Läbi rakukesta ja rakumembraani pooride toimub aine- ja energiavahetus. 1) Tuum 2) Tuumake 3) Ribosoomid 4) Mitokoondrid 5) Lüsosoomid 6) Golgi kompleks 7) Tsütoplasmavõrgustik (kareda- ja siledapinnalist (kareda-pinnaline ER)) 8) Tsütoplaasm 9) Tsütoskeleet 10) Rakukest (tselluloosist, ligniinist, pektiinist.) 11) Vakuool 12) Platiidid (Leukoplastod, hloroplastis ja hromoplastid) 13) Rakumembraan Restriktaasid Restriktaasid- restriktaasid on ensüümid, mia lõigavad katki DNA´d. On järjestusspetsiifilised ristriktaasid ja need restriktaasid, mis lõigavd DNA ahelat suvalistes kohtades. Restriktaasidel on omadus lôigata DNA topeltahel läbi kindlas piirkonnas (lôikepiirkond- ingl. k. cleavage site), mille määrab ära antud piirkonna DNA nukleiinhappeline-järjestus (äratundmis-järjestused; ingl. k. recognition sequences- koosnevad 4-8 nukleotiidipaarist), kusjuures iga ensüümi jaoks on see erinev.
Geeni järjestus määrati ligikaudu mRNA sünonüümsed koodonid 1) Isoleeriti hüpofüüsi rakkudest kõik mRNA-d üks neist GH1 jaoks 2) Pöördtranskriptaasiga sünteesiti komplementaarsed cDNA-d üks neist geen GH1 3) DNA polümeraasiga sünteesiti cDNA-dele vastasahelad saadi mitu kaksikahelalist DNA-d üks neist sisaldas geeni GH1 Restriktaasid Et teada saada, milline DNA sisaldab GH1 geeni järjestust, geenid kloneeriti sisestati plasmiidi Paljunesid koos plasmiidiga Selleks: * eraldati bakteri plasmiidid * lõigati restriktaasidega Restriktaasid tunnevad ära teatud kindla järjestuse palindroomi: "Madam I´m Adam" Mõlemalt poolt lugedes sama info palindroom Ühe ahela 5`- 3` suunas GAATTC, vastasahela 5`- 3` suunas GAATTC Kõige tuntum restriktaas - EcoR1
puudub Põrna DNA endo(II) ahelasisene ester desoksüribonukleaas side, aluse spetsiif. puudub Maomürgi DNA, RNA ekso(I) 3´ ots, aluse fosfodiesteraas spetsiif. puudub Restriktsiooni endonukleaasid Restriktaasid Järjestusspetsiifilised DNA endonukleaasid Produtseeritakse erinevate bakterite poolt selleks, et degradeerida ehk restrikteerida võõr DNA molekule Peremeesraku DNA on kaitstud tänu lämmastikaluste spetsiifilisele metülatsioonile Isoleeritud ja biokeemiliselt iseloomustatud on sadu restriktaase Nomenklatuur tähis tuletatakse isoleerimiseks kasutatud liigi nimest EcoRI E. coli tüvest R isoleeritud esimene restriktaas Restriktaasid
Inimene ja meditsiin Helene Leht Geenitehnoloogia Kadi Jänes Kanepi Gümnaasium 2013 Geenitehnoloogia geenitehnika geenimanipulatsioon On meditsiini valdkond, mis tegeleb DNAlõikudega Eesmärgid on rakenduslikud Ajalugu 1970. aastal avastati restriktsiooniensüümid ehk restriktaasid bakterites Loodi rekombinantse DNA metoodikageenitehnoloogia baas 1978. a said restriktaaside karakteriseerimise ja uurimise eest füsioloogia ja meditsiini Nobeli preemia: Daniel Nathans, Werner Arber ja Hamilton O. Smith Geeniteraapia Normaalse geeni siirdamine raske geneetilise puudega inimese koe rakkudesse Mutantse geeni avaldumise vaigistamine Eesmärk pakkuda ravi erinevatele haigustele ja tõvedele Jaguneb kaheks: somaatiline ja sugurakke mõjutav Somaatiline geeniteraapia
o Jaanimardika geen tubakasse- helendub o Taimed toodavad plastmasse o Teraviljasordid, mis võtavad õhust lämmastikku (valkude sünteesiks) o Kiskjalest hävitab teised lestalised · Geene transporditakse geenivektoritega, millele on lisatud soovitud geen · Geenivektoriteks on o Bakteri plasmiidid o Viirused o Geene sisestatakse ka kullapüstoliga, taimedesse Agrobakteriga · Geenide ülekandmine on võimalik restriktaaside abil o Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks- need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad- ,,kleepuvad otsad" o Selliste otstega DNA juppe on komplementaarsuse tõttu võimalik liita o Erinevate DNA-de liitmisel saadakse rekombinantne DNA · Kuidas aru saada, et soovitud geen on üle kandunud? o Üle viidavale geenile on markergeen külge pandud · Näiteks kasutatakse GFP (helenduv) geeni markerina
N: RNA ja valgu tootmine SLAID 3: Joonis: TRANSGEENSE DNA SAAMINE SLAID 4 : TRANSGEENSE GEENI EHITUSES ON OLULINE PROMOOTOR Transgeenne geen koosneb teatud põhiosadest. Kindlasti peab transgeenne geen sisaldama promootirt, mille järjestus määrab millal ja kus on transgeen aktiivne, kuidas kulgeb valku kodeeriv järjestus jne. Väga hea näide sellisest funktsioonide kombinatsioonist on bakteri plasmiidil SLAID 5: GEENIDE ÜLEKANDMINE Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks – need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad – “kleepuvad otsad”.Selliste otstega DNA juppe on komplemen-taarsuse tõttu võimalik mugavalt liita.Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA SLAID 6: RESTRIKTAASIDE JOONIS eelmisele slaidile sarnane seletus joonise põhjal SLAID 7: KUIDAS GEENID KOHALE VIIA? SLAID 8:KUIDAS ARU SAADA KAS GEEN ON ÜLE KANDUNUD?
Millise tulemuse sain kontroll-restriktsioonist? Minu tulemus on väga ilus, eraldatud plasmiid tuli õige. Mille järgi valisime sobiva restriktaasi? Veel sobivaid restriktaase. Valisime EcoRI restriktaasi, kuna meie insert sisenes pSTBlue-1 vektorisse EcoRV saiti. Mõlemalt pool enne seda saiti on EcoRI sait. Seega oli väga hea valita just see restriktaas, saime mõlemalt poolt ühe restriktaasiga lõigatud ja vee täpselt väga lähedalt. Võiksime valida ka muud restriktaasid, nt PstI ja HindIII aga see oleks tülikas, kuna me ei eraldaks ainult meile huvipakkuvat fragmenti ja peaksime puhvritega jändama, kuna iga restriktaasi jaoks on erinevat soolakontsentratsiooni vaja. Mida silmas pidada kui kasutada mitut erinevat restriktaasi korraga? Millised lõikamiseks sobivad tingimused võivad erineda? Peame vaatama, mis puhvrit kasutame. Erinevatel restriktaasidel on erinevaid soolakontsentratsioone vaja. Samuti tuleks jälgida mis temperatuuri juures need
Kumbki neist saab ühe kromosoomi ning ligikaudu võrdse arvu plasmiide ja ribosoome. Generatsiooniaeg on aeg, mis kulub ühe raku pooldumiseks, st. rakkude arvu kahekordistumiseks. See on liigiti erinev ja sõltub oluliselt keskkonnatingimustest. 38. Eukarüootide riigid ja nende peamised tunnused Taimed, loomad, proistid, seened 39. Seeneraku ehitus vt. bioloogia lk.127 40. Taimeraku ehitus vt.koduõpetaja lk.41 ja bioloogia lk.128 41. Restriktaasid Restriktaasid- restriktaasid on ensüümid, mia lõigavad katki DNA´d. On järjestusspetsiifilised ristriktaasid ja need restriktaasid, mis lõigavd DNA ahelat suvalistes kohtades. Restriktaasidel on omadus lôigata DNA topeltahel läbi kindlas piirkonnas (lôikepiirkond- ingl. k. cleavage site), mille määrab ära antud piirkonna DNA nukleiinhappeline-järjestus (äratundmis-järjestused; ingl. k. recognition sequences- koosnevad 4-8 nukleotiidipaarist), kusjuures iga ensüümi jaoks on see erinev.
POWERPOINT: regulatsioon 32. Lac ja Trp operonid, nende reguleerimise sarnasused ja erinevused POWERPOINT: regulatsioon 33. Cis-elemendid, trans-faktorid POWERPOINT: regulatsioon 34. DNA-valk interaktsioonid regulatsioon toimib läbi paljude cis-acting elementide ja trans-acting faktorite vaheliste seoste. mitte-kovalentsed POWERPOINT: regulatsioon 35. Rekombinantse DNA metoodika alused POWERPOINT: rekombinantne DNA 36. Restriktaasid Restriktaasid- restriktaasid on ensüümid, mia lõikavad DNA katki. On olemas järjestusspetsiifilised restriktaasid ja restriktaasid, mis lõikavad DNA ahelat suvalistest kohtadest. Restriktaasidel on omadus lõikata DNA topeltahel läbi kindlas piirkonnas (lõikepiirkond- ingl. k. cleavage site), mille määrab ära antud piirkonna DNA nukleiinhappeline-järjestus (äratundmis- järjestused; ingl. k. recognition sequences- koosnevad 4-8 nukleotiidipaarist), kusjuures iga ensüümi jaoks on see erinev.
organismide genoomi muutmiseks biotehnoloogia vahendeid.Geenitehnoloogia seisneb konkreetsete DNA-lõikude eraldamises ning in vitro (katseklaasis) töötlemises. Sellele järgneb töödeldud lõikude siirdamine, kas sama või ka muu liigi esindaja kromosoomi, plasmiidi või viirusesse.Geenitehnoloogia tekkimise oluliseks baasiks oli rekombinantse DNA metoodika loomine, mis omakorda sai alguse tänu restriktsiooniensüümide ehk restriktaaside avastamisele bakterites 1970. aastal. Restriktaasid lõhuvad DNA molekuli kaksikahelad komplementaarseteks üheahelalisteks fragmentideks, millel on nn kleepuvad otsad. Lahuses kokku viidud paarduvate otstega fragmendid ühinevad ja ensüümi ligaas abil luuakse ka kovalentsed sidemed. 8. Geenitehnoloogia arstiteaduses - Tänapäeval kasutatakse igapäevaselt geenitehnoloogiat arstiteaduses. Näiteks saab juba teha uuringuid millised haigused võivad sind tabada ning mis on sinu võimalik eluiga. Seda kõike uuritakse just geenitehnoloogiaga
Geenitehnoloogia ehk tehnogeneetika ehk insenergeneetika ehk geenitehnika ehk geenimanipulatsioon seisneb konkreetsete DNA-lõikude eraldamises ning in vitro töötlemises. Sellele järgneb töödeldud lõikude siirdamine kas sama või ka muu liigi esindaja kromosoomi, plasmiidi või viirusesse. Geenitehnoloogia tekkimise oluliseks baasiks oli rekombinantse DNA metoodika loomine, mis omakorda sai alguse tänu restriktsiooniensüümide ehk restriktaaside avastamisele bakterites 1970. aastal. Restriktaasid lõhuvad DNA molekuli kaksikahelad komplementaarseteks üheahelalisteks fragmentideks, millel on nn kleepuvad otsad. Lahuses kokku viidud paarduvate otstega fragmendid ühinevad ja ensüümi ligaas abil luuakse ka kovalentsed sidemed. Geeniteraapia Geeniteraapia seisneb enamasti normaalselt talitleva geeni siirdamises raske geneetilise puudega inimese mingi koe (organi) rakkudesse. Osal juhtudel seisneb ravi ka mutantse geeni avaldumise vaigistamises. Eesmärk ravida teatud haigusi.
Trans-acting faktorid - transkriptsioonifaktorite seostudes teiste geenide cis-elementidega reguleerivad nende geenide ekspressiooni 37. Rekombinantse DNA metoodika alused Rekombinantne DNA on soovikohaselt muudetud DNA järjestus. Rekombinantse DNA same restrikaaside abil. Metoodika alused: - E.coli rakkude transformatsioon võõrDNA-ga (ehk võõr-DNA viimine E.coli rakkudesse) – plasmiidid - DNA molekulide lõikamine ja ühendamine - restriktaasid, ligaas - analüüsimeetodid võõrDNA jälgimiseks - elektroforees, hübridiseerimine 38. Restriktaasid Restriktaasid - ensüümid, mis lõikavad DNA kindla järjestuse ära (äratundmiskoht), tekivad iseloomulikud otsad. Äratundmiskohad on sageli 4-8 pikkusega. Restriktaasid lõikavad DNA ahele läbi kindlas piirkonnas, see sõltub DNA nukleeinhappelisest järjestusest. Kusjuures igal ensüümil on oma „äratundmiskoht“.
POWERPOINT: regulatsioon 32. Lac ja Trp operonid, nende reguleerimise sarnasused ja erinevused POWERPOINT: regulatsioon 33. Cis-elemendid, trans-faktorid POWERPOINT: regulatsioon 34. DNA-valk interaktsioonid · regulatsioon toimib läbi paljude cis-acting elementide ja trans-acting faktorite vaheliste seoste. · mitte-kovalentsed POWERPOINT: regulatsioon 35. Rekombinantse DNA metoodika alused POWERPOINT: rekombinantne DNA 36. Restriktaasid Restriktaasid- restriktaasid on ensüümid, mia lõikavad DNA katki. On olemas järjestusspetsiifilised restriktaasid ja restriktaasid, mis lõikavad DNA ahelat suvalistest kohtadest. Restriktaasidel on omadus lõikata DNA topeltahel läbi kindlas piirkonnas (lõikepiirkond- ingl. k. cleavage site), mille määrab ära antud piirkonna DNA nukleiinhappeline-järjestus (äratundmis- järjestused; ingl. k. recognition sequences- koosnevad 4-8 nukleotiidipaarist), kusjuures iga ensüümi jaoks on see erinev.
hindamiseks, lisatakse ühte hambasse redel e. kindla pikkusega DNA lõikudest koosnev kontrollsegu 22. Kas DNA on sinist värvi?-EI, värvusetu 23. Miks hakkab DNA elektroforeesil agaroosgeelis liikuma?- elektrivälja mõjul 24. Millise laenguga on DNA?- negatiivse 25. Kas agaroosgeelis liiguvad kiiremini pikad või lühikesed DNA jupid?- lühikesed 26. Milleks lisatakse agaroosgeelile etiidiumbromiidi?- DNA-le värvuse andmiseks 27. Mida teevad restriktaasid?- lõikavad DNA kindla koha pealt lõikudeks, nii, et tekivad üheahelalised otsad "kleepuvad otsad" 28. Milliseid ettevaatusabinõusid kasutab molekulaarbioloogia labor, et vältida valepositiivseid tulemusi?- töö etapid on ruumiliselt eraldatuderinevad tööruumid paiknevad järjestikuliselt ja samal päeval tagurpidi ei liigutakorralik desinfektsioon ja DNA lagundamise vahendid kasutatakse posit. Ja negat. KontrolliPosit. Tulemus kontrollitakse üle teiste praimeritega
(mutatsioonid), mis jäävad genotüüpi püsima Transgenees- protseduur transgeensete organismide saamiseks (loomadel nokaut) +- suurem saagikus, uued ravimid, keskkonna saastuse vähenemine - - väheneb looduslik mitmekesisus, maitseomaduste halvenemine 7. Rekombinantse DNA loomine, geenivektor (plasmiidne geenivektor, viirusvektor). Restriktaas, ligaas, „kleepuvad otsad“. Osata koostada skeemi. Restriktaasid on ensüümid, need lõikavad DNA kindla koha pealt lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad – “kleepuvad otsad”. Selliste otstega DNA juppe on mugavalt liita. DNA ühendamiseks piki suunas kasutatakse ensüüme nimega ligaas. Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. Geenid viiakse õigesse kohta kohale bakteri plasmiidiga või viirustega (geenivektoritega) või süstitakse otse viljastatud munarakku. 8. Genoomipank, pöördtranskriptaas, retroviirus
1)Protistid häähää 2)taimeriik rakukest, plastiidid, suuredvakuoolid 3)seeneriik kõik heterotroofid, kasutavad teiste organismide sünt org ainet. 4)loomariik 41. Algloomade raku ehitus. Vibur! Võivad sisaldada ka kloroplaste. 42. Seeneraku ehitus. Samad organellid, mis loomsesrakus, taimedele omased plastiidid puuduvad, sh vakuoolid. Üherakulised seened on ümarad, kuid hulkraksed, hüüfemoodustavad seened on niitjad, otste kaudu liiguvad organellid ja rakutuumad. 43. Restriktaasid. Paljud bakterid produtseerivad ensüüme, restriktsioonilisi endonukleaase e. klass II restriktaase, mis tunnevad kindlaid 4 8 aluspaari pikkusi DNA järjestusi ning lõikavad DNA d ainult nendest spetsiifilistest kohtadest. Nii kaitsevad restriktaasid baktereid näit faagide sissetungi eest, lagundades nende DNA enne, kui faag jõuab mikroobi kahjustada. Omaenese restriktaaside suhtes on bakterid resistentsed, sest bakteri enda genoomis on
Kordamisküsimused Geenitehnoloogia I Restriktaasid. Restriktaasid on ensüümid, mis lõikavad DNA-d spetsiifilise nukleotiidse järjestuse järgi. Nad teevad seda kõikide DNA’de puhul samamoodi. Neid spetsiifilisi järjestusi nimetatakse restriktsiooni aladeks. Selliseid ensüüme on leitud bakteritest kaitsmaks neid kahjulike viiruste eest. DNA kloneerimine baseerub restriktaaside avastamisel. DNA järjestuse äratundmine varieerub erinevate restriktaaside vahel, lõigates tekivad eri pikkusega “kleepuvad” üleulatuvad osad
1. Rakuteraapia tüvirakke kasutatakse kahjustunud kudede taastamiseks. 2. Tüvirakk - hulkrakse looma jagunemisvõimeline rakk, mille tütarrakud võivad diferentseeruda eri tüüpi koerakkudeks 1.3 Geenitehnoloogia On biotehnoloogia haru, kus eesmärgi saavutamiseks viiakse geene ühest organismist teis või muudetakse muul viisil geene, saadakse GMO. Organism, kellele on viidud võõraid geene nim. Transgeenseteks. Nokautorganism organism, kellel teatud geen on maha surutud. Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad ensekaitseks bakterid. Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. Pärilikkuse muutumiseks kasutatakse mutageenides kiirgusi ja keemilisi ühendeid. Muudetud päriliku unfo siirdamiseks kasutatakse bakterite rõngaskromosoome. GMO-dega kaasvenad miinused ja plussid: MIINUSED PLUUSID · toiduallergia · suurem saagikus
1. Bakteri plasmiidiga – plasmiidse vektori abil 2. Viirustega – viirusvektori abil 3. Kullapüstoliga – Au kuulikesele on kinnitatud DNA, see “tulistatakse” rakku 4. Taimedesse Agrobakteriga – taimi kergesti nakatav bakter 5. Homoloogiline rekombinatsioon – Dna molekuli homoloogiliste piirkondade vaheline ristsiire, kus rekominantne DNA asendab olemasoleva Erinevate DNA-de liitmisel same rekombinantse DNA. Kuidas DNA-d lõigata? Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks. Restriktaase on erinevaid, igaühel oma “äratundmiskoht” DNA-l. Restritaasid lõikavad DNA sagely nii, et tekivad üheahelalised otsad - “kleepuvad otsad”. Selliste otstega DNA lõike on komplementaarsuse tõttu võimalik mugavalt liita. Kuidas kergesti aru saada, et soovitud geen on üle kandunud? - üle viidavale geenile on markergeen külge pandud (GFP-geen). Miks bakterirakus ei hakka inimese geen kohe tööle?
Eelduseks rekombinantse DNA loomine so. DNA molekul,mis koosneb eri liigi DNA juppide ühendusest.(1970) restiktaasid bakterites leiduvad ensüümid mis tagavad neile nn ,,immuunsuse" viiruste vastu lõigates nende DNA juppideks. · Bakterid omavad võõra DNA vastu nn R/M süsteemi · toimub kahe ensüümi koostöö : restriktaas(R) mis lõikab DNA tükkideks ja metüültransferaan(M) mis metüleerib ära oma DNA ja kaitseb seega oma DNA-d lõhkumise eest. · Restriktaasid tunnevad ära teatud järjestusega nukleotiidi paarid (4-8)DNA-s · teada erinevaid restriktaase üle 3500 · vastavalt restriktaasi toimele lõigatakse DNA lahti kas lõikuvalt või tömbilt. Kahe DNA kleepuvate otste liitumine toimub komplementaarsus printsiipide alusel ja ahelate aheald liituvad omakorda ligaasi abil. Meie ja teiste loomade, seente ja taimede geenis on intronid( nukleotiidsed järjestused mis ei määravalgu ehitust) ja eksonid
mitte-kovalentsed DNAga seostumiseks võib valgul olla vajalik seostuda enne teise valguga (valk-valk interaktsioon) 38. Rekombinantse DNA metoodika alused Rekombinantne DNA on soovikohaselt muudetud DNA järjestus. Metoodika alused: - E.coli rakkude transformatsioon võõrDNA-ga (ehk võõr-DNA viimine E.coli rakkudesse) – plasmiidid - DNA molekulide lõikamine ja ühendamine - restriktaasid, ligaas - analüüsimeetodid võõrDNA jälgimiseks - elektroforees, hübridiseerimine 39. Restriktaasid Restriktaasid- restriktaasid on ensüümid, mia lõikavad kindla DNA järjestuse(äratundmiskoht) katki nii, et tekivad iseloomulikud otsad. Äratundmiskohad on sageli palindroomsed, pikkusega 4-8 nt (AIAS SADAS SAIA) Restriktaasidel on omadus lõikata DNA topeltahel läbi kindlas piirkonnas (lõikepiirkond- ingl. k.
mitte-kovalentsed DNAga seostumiseks võib valgul olla vajalik seostuda enne teise valguga (valk-valk interaktsioon) 38. Rekombinantse DNA metoodika alused Rekombinantne DNA on soovikohaselt muudetud DNA järjestus. Metoodika alused: - E.coli rakkude transformatsioon võõrDNA-ga (ehk võõr-DNA viimine E.coli rakkudesse) plasmiidid - DNA molekulide lõikamine ja ühendamine - restriktaasid, ligaas - analüüsimeetodid võõrDNA jälgimiseks - elektroforees, hübridiseerimine 39. Restriktaasid Restriktaasid- restriktaasid on ensüümid, mia lõikavad kindla DNA järjestuse(äratundmiskoht) katki nii, et tekivad iseloomulikud otsad. Äratundmiskohad on sageli palindroomsed, pikkusega 4-8 nt (AIAS SADAS SAIA) Restriktaasidel on omadus lõikata DNA topeltahel läbi kindlas piirkonnas (lõikepiirkond- ingl. k.
suunas. Sea rakkudega saab ka inimesi ravida! geenitehnoloogia on biotehnoloogia haru, kus eesmärgi saavutamiseks viiakse geene (geeni osi) ühest organismist teise või muudetakse muul viisil geene saadakse GMO. Organisme, kellele on viidud võõraid geene, nim. transgeenseteks. Esimene transgeenne bakter tehti 1973.a. Nokautorganism organism, kellel teatud geen on maha surutud. Geenide ülekandmine on võimalik restriktaaside abil. Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad "kleepuvad otsad". Selliste otstega DNA juppe on komplemen- taarsuse tõttu võimalik mugavalt liita. Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. Miks bakterirakus ei hakka inimese geen kohe tööle? Meie ja teiste loomade, seente ja taimede geenis on intronid ja eksonid. Pärast transkriptsiooni lõigatakse intronid välja ja ainult
DNA fragmendid. Metoodika 1.Sama restriktaas (restriktsiooniesüüm) tunneb ära sama järjestuse DNA erimolekulides. 2.Restriktaas „lõikab“ DNA ahelad pooleks nii,et tekivad „kleepuvate“ otstega DNA lõigud. 3.Eri päritolu DNA lõigud viiakse lahuses kokku; ühinevad komplementaarsuse alusel; „kleepuvate“ otste vahele tekivad vesiniksidemed. 4. Ensüüm ligaasi abil ühendatakse eri päritolu DNA lõigud omavahel kovalentsete sidemetega kokku- tekib rekombinantne DNA molekul. Restriktaasid. Restriktaasid on ensüümid, mia lõigavad katki DNA´d. On järjestusspetsiifilised ristriktaasid ja need restriktaasid, mis lõigavd DNA ahelat suvalistes kohtades. Restriktaasidel on omadus lôigata DNA topeltahel läbi kindlas piirkonnas (lôikepiirkond- ingl. k. cleavage site), mille määrab ära antud piirkonna DNA nukleiinhappeline-järjestus (äratundmis-järjestused; ingl. k. recognition sequences- koosnevad 4-8 nukleotiidipaarist), kusjuures iga ensüümi jaoks on see erinev.
GEENITEHNOLOOGIA ...on biotehnoloogia haru, kus eesmärgi saavutamiseks viiakse geene (geeni osi) ühest organismist teise või muudetakse muul viisil geene saadakse GMO . Organisme, kellele on viidud võõraid geene, nim. transgeenseteks . Esimene transgeenne bakter tehti 1973.a. Nokautorganism organism, kellel teatud geen on maha surutud. Geenide ülekandmine on võimalik restriktaaside abil. Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad "kleepuvad otsad". Selliste otstega DNA juppe on komplemen-taarsuse tõttu võimalik mugavalt liita. Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. Kuidas geenid kohale viia? Bakteri plasmiidiga Viirustega Kui neile on soovitud geen lisatud, nime- tame teda geenivektoriks. 3. Kullapüstoliga 4
mis suunas. Sea rakkudega saab ka inimesi ravida! GEENITEHNOLOOGIA …on biotehnoloogia haru, kus eesmärgi saavutamiseks viiakse geene (geeni osi) ühest organismist teise või muudetakse muul viisil geene saadakse GMO. Organisme, kellele on viidud võõraid geene, nim. transgeenseteks. Esimene transgeenne bakter tehti 1973.a. Nokautorganism – organism, kellel teatud geen on maha surutud. Geenide ülekandmine on võimalik restriktaaside abil. Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks – need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad – “kleepuvad otsad”. Selliste otstega DNA juppe on komplemen- taarsuse tõttu võimalik mugavalt liita. Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. Restriktaas Vektor Lõigatud DNA Restrikataas (sama)
Energiat annavad rakkudele jõujaamasarnased mitokondrid ja rohelised päikesepatareid - plastiidid. Plastiidides toimub toitainete süntees, mitokondrite abil töötlevad taimerakud ümber toitaineid ja saavad neist energiat. Kõik raku sisemuses asuvad osad ujuvad poolvedelas plasmas. Suure osa taimerakust täidab vakuool, mis on täis rakumahla. Vakuool hoiab raku pallikesena pinges. Rakumahlas liiguvad kõik raku toitained. 39. Restriktaasid - ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks. Nad lõikavad DNA-d spetsiifilise nukleotiidse järjestuse järgi nii, et tekivad üheahelalised ehk kleepuvad otsad, mida on mugav komplementaarsuse põhjal liita. Bakteris tunnevad restriktaasid neile spetsiifilise koha 48 nukleotiidi järgi ära ja lõikavad võõra DNA sealt katki sellist mehhanismi nimetatakse restriktsiooniks. 40. DNA kloneerimise etapid. Kloonimise puhul võib eristada kaht meetodit: 1
represseerib transkriptsiooni (seostumisel teatud valkudega). 36. DNA-valk interaktsioonid. Regulatoorsed valgud omavad DNA-d siduvat domääni, mis on kindla struktuuriga. Valkude aminohappejäägid interakteeruvad DNA alustega H-sidemete kaudu. 37.Rekombinantse DNA metoodika alused. Definitsioon-soovikohaselt muudetud DNA järjestus, selle ekspressioon, tulemus. DNA valgud on suured, monotoonsed, keemiliselt stabiilsed. 38.Restriktaasid. DNA molekulide lõikamine ja ühendamine. Restriktaasid lõikavad kindla DNA järjestuse (äratundmiskoht) katki, nii tekivad iseloomulikud otsad. Äratundmis kohad on tavaliselt palindroomsed, pikkusega 4-8 nukleotiidi. Restriktaasid, mis lõikavad erinevaid DNA järjestusi, võivad anda samad otsad (sarnased otsad paarduvad). DNA ligaas sünteesib paadunud otste vahele fosfodiestersideme. 39.Plasmiidid
Katseklaasi-põis hakkas inimeses tööle. GEENITEHNOLOOGIA ...on biotehnoloogia haru, kus eesmärgi saavutamiseks viiakse geene (geeni osi) ühest organismist teise või muudetakse muul viisil geene saadakse GMO. Organisme, kellele on viidud võõraid geene, nim. transgeenseteks. Esimene transgeenne bakter tehti 1973.a. Nokautorganism organism, kellel teatud geen on maha surutud. Geenide ülekandmine on võimalik restriktaaside abil. Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad "kleepuvad otsad". Selliste otstega DNA juppe on komplemen-taarsuse tõttu võimalik mugavalt liita. Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. Restriktaas Vektor Lõigatud DNA Restrikataas (sama)
Y-seoseline – haigestuvad ainult mehed, haiel poisil alati haige isa. HW valemi kohaselt vabalt ristuvas populatsioonis, mis on geneetilises tasakaalu seisundis on alleeli- ja genotüübisagedused konstantsed. Valem: p2 + 2pq + q2 =1, kus p ja q on alleelisagedused. Kasutatakse genotüüpide ja alleelisageduste väljaarvutamiseks. 52. DNA amplifikatsioon: PCR ja PCR-l põhinevad mutatsioonianalüüsi meetodid (3 erinevat), nende eelised ja puudused, restriktaasid ja nende kasutamine DNA analüüsil. Kasutatakse puhastatud DNA polümeraasi, oligonukleotiidseid parimereid ja dNTP-sid. Põhineb kolmel järjestikulisel reaktsioonil erinevatel temperatuuridel ning tsükleid korratakse umbes 30 korda. Kõigepealt denatureeritakse temperatuuri tõstmisega (tavaliselt 95C kraadi). Mahajahtumisel saavad praimerid seonduda komplementaarselt, see on annealing. Järgneb uue DNA fragmendi süntees DNA polümeraasi ja dNTP-de lisamisega
fragmendi miljoneid koopiaid. (4) DNA fragmendi nukleotiidide järjestuse määramine (sekveneerimine- ingl k. sequencing), mis vôimaldab määratleda geenide NH-lise koostise, nende täpse asukoha kromosoomis, aga ka geeni poolt kodeeritavate valkude aminohappelise koostise. (5) Insenergeneetika- geenide DNA järjestuse muutmine ja muudetud geenide vôi uute geenide viimine rakkudesse ja organismi. Organismide geneetiline modifitseerimine. 3. Mis on restriktaasid? Restriktaasid (sait-spetsiifilised endonukleaasid) on ensüümid, mis lõikavad DNA-d spetsiifilise nukleotiidse järjestuse järgi. 4. DNA kloonimine, millised on isepaljunevad süsteemid DNA kloonimiseks. DNA kloonimise all môistame teatud DNA lôigu paljundamist. Selleks kasutatakse isepaljunevaid süsteeme vôi polümeraas-ahelreaktsioooni. Isepaljunevate süsteemidena (nimetatakse ka vektoriteks) kasutatakse tavaliselt baketerite plasmiide vôi viiruseid- bakteriofaage
W. Arber leidis, et T4 paljunemine on osades E. coli tüvedes restrikteeritud (piiratud) E. coli tüve B rakkudes paljundatud faagi edasine paljunemine on takistatud tüve K rakkudes ja vastupidi Restriktsiooni-modifikatsiooni süsteem bakterites Restriktaasid – endonukleaasid, mis fragmenteerivad DNA-d spetsiifilistest kohtadest Metülaasid – modifitseerivad nukleotiide restriktaaside poolt äratuntavatest 4 – 6 bp pikkustest DNA järjestustest, kaitstes DNA-d restriktaasi eest Rakus lagundatakse võõrast DNA-d, mis ei ole antud bakteritüve restriktaasi eest kaitstud E. coli tüves RI on kirjeldatud restriktaas EcoRI ja sellele vastav
kokkupakkida, on terved piirkonnad valgus, mis koosnevad eelkõige hüdrofoobsetest aminohappejääkidest. Neid ei õnnestu sisse pakkida. Sellised valgud paigutatakse sellisesse keskkonda, kus hüdrofoobsed aminohappejäägid satuvad veevabasse keskkonda membraani. Võib olla nii, et muidu hüdrofoobse piirkonna sisse tekkib kanal. Läbi selle kanali saavad liikuda hüdriilsed ained. Valgu molekulid tagavad niisiis iga konkreetse membraani spetsiifilisuse. KLONEERIMINE 15/10/09 Restriktaasid on ühed valgulised ensüümid, sellised ensüümid, mis lõikavad katki DNA'd. Nukleiin happeid lagundavad üldiselt sellised ensüümid nagu nukleaasid. Rakkudes on palju erinevaid nukleaase, mis lõhuvad fosfodiestersidemeid. RNA'd lõhub ribonukleaas ja DNA'd desoksüribonukleaas ja on olemas ebaspetsiifilisi nukleaase, mis lõhuvad nii RNA, kui ka DNA ahelaid. Kõikidel tuntud nukleaasidel oli üks ühine omadus: nad lõhkusid fosfodiestersidemeid järjestusest sõltumata
erimunakaksikud (50%)- risk 60%, ühemunakaksikud (100%)- risk 85% 6. PPT 1. Geneetiline doping 2. Biokunst transgeenne kunst (ingl. Transgenic art)- Võimalused konstrueerida ebanormaalsete omadustega järglasi (monstrumeid). Näiteks sinised tomatid või helenduvad kalad ja imetajad. jms 3. Insenergeneetika olemus 1. Rekombinantse DNA tehnoloogiad - Plasmiidid - Restriktaasid - Transgeenid 2. Geenide kloonimine - Kloonimisvektorid - Genoteegid ja kloniteegid 3. Geeniraamatukogud - Genoteegid - Klonoteegid 4. Transposoonid 4. Transgeenne tehnoloogia Transgeen(Organismi või rakku sisseviidav võõras geen) transgeenne kunst (ingl. Transgenic art)- Võimalused
luuüdis. (tüvirakkude skeemi vaata lehelt). Geenitehnoloogia seisneb DNA valitud lõikude eraldamises, töötlemises in vitro ja siirdamises sama või muu liigi isendi geneetilisse struktuuri kromosoomi, plasmiidid või viirusesse. Rekombinantseks DNA-ks nimetatakse DNA molekuli, milles on ühendatud eri liikidelt pärit DNA-fragmendid. Selle metoodika eelduseks oli omakorda restriktsiooniensüümide ehk restriktaaside avastamine bakterites. Restriktsiooniensüümid ehk restriktaasid on omapärased ensüümid, mis lõikavad DNA molekuli kaksikahelast kindlate järjestuste kohalt. Enamik lõikab DNA mõlemat ahelat vastava järjestuse eri otsadest. Ensüüm ligaas toimel ühinevad ahelate otsad ka kovaletsete sidemetega ja rekombinantsed moelkulid ongi moodustunud. Osa geenitenoloogiliste meetodite juures on asendamatuks abivaheniks osutunud pöördtranskriptaas ehk revertaas, mis on ensüüm, mis katalüüsib DNA sünteesi RNA järgi, s.t.
Rakukest koosneb tselluloosist, ligniinist ja pektiinist. Noorel rakul on kest õhuke, raku vananedes see pakseneb. Raku kestades on poorid, milel kaudu toimub ainevahetus. Naaberrakkude tsütoplasmad ühenduvad tsütoplasmaväätide ehk plasmodesmide kaudu. Taimerakus on vakuoolid, plastiidid(proplastid, kloroplastid, kromoplastid, leukoplastid), ribosoomid, karedapinnaline ja siledapinnaline tsütoplasma võrgustik, tuum, mitokonder, Golgi kompleks, tsütoplasma, lüsosoomid. 43. Restriktaasid. Ehk endonukleaasid lagundavad nukleiinhapet, lõhkudes suhkur-fosfaat selgroos nukleotiidide vahelist sidet ehk fosfodiestersidet ahelasiseselt, mitte otstest. Restriktaase toodavad bakterid. Restriktaasid on järjestusspetsiifilised. 44. DNA kloneerimise etapid. 1. Lõigatakse nii vektorit B-saidis(vektoriteks kasutatakse tihti plasmiide) kui ka uuritavat DNA- d retriktaasiga, mis genereerib "kleepuvad" otsad. (kui nii kloneerimisvektori DNA-d kui ka
DNA-l puudub 2'- OH, mistõttu ta on stabiilsem. NB! Geneetiline materjal peab olema stabiilne! · RNA - on vastupidav lahjades hapetes - hüdrolüüsub lahjas leelises · DNA - on vastupidav leeliste suhtes - lahjades hapetes depurineerub, st puriinnukleotiidides ,N-glükosiidside hüdrolüüsub Eksonukleaasid hüdrolüüsivad otsmisi (terminaalseid) fosfodiestersidemeid; Endonukleaasid hüdrolüüsivad ahelasiseseid fosfodiestersidemeid. Restriktaasid Spetsiifilised endonukleaasid, esinevad bakterites vajalikud neile kaitseks võõra DNA sissetungi vastu II ja III tüüpi restriktaasid lõikavad DNA mõlema ahela teatavaid fosfodiestersidemeid Võivad potentsiaalse lõikamispunkti (saidi) juures ära tunda 4...6 ("six- cutter") või rohkem aluseid Leiavad laialdast kasutamist geenitehnoloogias DNA SEKUNDAARSTRUKTUUR Kaksikspiraal, mida fikseerivad vesiniksidemed komplementaarsete lämmastikaluste
paiknevad peamiselt lehtedes, sest neil on oluline roll fotosünteesis. Veel leidub seal ribosoome ja DNAd ning RNAd. Kromoplastid sisaldavad karotinoide, paiknevad viljades ja õites. Leukoplastides pigmente pole, neis paiknevad varuained. Vakuoolid on membraaniga ümritsetud põiekesed, mis sisaldavad enamasti varu- ja jääkaineid, on veemahutid. Võivad sisaldada ligimeelitavaid aineid aga ka jääkaineid mis peletavad loomi eemale. Lüsosoom, Golgi kompleks. 45. Restriktaasid. Omapärased ensüümid, mis lõikavad DNA kaksikahelat kindlate järjestuste kohalt nii, et tekivad kleepuvate otstega DNA lõigud. Eri päristolu lõigud viiakse lahuses kokku ja nad ühinevad komplementaarsuse alusel, kleepuvate otste vahele tekivad vesiniksidemed. Ensüüm ligaasi abil ühendat eri päritolu lõigud kovalentsete sidemetega, tekib rekombinantne DNA molekul. Bakterid kaitsevad end sedasi viiruste eest. 46. DNA kloneerimise etapid
Leukoplast on värvusetu ja selle ülesandeks on varuaine tärklise talletamine. b)tsentraalvakuoolid – peamine ülesanne on vee säilitamine, samuti kindlustab see raku siserõhu ehk turgori, seal toimuvad lõhustumisprotsessid, noore raku vakuoolides on toitained. c)Lisaks rakumembraanile ümbritseb taimerakku ka rakukest. See koosneb taimede puhul tselluloosist (seentel kitiinist). See annab rakule kuju ja kaitseb välismõjutuste eest. 40. Restriktaasid on endonukleaasid, mis kaitsevad rakke võõra DNA eest. Nad tunnevad ära lühikesi spetsiifilisi DNA-järjestusi ja lõikavad molekuli katki. On olulised geenide kloonimise seisukohalt. Nende avastamise eest said Hamilton Smith ja Daniel Nathans 1978 Nobeli preemia. 41. DNA kloonimise etapid Uuritava geeni isoleerimine Viimine isereplitseeruvasse geneetilisse elementi Amplifikatsoon ehk molekulide paljundamine
Samuti võib mutatsioon kodeerivas järjestuses muuta ainult koodoni viimast nukleotiidi, kuid mõlemal juhul kodeerivad koodonid sama aminohapet (näiteks UUA ja UUG kodeerivad mõlemad leutsiini); või siis toimub ühe aminohappe asendumine teisega, millel on eelmisega võrreldes sama laeng (näiteks valiini asendumine alaniiniga). Muutusi DNA järjestuses kirjeldab näiteks restriktsioonifragmentide pikkuse polümorfism RFLP (restriction fragment-length polymorfism). Restriktaasid lõikavad DNA-d kindlatest järjestustest ning DNA molekuli lõikamise tulemusena tekivad erineva pikkusega DNA fragmendid, mida on võimalik geelelektroforeesil üksteisest lahutada. Kui mõnes ensüümi lõikamiskohas on toimunud muutus, ei lõika ensüüm sealt ning sel juhul tekivad võrreldes algse DNA lõikusega erineva pikkusega DNA fragmendid. RFLP analüüsi kasutatakse näiteks inimese neljandas kromosoomis asuva Huntingtoni tõve põhjustava alleeli läheduses paikneva lookuse D4S10
(ühemunakaksikutel identne genotüüp). 2. kontrolltöö 3. 1. Mis on rekombinant-DNA? Restriktaaside abil loodud DNA molekul, mis looduses ei esine. 2. Millised on rekombinant-DNA tehnoloogia põhimeetodid? DNA lõikamine restriktaasidega DNA kloonimine DNA sekveneerimine – nukleotiidse järjestuse määramine Insenerigeneetika – DNA järjestuse muutmine ja GMO-de loomine – muudetud geneetilise materjali viimine organismidesse. 3. Mis on restriktaasid? Endonukleaasid, mis lõikavad DNA-d kindlatest kohtadest (äratundmisjärjestustest – ÄJ). ÄJ on 4-8 bp pikkune DNA järjestus. Kui restriktaasid lõikavad, siis võib tekkida kas EcoRI-ga kleepuvad otsad, millega on lihtsam DNA-d uude kohta ühendada (üleulatuvad) või tömbid otsad SmaI-ga. Igal restriktaasil on oma kindel äratundmisjärjestus. 4. DNA kloonimine, millised on isepaljunevad süsteemid DNA kloonimiseks.
Seetõttu on CpG dinukleotiid evolutsiooniliselt säilunud ainult seal, kus tsütosiin ei ole metüleeritud, st ekspresseruvate geenide promootorpiirkondades. TSÜTOSIIN 5-METÜÜLTSÜTOSIIN TÜMIIN Selleks, et eraldada selliseid saari ülejäänud genoomi suuresti A-T rikastest piirkondadest oleks sobiv kasutada restriktaasi, mis hüdrolüüsib C-G järjestusi (näiteks Cfr42I (SacII), CCGC'GG; NotI GC'GGCCGC;). Need restriktaasid on reeglina tundlikud C metülatsioonile C mpG järjestuses, võimaldades restrikteerida seega aktiivseid geene (inaktiivsed võivad olla metüleeritud). Seega on antud töö eesmärgiks kloneerida CpG saarekestel paiknevaid geene, täpsemalt geenide regulaatoralasid ja saadud järjestuste kuuluvus teha kindlaks DNA järjestuste määramise (sekveneerimise) abil. Saadud töö tulemused võivad leida kasutust molekulaargeneetika laboratooriumi teaduslikus uurimistöös.
vigasest T/G paarist T väga väikese efektiivsusega) seega jääb alles väga väike osa CpG järjestustest. Seetõttu on CpG dinukleotiid evolutsiooniliselt säilunud ainult seal, kus tsütosiin ei ole metüleeritud, st ekspresseruvate geenide promootorpiirkondades. Selleks, et eraldada selliseid saari ülejäänud genoomi suuresti A-T rikastest piirkondadest oleks sobiv kasutada restriktaasi, mis hüdrolüüsib C-G järjestusi (näiteks Cfr42I (SacII), CCGC'GG; NotI GC'GGCCGC;). Need restriktaasid on reeglina tundlikud C metülatsioonile C mpG järjestuses, võimaldades restrikteerida seega aktiivseid geene (inaktiivsed võivad olla metüleeritud). Seega on antud töö eesmärgiks kloneerida CpG saarekestel paiknevaid geene, täpsemalt geenide regulaatoralasid ja saadud järjestuste kuuluvus teha kindlaks DNA järjestuste määramise (sekveneerimise) abil. Saadud töö tulemused võivad leida kasutust molekulaargeneetika laboratooriumi teaduslikus uurimistöös.
kogus supernatanti, ilma, et sade kaasa tuleks, vastasel juhul kas kaotatakse osa saagisest, või võetakse kaasa jääke) 6. Kontroll-restriktsioon a. Kontroll-restriktsiooni on vaja, et kontrollida, kas saadud plasmiid on õige, see võimaldab ka näha, kas puhastamine oli efektiivne foreesipildilt on näha, kui proovis on lisaks saadud plasmiidile ka näiteks bakteriaalset DNA-d. Valides sobivad restriktaasid, on võimalik kontrollida, kas insert on plasmiidi sisenenud õiget pidi. b. Kasutasime restriktaasi EcoRI, mis lõikab kahelt poolt EcoRV lõikamissaiti, kuhu sisestasime oma inserdi. See võimaldab tükkide pikkuste järgi määrata, kas insert on vektorisse sisenenud või mitte. Protokoll: 1. Pipeteerida: i. 5,9 l vett ii. 3 l just puhastatud plasmiidset DNA-d iii. 1 l restriktaasi 10x puhvrit
11bp järjestust) 92. DNA tandeemsed ja palindroomsed järjestused. Mõõdukalt kordistunud DNA piirkonnad (12,5 % genoomist) on sellised, kus igat lõiku on 104 - 105 koopiat. Siia kuulub geneetilist infot mittekodeerivaid alasid, mis asetsevad genoomis rühmiti (tandeemsed kordused) või ka hajusalt laiali (hajuskordused ehk polündroomsed kordused). Palindroomsed - geneetilised laused, kus teatud sümmeetriateljest paremale ja vasakule lugedes on järjestus sama. 93. Restriktaasid. Ekso- ja endonukleaasid. Nukleaasid - ensüümid, mis degradeerivad nukleiinhapet, lõhkudes fosfodiestersidemeid. Restriktaasid - rõngasmolekulist lineaarse vormi tagasi moodustumine alusspetsiifilise endonukleaasi toimel. Eksonukleaasid- eemaldavad nukleotiide DNA ahela otsast (lagundavad nukleiinhappe ahelat kas 5' või 3' otsast (5'eksonukleaasid ja 3'eksonukleaasid) Endonukleaasid- atakeerivad ja võtavad ära nukleotiide DNA ahela seest. 94. DNA polümeraas I omadused.
Polünukleotiidahelate lõikamine. Eksonukleaasid hüdrolüüsivad fosfodiestersidet terminaalsete jääkide juurest. Endonukleaasid hüdrolüüsivad nukleiinhapete sisemisi (mitte-terminaalseid) fosfodiestersidemeid. Restriktsiooniensüümid. Bakterid kaitsevad ennast võõra DNA sissetungi eest restriktsiooniensüümide e restriktaaside abil. II ja III tüüpi restriktaasid lõikavad DNA ahelaid kindlates kohtades. Ensüümid võivad ära tunda 4-6 või rohkem aluseid potensiaalse lõikamissaidi juures. XV NUKLEIINHAPETE STRUKTUURITASEMED 1. DNA sekundaarstruktuur vesiniksidemed komplementaarsete aluspaaride vahel. Suhkur-fosfaat põhiskelett väljaspool; lämmastikalused seespool. Paremakäeline kaksikheeliks jätab aluspaaride omavaheliseks kauguseks 3,4 Å.
Kindlustab rakkude liikumise, kuju muutmise, organellide ümberpaiknemise. 37. Milliseid rakke ümbritseb rakukest? Taimerakke seenerakke 38. Eukarüootide riigid ja nende peamised tunnused. Loomad Taimed Seened Protistid 39. Taimeraku ehitus Ainult taimerakule iseloomulikud organellid: plastiidid, suur vakuool (kindlustab raku siserõhu, säilitab vett, lõhustumisprotsessid), rakukest (annab kuju, kaitseb) 40. Restriktaasid Ehk restriktsoonilised ensüümid. Bakteriaalsed kaitsesüsteemid kaitsmaks baktereid võõraste DNAde eest. 41. DNA kloneerimise etapid 1. Peremeesorganismi ja kloonimisvektori valik. 2. Vektor DNA ettevalmistamine. 3. Kloonitava DNA ettevalmistamine. 4. Rekombinantse DNA sünteesimine ligatsiooni abil. 5. Rekombinantse DNA sisestamine peremeesorganismi → hakkab seal paljunema. 6
endergoonilisi protsesse eksergooniliste protsesside käigus vabaneva energia arvel · Toimivad väga pehmetes tingimustes · On väga selektiivsed ja äärmiselt kõrge spetsiifilisusega. · Alluvad regulatsioonile Ensüümkatalüüsi iseloomustab: · Substraatspetsiifilisus (mis läheb sisse) Erinevalt keemilistest katalüsaatoritest katalüüsivad ensüümid suhteliselt kitsa substraatide valiku reaktsioone. Näiteks: restriktaasid või proteiinkinaasid. Substraatspetsiifilisus põhineb eelpool loetletud interaktsioonidel ja substraadi ning ensüümi ruumilisel sobivusel ning seda kirjeldavad põhiliselt kaks hüpoteesi: Luku ja võtme hüpotees (Fisher, 1894) Indutseeritud sobivuse hüpotees (Koshland, 1958) · Stereospetsiifilisus (mis tuleb välja) · Katalüütiline efekt (kui kiiresti kõik toimub
viljades, sügiseste lehtede rakkudes. 11) Rakumembraan- koosneb valkudest ja fosfolipiididest, reguleerib raku ainevahetust ümbruskonnaga, osaleb erinevate ainete sünteesil. 12)Rakukest- on kõva ja moodustab taimele tugeva toese. Rakukest osaleb ainete neeldumisel ja liikumisel. Rakukesta moodustumisel osalevad Golgi kompleks ja membraanid. Ta koosneb tselluloosist, hemitselluloosidest ja pektiinainetest. 40. Restriktaasid. Restriktaas on endonukleaas, mis tunneb ära lühikesi spetsiifilise DNA- järjestusi ja lõikab DNA- molekuli selles restriktsioonisaidis või selle lähedal katki. Lihtsamalt öeldes on see bakteriaalne kaitsesüsteem kaitsmaks bakterirakke võõraste DNAde eest, tunnevad ära võõra DNA ja lõikavad selle ahela katki. Kloonimise seisukohalt on head tüüp II restrikaasid, mis tunnevad ära kindla
● DNA polümeraas – ensüüm, mis viib reaktsiooni läbi (sünteesib uusi DNA lõike) ● Praimerid – lühikesed DNA lõigud, mis märgistavad huvipakkuva regiooni sellele seondudes ja millest algab uute ahelate süntees ● MgCl2 – Mg2+ ioonid on vajalikud DNA polümeraasi töö jaoks ● Vabad nukleotiidid – ehituskivid uute DNA molekulide sünteesiks ● PCR puhver + vesi – keskkond reaktsiooni läbi viimiseks. 137. Restriktaasid, nende funktsioon bakterites ja nende kasutus DNA analüüsimisel Tegemist on bakteriaalset päritolu ensüümidega, mis on bakterites oluliseks viirusvastaseks kaitsemehhanismiks. Restriktaasid tunnevad ära kindlaid DNA järjestusi ja järjestusega seondumise järel lõikavad DNA ahela katki. Näiteks tunneb tuntumaid sedalaadi ensüüme EcorI DNA ahelas spetsiifiliselt ära järjestuse GAATTC, seondub ning lõikab DNA G ja A nukleotiidide vahelt katki.
annaabi.ee 
