations) ja dnGASP (de novo Genome Assembly Assesment Project) on projektid, mille raames erinevad tarkvara arendajad moodustasid võistkondi ja proovisid enda programmiga saavutada häid tulemusi. Töötlemiseks kasutatud andmed olid selleks spetsiaalselt stimuleeritud andmestik mitte päris genoomid . Andmete valikut on kritiseeritud Assemblathon 1 puhul, kuna tehislikud andmed ei suuda kunagi peegeldada tegelikku olukorda piisavalt rahuldaval tasemel. Assemblathon 2 projektis pidi töötlema ka tõelisi sekveneerimisandmeid, mis pärinesid näiteks papagoilt ja boamaolt.
Järeldused
Assemblathon, GAGE ja dnGASP jõudsid kõik ühele järeldusele – ka kõige paremad koostud sisaldavad olulisi ja rohkelt vigu. Iga bioloog peaks silmas pidama , et täiuslikku genoomi ei saa nendega koostada. Samuti järeldus, et ideaalset ainuõiget meetrikut ei eksisteeri. Stateegiad, mis teevad vähem vigu, teevad seda pikkuse arvelt. See halvendab edasise analüüsi kvaliteeti, sest informatsiooni on vähe. Võimalik oleks tulevikus jooksutada programme varasemalt hästikirjeldatud genoomide ( hiir ja inimene) põhjal. Samuti peab silmas pidama, et programm tuleb valida vastavalt andmete spetsiifikale: see, mis sobib hästi prokarüootsete genoomide puhul, ei pruugi sarnaseid tulemusi eukarüoodsete organismide korral saavutada.
Selleks, et paraneks koostute kvaliteet, tuleb tõsta sekveneerimisprotsessi kvaliteeti. Samuti annab paremaid tulemusi, kui kasutada lisainformatsiooni näiteks transkribeeritud RNA-d koostute tegemisel. Kui tundub, et mingi piirkond genoomis on kehvasti taaskonstrueeritud, võib seda parandada kasutades suunatud sekveneerimist. Igatahes on vajalik edasine meetrikute analüüs, töötada uusi välja ja leida spetsiaalseid meetrikuid ka raskemate genoomsete piirkondade jaoks.
Kasutatud kirjandus
Fleischmann, R.D., Adams ,M.D., White, O., Clayton , R.A., Kirkness, E.F., Kerlavage, A.R., Bult, C.J., Tomb , J.F., Dougherty, B.A., Merrick, J.M., et al. (1995). Whole -genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd. Science 269 (5223): 496-512.
International Human Genome Sequencing Consortium. (2004). Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature 431: 931-945.
Godson, G.N, Barrell, B.G., Staden, R., Fiddes, J.C. (1978). Nucleotide sequence of bacteriophage G4 DNA. Nature 276: 236-247.
Gritsenko, A.A, Nijkamp, J.F., Reinders, M.J.T, de Ridder, D. (2012). Bioinformatics 28(11): 1429-37.
Narzisi G., Mishra, B. (2011). Comparing de novo genome assembly: the long and short of it. PLoS One. 6 (4).
Wu, W., Stupi, B.P., Litosh, V.A., Mansouri, D., Farley, D., Morris , S., Metzker, S., Metzker, M.L. (2007). Termination of DNA synthesis by N6-alkylated, not 3′-O-alkylated, photocleavable 2′-deoxyadenosine triphosphates. Nucleic Acids Research, 35 (19): 6339-6349.
Xue, W., Li, J.-T., Zhu, Y.-P., Hou, G.-Y., Kong , X.-F., Kuang, Y.-Y., Sun, X.-W. (2013). L_RNA_scaffolder: scaffolding genomes with transcripts
L_RNA_scaffolder: scaffolding genomes with transcripts
L_RNA_scaffolder: scaffolding genomes with transcripts
L_RNA_Scaffolder: scaffolding genomes with transcripts. BMC Genomics 14: 604.
Zhang , J., Chiodini, R., Badr, A., Zhang, G. (2011). The impact of next-generation sequencing on genomics. J Genet Genomics 38 (3): 95-109.