Selles töö toimus uuritava proteaasi aktiivsuse määramine pH=8,4 juures. Antud töös kasutatakse ensüümi substraadina kaseiini. Ensüümireaktsioonil hüdrolüüsumata valk ja peptiidid sadestatakse lahusest trikloroäädikhappega, mis ühtlasi inaktiveerib ensüümi ja peatab edasise hüdrolüüsi. Mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisaldus määratakse spektrofotomeetriga. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped on tänu 280 nm piirkonnas paiknevale neeldumismaksimumile spektrofotomeetriliselt hõlpsasti detekteeritavad. Proteolüütilise aktiivsuse ühikuks on 1 kat. See on ensüümi hulk, mis põhjustab 1 mikromooli peptiidsidemete hüdrolüüsi 1 sekundi vältel 30 °C juures. Töö käik Kõigepealt valmistasin 5 ml uuritavat proteaasi lahust. Selleks kaalusin 0,0049 grammi tahket ensüümipreparaati (Alcolase) ja lahustasin selle boraatpuhvris 5 ml-ni (pH=8,4).
Spektri analüüsimine. · Võrreldame saanud neeldumismaksimumid teatmeteoses leiduvate andmetega erinevate karotenoidide neeldumismaksimumitega. Tegeme järeldus, kas tegu puhas -karoteeniga või karotinoidide seguga. Kvantitatiivne analüüs (karotinoidi sisalduse arvutamine) · Karotinoidi sisaldus uuritavas arvutame antud valemi järgi: Kus: A absorptsiooni väärtus, mis vasatab neeldumismaksimumile(max) - vaadeldava karotinoidi ekstintsioonikoeffitsent sama max juures V ekstrakti kogumaht, ml d- kasutatud ekstrahenti kogutihedus g/cm3 (oktaanil 0,703 g/cm3) g- uurimiseks võetud taimse materjali mass, g 103- tegur milligrammidele üleminekus. Töö tulemused. · Uuritav materjal on punane pipar. m= 1,55g. · Ekstrakti maht(V) = 30ml
hudroluusi. Siinkasutatav aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hudroluusile uuritava proteaasi toimel ja järgnevale TKÄ - ga mittesadenevate hudroluusiproduktide sisalduse spektrofotomeetrilisele määramisele. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped (Tyr, Phe, Trp) on tänu 280 nm piirkonnas paiknevale neeldumismaksimumile spektrofotomeetriliselt hõlpsasti detekteeritavad. Seetõttu avaldatakse valgu hudroluusi produktide sisaldus turosiini mikromoolidena (1 mikro mol = 0,181 mg). Aktiivsus väljendatakse 1 g ensuumi või 1 ml ensuumilahuse kohta (mikro kat/g, mikro kat/ml). 3. Töö käik: 1
0,082 0,056 0,052 0,029 Fraktsioonide analüüs Antud töös väljendatakse aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Lainepikkused, millel mõõtmine läbi viiakse, sõltuvad uuritavate ainesegude koostisest ja need soovitab praktikumi juhendaja. Absorptsiooni mõõdetakse spektrofotomeetritel. Koostage kromatogramm, mille y-teljel on optiline tihedus ja x+teljel eluaadi maht, märkides ära Vminx, Vx ja Vmaxx asukohad. Dekstraansinine müoglobiin DNP-aspartaat Vxmin =21 ml Vx= 33 ml Vxmax= 73ml
0,5 ml automaatpipetiga sisestati kolonni uuritav proov, avati kolonni väljavool ning esialgu väljuvat eluaati koguti väiksesse mõõtsilindrisse. Kui kolonnis liikuv esimene sinine riba oli jõudnud kolonni põhja lähedale, hakati eluaati koguma nummerdatud katseklaasidesse 2 ml kaupa. Fraktsioonide kogumine lõpetati, kui eluaat oli muutunud värvituks. Ainete kontsentratsiooni igas fraktsioonis väljendati lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse kaudu, mida mõõdeti aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel spektrofotomeetriga. Tulemused Kolonni iseloomustavad parameetrid täidise mark ja materjal: dekstraan, Sephadex G-75 täidist iseloomustav pundumistegur: k=0,1 täidise kõrgus ja kolonni sisediameeter: L=17,5 cm ; d=2,6 cm arvutatud täidise kogumaht: arvutatud maksimaalne elueerimismaht: arvutuslik fraktsioonide üldarv: Uuritava segu koostis: dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat Voolutuslahus: 7,5 pH; Tris/HCl 0,1 M NaCl
· kuni kolonni allaossa jõuab dekstraansinine, väljub kolonnist puhas vooluti, mis kogutakse ühendatud fraktsioonina kuiva 100 ml kolbi · ühendatud fraktsioon 16,75 ml · 2ml suuruseid fraktsioone kogutakse, kuni kogu uuritav aine on kolonnist väljunud ja eluaat on värvitu Fraktsiooni analüüsimine Aine kontsentratsioon igas fraktsioonis väljendatakse lahuse absorptsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Absorptsiooni mõõdetakse spektrofotomeetritel. Sinised fraktsioonid mõõdetakse lainepikkusel 670nm, pruunid lainepikkusel 410nm ja kollased lainepikkusel 360nm. Koostatakse katseandmete tabel, mis on aluseks kromatogrammi koostamisele ja töö tulemuste väljatoomisele. Esimesena väljus kolonnist dekstraansinine (molekulmass 2 000 000 Da), mis ei läbinud geeli poore ja väljus minimaalse elueerimismahuga. Teisena väljus müoglobiin (molekulmass
Seejärel võib lisada suurema koguse voolutuslahust. · Kui esimene värviline riba hakkab lähenema kolonni alumisele osale hakatakse eluaati koguma valmispandud katseklasidesse. · Elueerimise võib lõpetada, kui väljuv eluaat on värvitu. Fraktsioonide analüüsimine · Antud töös väljendatakse aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. · Täiesti värvusetute fraktsioonide absorptsiooni väärtused võrduvad 0-ga ja neid fraktsioone pole vaja mõõta. · Koostatakse 3-veeruline katseandmete tabel, mis on aluseks kromatogrammi koostamisele ja töö tulemuste väljatoomisele. Kolonni täidiseks oleva Sephadex'i mark G-75, seda iseloomustav tegur k=0,1 Geelisamba kõrgus L=32,7 cm Diameeter d=1,6 (raadius r=0,8) Vt=r2L=*0,82*32,7=65,75 cm3
451,5 0,4055 477,5 0,3571 -karoteen max 1 max 2 max 3 E% 1cm Heksaan 482 451 425 2650 Karotenoidi sisalduse arvutamine: A absorptsiooni väärtus, mis vastab arvutuse aluseks valitud neeldumismaksimumile max (kõrgeimale ,,tipule" vastav A väärtus), 0,4055 1cm1% vaadeldava karotenoidi ekstinktsioonikoefitsient (1%-lise karotenoidi lahuse absorptsioon) sama max juures, 2650 V ekstrakti kogumaht, ml, 33ml d kasutatud ekstrahendi tihedus, g/cm3, 0,65g/cm3 g uurimiseks võetud taimse materjali mass, g, 0,63g 103 tegur milligrammidele üleminekuks. 9549,15 K = (0,4055× 30× 0,65×103)/(2650×0,63) = 4,74mg % Järeldus:
Reeglina võetakse arvutamisel aluseks selline absorptsiooni väärtus, mis vastab neeldumisspektri kõige kõrgemale ,,tipule". Arvutus põhinebki nimetatud lainepikkusele max vastava A väärtuse ja samal lainepikkusel mõõdetud ekstinktsioonikoefitsiendi väärtuse suhtele. Karotenoidi sisaldus (K, mg%) uuritavas proovis arvutatakse vastavalt valemile: , kus A absorptsiooniväärtus, mis vastab aluseks valitud neeldumismaksimumile max (kõrgeimale ,,tipule" vastav A väärtus E1cm1% - vaadeldava karotenoidi ektstinktsioonikoefitsient (1%-lise karotenoidi lahuse absorptisoon) sama max juures V ekstrakti kogumaht, mL d kasutatud ekstrahendi tihedus, g/cm3 0,704 g uurimiseks võetud taimse materjali mass, g 103 tegur milligrammidele üleminekuks Tulemus 1,24 mg% näitab, et 100 g porru lehes sisaldub 1,24 mg -karoteeni.
väärtusi. Reeglina võetakse arvutamisel aluseks selline absorptsiooni väärtus, mis vastab neeldumisspektri kõige kõrgemale ,,tipule". Arvutus põhinebki nimetatud lainepikkusele max vastava A väärtuse ja samal lainepikkusel mõõdetud ekstinktsioonikoefitsiendi väärtuse suhtele. Karotenoidi sisaldus (K, mg%) uuritavas proovis arvutatakse vastavalt valemile: , kus A absorptsiooniväärtus, mis vastab aluseks valitud neeldumismaksimumile max (kõrgeimale ,,tipule" vastav A väärtus E1cm1% - vaadeldava karotenoidi ektstinktsioonikoefitsient (1%-lise karotenoidi lahuse absorptisoon) sama max juures 3 V ekstrakti kogumaht, mL d kasutatud ekstrahendi tihedus, g/cm 3 g uurimiseks võetud taimse materjali mass, g 103 tegur milligrammidele üleminekuks ehk 2260 g
poleks otstarbekas. Kui esimene värviline riba (sinine) jõuab kolonni põhja lähedale, jätkatakse eluaadi kogumist 2 ml kaupa fraktsioonidena. Oluline on, et kogu katse vältel oleks kolonni täidise kohal piisavalt eluenti ning et eluaati kogutaks täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimise võib lõpetada, kui kõik värviribad on väljunud ja eluaat on värvitu. Aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis väljendatakse lahuse optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Värviliste segude puhul mõõdetakse vaid selliste fraktsioonide absorbtsiooni, milles võib silma järgi värvust täheldada, värvusetute absorbtsiooni väärtused võib lugeda võrdseks nulliga. Nb! Iga aine optilise tiheduse väärtust mõõdetakse ainele iseloomulikul neeldumismaksimumi lainepikkusel max. Sinisele värvile vastas 670 nm, pruunile 410 nm, kollasele 360 nm. KATSEANDMETE TABEL
samal lainepikkusel mõõdetud ekstinktsioonikoefitsiendi väärtuse suhtele. Kuna minu spektri analüüs ei tulnud suure ektrsahendi koguse võtmise tõttu välja, siis kasutan arvutustes ksantofüllile neoksantiin vastavat ekstinktsioonikoefitsenti väärtust ning lainepikkust. Karotenoidi sisaldus (K, mg%) uuritavas proovis arvutatakse vastavalt valemile: , kus A absorptsiooniväärtus, mis vastab aluseks valitud neeldumismaksimumile max (kõrgeimale ,,tipule" vastav A väärtus E1cm1% - vaadeldava karotenoidi ektstinktsioonikoefitsient (1%-lise karotenoidi lahuse absorptisoon) sama max juures V ekstrakti kogumaht, mL d kasutatud ekstrahendi tihedus, g/cm3 0,704 g uurimiseks võetud taimse materjali mass, g 103 tegur milligrammidele üleminekuks Tulemus 2,427 mg% näitab, et 100 g apelsinikoort sisaldab 2,427 mg neoksantiini.
Seejärel võib lisada suurema koguse voolutuslahust. 3. Kui esimene värviline riba hakkab lähenema kolonni alumisele osale hakatakse eluaati koguma valmispandud katseklaasidesse. 4. Elueerimise võib lõpetada, kui väljuv eluaat on värvitu. Fraktsioonide analüüsimine 1. Antud töös väljendatakse aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. 2. Täiesti värvusetute fraktsioonide absorptsiooni väärtused võrduvad 0-ga ja neid fraktsioone pole vaja mõõta. 3. Koostatakse 3-veeruline katseandmete tabel, mis on aluseks kromatogrammi koostamisele ja töö tulemuste väljatoomisele. Kolonni täidiseks oleva Sephadex’i mark – G-75, seda iseloomustav tegur k=0,1 Geelisamba kõrgus L=30,9 cm Diameeter d=1,6 (raadius r=0,8) Vt=πr2L=π*0,82*30,9=62,10 cm3
see poleks otstarbekas. Kui esimene värviline riba (sinine) jõuab kolonni põhja lähedale, jätkatakse eluaadi kogumist 2 ml fraktsioonidena. Oluline on, et kogu katse vältel oleks kolonni täidise kohal piisavalt eluenti ning et eluaati kogutaks täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimise võib lõpetada, kui kõik värviribad on väljunud ja eluaat on värvitu. Aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis väljendatakse lahuse optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Värviliste segude puhul mõõdetakse vaid selliste fraktsioonide absorbtsiooni, milles võib silma järgi värvust täheldada, värvusetute absorbtsiooni väärtused võib lugeda võrdseks nulliga. Iga aine optilise tiheduse väärtust mõõdetakse ainele iseloomulikul neeldumismaksimumi lainepikkusel λmax. Sinisele värvile vastas 670 nm, pruunile 410 nm, kollasele 360 nm. Tulemused Tabel 1. Mõõtmistulemused Esmane fraktsioon 25 ml
Töötasin klassküvettiga. 1. max1: A=0,1526 ABS; = 505 nm lükopeen (E% 1cm) = 3150 2. max2: A= 0,1932 ABS; = 473 nm lükopeen (E% 1cm) = 2250 3. max3: A= 0,1429 ABS; = 448,5 nm luteiin (E% 1cm) = 2480 Tegemist on karotenoidide seguga. Ekstraktis domineerib karoteeni isomeer lükopeen. Karotenoidi sisalduse arvutamine (kvantitatiivne analüüs) K = (A*V*d*103) / (E1%1cm *g) mg% A absorptsiooni väärtus, mis vastab arvutuse aluseks valitud neeldumismaksimumile = 0,1932 ABS E1%1cm vaadeldava karotenoidi ekstinktsioonikoefitsient neeldumismaksimumi juures =3450 V ekstrakti kogumaht = 22,5 ml d kasutatud ekstrahendi tihedus = 0,72 g/cm3 g uurimiseks võetud taimse materjali mass = 0,6g 103 tegur milligrammidele üleminekuks K = (0,1932 * 22,5 * 0,72 * 1000) / (2250 * 0,6) = 2,3184 mg% Kirjanduse alusel sisaldab tomat 7,85 mg% lükopeeni. Minu tulemus oluliselt erineb, töö ei õnnestunud väga hästi.
Kirjanduse alusel leidsin beeta-karoteeni neeldumisspektrid: 425, 451, 482, selest saan järeldada, et domeneerivad beta-karotenoidid. Beeta-karoteeni sisalduse uuritavas proovis arvutan vastavalt valemile: A * V * d * 103 K=------------------------------ mg% E1%1cm * g Kus A absorptsiooni väärtus, mis vastab arvutuse aluseks valitud neeldumismaksimumile max (kõrgeimale ,,tipule" vastav A väärtus), 1cm1% vaadeldava karotenoidi ekstinktsioonikoefitsient (1%-lise karotenoidi lahuse absorptsioon) sama max juures, V ekstrakti kogumaht, ml, d kasutatud ekstrahendi tihedus, g/cm3, g uurimiseks võetud taimse materjali mass, g, 103 tegur milligrammidele üleminekuks. 1,334 *18,5 * 0,69 * 103 K=------------------------------=18,9 mg%
Siis kanti geeli pinnale suurem kogus voolutuslahust. Ja lisati seda pidevalt vastavalt vajadusele Kui esimene värviline riba (dekstraansinine) lähenes kolvi põhjale, siis eemaldati kolb ja alustati eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena. Ühendatud fraktsioonis olev eluaat on osa dekstraansinise elueerimismahust, seega tuli see ära mõõta. Elueerimine lõpeteti kui väljus viimane värviline komponent ja eluaat muutus värvituks. Fraktsioone analüüsiti spektromeetritel neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel, milles järeldub lahuse optiline tihedus. Täiesti värvusetute fraktsioonide optilise tiheduse väärtused võrduvad 0-ga ja neid fraktsioone polnud vaja mõõta. Tulemused esitati kromatogrammina. TULEMUSED JA NENDE INTERPRETATSIOON Täidise mark SEFADEX G-75 Pundumistegur k 0,1 Täidise kõrgus L 31,5 cm Kolonni sisediameeter d 1,8
· kui dekstraansinine on jõudnud kolonni alaossa, eemaldatakse kolb ja hakatakse katseklaasidesse koguma fraktsioone 2 ml kaupa · elueerimise võib lõpetada, kui eluaat on muutunud värvituks Fraktsioonide analüüsimine: · aine kontsentratsiooni väljendatakse igas fraktsioonis lahuse absorptsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel · absorptsiooni mõõdetakse spektrofotomeetril · värviliste segude puhu mõõdetakse vaid selliste fraktsioonide absorptsiooni, milles võib täheldada vähimatki värvust · koostatakse 3-veeruline katseandmete tabel, mille alusel tehakse kromatogramm 3. Tulemused A. kolonni iseloomustavad parameetrid Täidise materjal ja mark: Dekstraan, Sephadex G-75 Pundumistegur: k = 0,1
alustatakse eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena. Kogu voolutuse käigus tuleb jälgida, et kolonni täidise kohal oleks piisavalt eluenti ja seda vastavalt vajadusele lisada ning vahetada õigeaegselt katseklaase, et eluaat saaks kogutud täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimine lõpetatakse kui väljub viimane värviline komponent ja eluaat muutus värvituks. Fraktsioone analüüsiti spektrofotomeetritel neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel, milles järeldub lahuse optiline tihedus. Tulemuste põhjal koostati kromatogramm. Tulemused ja nende analüüs Täidise mark: SEPHADEX G-75 Pundumistegur k = 0,1 Täidise kõrgus L = 32,5 cm Kolonni diameeter d = 2,1 cm r =1,05 Täidise kogumaht: Vt= ·r2·L = 3,14 · 1.052 · 32,5 = 112,5 cm3 Geelmaatriksi maht: Vg= 0,1 · 112,5 = 11,25 cm3 Maksimaalne elueerimismaht: Vxmax = 112,5 11,25 = 101,26 cm3 Fraktsioonide üldarv: n=101,26 : 2 = 50, 63 51 Uuritav segu:
ekstrakt muutus värvusetuks. Ekstrakti uuriti spektrofotomeetril, võttes lainepikkuste vahemikuks 350-650 nm. Tulemused Neeldumismaksimumid: 1. 364 nm ; D=0,271 A 2. 443,5 nm ; D=0,582 A 3. 468 nm ; D=0,749 A 4. 499 nm ; D=0,603 A Kirjanduse alusel domineerib karotenoididest lükopeen (505, 472, 446) Karotenoidi sisaldus (K, mg%) uuritavas proovis arvutatakse vastavalt valemile: A absorptsiooni väärtus, mis vastab arvutuse aluseks valitud neeldumismaksimumile max 2 E1cm 1% - 1% lükopeeni lahuse ekstinktsioonikoefitsient lainepikkusel 472 nm V ekstrakti kogumaht, ml d kasutatud ekstrahendi tihedus, g/cm3 g uurimiseks võetud taimse materjali mass, g 103 tegur milligrammidele üleminekuks Katse tulemus näitab, et tomatis sisaldub karotenoididest kõige enam lükopeeni. Kirjanduse andmetel sisaldab 1 g tomatit ~0,026 mg lükopeeni. Katse tulemus annab sisalduseks ~0,012 mg.
fraktsioonina (16,75 ml). Seda kogusin sinnamaani, kuni nägin kolonnis, et dekstraansinine hakkas jõudma üpris kolonni alaossa. Seejärel hakkasin koguma fraktsioone 2 ml kaupa. Lisasin pidevalt juurde eluenti, milleks oli 0,15 M NaCl. Eluaadi kogumise lõpetasin, kui see oli muutunud värvusetuks. Fraktsioonide analüüsimine Ainete kontsentratsiooni antud töös väljendatakse igas fraktsioonis lahuse optilise tiheduse väärtusena, mida mõõtsin aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Lainepikkused sõltuvad uuritava ainesegu koostisest: dekstraansinine- 670 nm, aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped (türosiin Tyr, fenüülalaniin Phe, trüptofaan Trp) - 280 nm ja DNP-aspartaat- 360 nm. Katseandmete tabel Fraktsiooni nr Elueerumismaht ml Optiline tihedus, A Ühendatud fraktsioon 16,75 0 1 18,75 0,0961
· Kui see lähenes kolonni põhjale, siis eemaldasin kolonni alt kolbi ühendatud fraktsiooniga ja jätkasin eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena kaliibritd ja eelnevalt nummerdatud katseklaasidesse. · Elueerimise lõpetasin, kui eluaat muutub värvituks. Fraktsioonide analüüsimine. · Aine kontsentratsiooni väljendasin igas fraktsioonis lahuse optilise tiheduse väärtusena, mida mõõtsin aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. · Absorptsiooni mõõdsin spektrofotomeetril. Katseandmete tabel. Lainepikkus, nm Fraktsiooni nr Elueerimismaht V, ml Optiline tihedus, A Ühendatud 29,0 0 fraktsioon 1 31,0 0,003 2 33,0 0,026
Kui esimene värviline riba ( dekstraansinine ) läheneb kolonni põhjale, siis eemaldab kolonni alt kolvi ühendatud fraktsiooniga ja hakkan koguma eluaati 2ml kaupa katseklaasidesse. Mõõdan ühendatud fraktsiooni mahu: 22 ml . 1.6 Fraktsioonide analüüsimine Aine kontsentratsiooni väljendatakse igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Lainepikkused, millel mõõtmine toimus, sõltuvad uuritavate ainesegude koostisest. Absorbtsiooni mõõtsin spektrofotomeetritel. 1.7 Tulemused ja nende interpreteerimine A. Kolonni iseloomustavad parameetrid Täidise mark: Sephadex'i mark: G-75 Täidist iseloomustav pundumistegur: k = 0,1 Täidise kõrgus ja kolonni sisediameeter: L = 17,6 cm d = 3 cm mõõtmisviga d = 2,5 cm Arvutatud täidise kogumaht Vt.
504,0 0,2241 Käsiraamatust: Lükopeen (446; 472; 506) nm E%1cm = 3450 Kapsantiin (504; 475; 462) nm E%1cm = 1905 Karotenoidi sisalduse arvutamine (kvantitatiivne analüüs) Karotenoidi sisaldus (K, mg %) uuritavas proovis arvutatakse vastavalt siintoodud valemile: A V d 103 K= mg , E11 cm g kus A - absorptsiooni väärtus, mis vastab arvutuse aluseks valitud neeldumismaksimumile max (kõrgeimale ,,tipule" vastav A väärtus), E1cm1% - vaadeldava karotenoidi ekstinktsioonikoefitsient (1%-lise karotenoidi lahuse absorptsioon) sama max juures, V - ekstrakti kogumaht, ml, d - kasutatud ekstrahendi tihedus, g/cm3, g - uurimiseks võetud taimse materjali mass, g, 103 - tegur milligrammidele üleminekuks. Lükopeen: 3 0,5487 15,5 0,72 10 K= = 2,86 mg 3450 0,62 Kepsantiin:
ning ka eluaadi summaarne maht oli enam-vähem võrdne arvutatud kogumahuga Vt. Samuti vastas kogutud fraktsioonide üldarv varem väljaarvutatule, kui võtsin arvessse seejuures ka kolbi kogutud ühendatud fraktsiooni mahtu. Ühendatud fraktsiooni mahuks oli: 26 mL Fraktsioonide analüüsimine Antud töös väljendatakse aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorptsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Iga segus sisalduva aine optilise tiheduse väärtust mõõtsin ainele iseloomulikul neeldumismaksimumi lainepikkusel max. Spektrofotomeetri reguleerisin järgmisele aine üleminekul vastavale lainepikkusele. Mõõtsin lainepikkustel 670 nm, 410 nm ja 360 nm (vastavalt sinine dekstraansinine, pruun müoglobiin ja kollane DNP-aspartaat). Absorptsiooni mõõtsin spektrofotomeetril. Andmetest koostasin tabeli, mille alusel joonestasin kromatogrammi Excelis.
1. 445,5 nm 0,478 A 2. 471,5 nm 0,669 A 3. 502 nm 0,561 A Neeldumisspektrid: Leitud neeldumisspektrid sarnasesid enim lükopeeni neeldumisspektritega, millised teatmeteoses olid järgmised: 446, 474 ja 506 nm. Karotenoidi sisalduse arvutamine (kvantitatiivne analüüs) Karotenoidi sisaldus (K, mg%) uuritavas proovis arvutatakse vastavalt valemile: A - absorptsiooni väärtus, mis vastab neeldumismaksimumile (kõrgeima tipu) - vaadeldava karotenoidi ekstinktsioonikoefitsient V - ekstrakti kogumaht, ml d - kasutatud ekstrahendi tihedus, g/cm3 g - uurimiseks võetud taimse materjali mass, g 103 - tegur milligrammidele üleminekuks Minu andmed: A = 0,669 = 3450 V = 10,5 ml d = 0,69 g/cm3 g = 0,65 g 3. Tulemused Tomat sisaldab karotenoididest kõige enam lükopeeni ning see selgus ka minu katsest. Kirjanduse alusel sisaldab tomat umbes 8,8-42 mg/g ehk 0,88-4,2 mg% lükopeeni. Minu
Kogu voolutamise vältel jälgisin, et kolonni täidise kohal oli piisavalt eluenti, vajadusel lisasin ja et vahetaksin õigel ajal katseklaase täpse 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimise lõpetasin, kui silma järgi polnud enam lahuses näha kollast värvust. Fraktsioonide analüüsimine Selles töös väljendame aine kontsentratsiooni igas lahuses selle optilise tiheduse väärtusena. Optilist tihedust mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel, spektrofotomeeriga elektromagnetilise kiirguse visuaalses piirkonnas. Siniseid fraktsioone mõõtsin lainepikkusel 670 nm, pruune lainepikkusel 410 nm ja kollaseid lainepikkusel 360 nm. Tulemused ja nende interpreteerimine A. Kasutatud kolonni iseloomustavad parameetrid: ·Täidise materjal: Dekstraan ·Täidise mark: Sephadex G75 ·Täidist iseloomustav pundumistegur k=0.1 ·Täidise kõrgus: 28cm ·Kolonni sisediameeter:2.2 cm
vastavalt vajadusele juurde. Samuti vahetasin õigeaegselt katseklaase, et eluaat saaks kogutud täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimise lõpetamise üle otsustasin eluaadi summaarse mahu järgi, mis ei tohi olla väiksem kui kolonni kogumaht Vt. Fraktsioonide analüüsimine Et väljendada aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõtsin aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Absorbtsiooni mõõtsin spektromeetril. Mõõtmist alustasin kui olin saanud praktikumi juhendajalt loa. Lahuste absorbtsiooni (optilist tihedust) mõõtsin elektromagnetilise kiirguse visuaalses (VIS) piirkonnas. Mõõtsin vaid selliste fraktsioonide absorbtsiooni, milles võis silma järgi täheldada vähimatki värvust. Koostasin 3-veerulise katseandmete tabeli. Mõõtmistulemused kandisn tabelisse, fikseerides
proovide korral). Sain koguda 26 katseklaasi 2ml-ga eluendiga. Ka mõtsin vooluti osa (nn ühendatud fraktsiooni) maht 23 cm3 Kogutavate fraktsioonide üldarv peab vastama varem väljaarvutatule, võttes seejuures arvesse ka kolbi kogutud ühendatud fraktsiooni mahtu Fraktsioonide analüüsimine Antud töös väljendasin aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõtsin aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Lainepikkused sõltuvad uuritavate ainesegude koostisest. Absorptsiooni mõõtsin spektrofotomeetritel. Ning alustasin mõõtmisest lainepikkusega 670nm. Esiteks mõõtsin kolbide optilist tihedust sinise värvusega, ehk dekstraansinisega. Ning kui adsorbtsiooni näitaja jäi võrdseks nulliga, siis reguleerisin spektrofotomeetri nii, et lainepikkus saaks võrdseks 410nm-ga. Kui adsorbtsiooni
-karoteen max 1 max 2 max 3 E% 1cm Heksaan 475 445 420 2735 Kuna neeldumismaksimumid on üsna sarnased, saame teha järelduse, et tegemist on karotenoidide seguga, kus domineerib -karoteen. Karotenoidi sisalduse arvutamine: A absorptsiooni väärtus, mis vastab arvutuse aluseks valitud neeldumismaksimumile max (kõrgeimale ,,tipule" vastav A väärtus), A=0,1036 1cm1% vaadeldava karotenoidi ekstinktsioonikoefitsient (1%-lise karotenoidi lahuse absorptsioon) sama max juures, 1cm1%=2735 V ekstrakti kogumaht, ml, V=9ml d kasutatud ekstrahendi tihedus, g/cm3, d=0,65g/cm3 g uurimiseks võetud taimse materjali mass, g, g=0,04g 103 tegur milligrammidele üleminekuks. Järeldus: Antud töö eesmärgiks oli peterselli karotenoidse sisalduse määramine: -
tihedused (teoreetiliselt peaks kolm erinevat neeldumisspektrit olema ja kolm erinevat optilist tihedust). 4. Välja trükkida neeldumisspekter ja analüüsida. Karotenoidi sisalduse arvutamine (kvantitatiivne analüüs) Uuritavad lahuses oleva karoteeni isomeeri sisalduse määramist saab ära arvutada kasutades järgnevat valemit: K = (A * V * d * 103) / (E1cm1% * g) kus, A absorptiooni väärus, mis vastab arvutuse aluseks valitud neeldumismaksimumile. E1cm1% - vaadeldava karotenoidi ekstinktsioonikoefitsient. V- ekstrakti kogumaht d kasutatud ekstrahendi tihedus, g/cm3 g uurimiseks võetud taimse materjali mass, g. 103 tegur milligramidele üleminekuks. Arvutatud tulemust võrrelda teoreetilise tulemusega ja analüüsida töö õnnestumust. Andmed m(porgand) = 0,51 g V(ekstrakt) = 28 ml 4
lainepikkusel mõõdetud ekstinktsioonikoefitsiendi väärtuse suhtele. Valemi jaoks tuleb teatmekirjandusest leida uuritavas lahuses domineeriva karotenoidi 1% 1cm väärtus. Karotenoidi sisaldus (K, mg %) uuritavas proovis arvutatakse valemiga: A * V * d * 103 K=------------------------------ mg% E1%1cm * g A absorptsiooni väärtus, mis vastab arvutuse aluseks valitud neeldumismaksimumile max (kõrgeimale ,,tipule" vastav A väärtus), 1cm vaadeldava karotenoidi ekstinktsioonikoefitsient (1%-lise karotenoidi lahuse 1% absorptsioon) sama max juures, V ekstrakti kogumaht, ml, d kasutatud ekstrahendi tihedus, g/cm 3, g uurimiseks võetud taimse materjali mass, g, 103 tegur milligrammidele üleminekuks. (Ma ausõna tegin kõik asjad nii nagu teised ja ma ei tea, mis mul viltu läks.) Paprikat kaalusin 22.9 mg. Lisasin väikse koguse liiva ja peenestasin uhmris
0,5117 450,0 Enda katses saadud tulemusi laborimaterjalidega võrreldes, sain tulemuseks, et minu proov sisaldas enim lükopeeni. Karotenoidi sisalduse arvutamine (kvantitatiivne analüüs): Laborimaterjalidest leidsin, et lükopeeni ekstinktsioonikoefitsient on . Karotenoidi sisaldus uuritavas proovis arvutatakse vastavalt järgmisele valemile: Kus: absorptsiooni väärtus, mis vastab arvutuse aluseks valitud neeldumismaksimumile (kõrgemaile ,,tipule" vastav A väärtus) vaadeldava karotenoidi ekstinktsioonikoefitsient (1%-lise karotenoidi lahuse absorptsioon) sama juures ekstrakti kogumaht, kasutatud ekstrahendi tihedus, uurimiseks võetud taimse materjali mass, tegur milligrammidele üleminekuks 0,309 ABS 3450 ABS
kiht. 7. Kui kolonnis esimene värviline riba (dekstraansinine) läheneb kolonni põhjale, siis jätkan eluaadi kogumist 2 ml fraktsioonidena kaliibritud katseklaasidesse, kuni eluaat muutub värvituks ning kogu uuritav proov on läbinud kolonni. FRAKTSIOONIDE ANALÜÜSIMINE Antud töös kasutatakse fraktsioonide analüüsimisel spektrofotomeetrit. Sellega mõõdetakse aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Uuritavatele ainete iseloomulikud neeldumismaksimumid on: - Dekstraansinine 670 nm - müoglobiin 410 nm - DNP-aspartaat 360 nm 1. Mõõdan puhta eluendi (eeljooksu) mahu, mille kogusin üheks suureks fraktsiooniks V = 21,5 ml Katsetulemused: Lainepikkus (nm) Fraktsiooni nr. Elueerumismaht Optiline tihedus, V, ml A
Karotenoidide neeldumisspekter mõõdetakse lainepikkuste vahemikus 350- 650 nm, kasutades võrdluslahusena puhast lahustit (ekstrahenti). Tulemused: Neeldumisspektri maksimumid: 447,5 nm D=0,6426 473,0 nm D=0,8838 505,0 nm D=0,7256 E1cm1%=3450 V = 8,2 ml Kirjanduse alusel domineerib tomatites lükopeen maksimumidega 446, 474, 506 d = 0,704 g/cm3 Karotenoidi sisalduse arvutamine (kvantitatiivne analüüs) Kus A absorbtsiooni väärtus, mis vastab arvutuse aluseks valitud neeldumismaksimumile max (kõrgeimale ,,tipule"vastav A väärtus) E1cm1% - vaadeldava karotenoidi ekstinktsioonikoefitsent (1%-lise karotenoidi lahuse absorbtsioon) sama max juures V ekstrakti kogumaht, ml d kasutatud ekstrahendi tihedus, g/cm3 g uurimiseks võetud taimse materjali mass, g 103 tegur milligrammidele üleminekuks Tomatis sisaldub 1,422 mg lükopeeni 100 g tomati kohta. Kirjanduse alusel sisaldab värske tomat 2,573-3,025 mg lükopeeni.
Sain koguda 26 katseklaasi 2ml-ga eluendiga. Ka mõtsin vooluti maht st Vv = 23 cm3. NB! See ei ole kolonni vaba maht, vaid nn ühendatud fraktsioon, mis moodustab vaid osa Vv- st! Kogutavate fraktsioonide üldarv peab vastama varem väljaarvutatule, võttes seejuures arvesse ka kolbi kogutud ühendatud fraktsiooni mahtu Fraktsioonide analüüsimine Antud töös väljendasin aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõtsin aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Lainepikkused sõltuvad uuritavate ainesegude koostisest. Absorptsiooni mõõtsin spektrofotomeetritel. Ning alustasin mõõtmisest lainepikkusega 670nm. Esiteks mõõtsin kolbide optilist tihedust sinise värvusega, ehk dekstraansinisega. Ning kui adsorbtsiooni näitaja jäi võrdseks nulliga, siis reguleerisin spektrofotomeetri nii, et lainepikkus saaks võrdseks 410nm-ga. Kui adsorbtsiooni
Järeldus: männiokastes leidub suurel määral -karoteeni. Heptaanis: Karotenoid max E%1cm -karoteen 450 2380 KAROTENOIDIDE SISALDUSE ARVUTAMINE (KVANTITATIIVNE ANALÜÜS): kus A - absorptsiooni väärtus, mis vastab arvutuse aluseks valitud neeldumismaksimumile max (kõrgeimale ,,tipule" vastav A väärtus) - vaadeldava karotenoidi ekstinktsioonikoefitsent (1%-lise karotenoidi lahuse absorptisoon) sama max juures V ekstrakti kogumaht, ml d kasutataud ekstrahendi tihedus, g/cm3 g uurimiseks võetud taimse materjali mass, g 103- tegur milligrammidele üleminekuks Kokkuvõte Erinevate internetiallikate põhjal selgub, et männiokastes võib sõltuvalt männi asukohast,
ekstinktsioonikoefitsiendi väärtuse suhtele. Teatmekirjandused leiduvad andmed väga paljude karotenoidide ekstinktsioonikoefitsientide väärtuste kohta: 1 %-liste lahuste absorptsiooni väärtuste kohta. Seega tueb kirjandusest leida uuritavas lahuses domineerivaima karotenoidi ekstinktsioonikoefitsiendi väärtus ja kasutada seda arvutusvalemis: A absorptsiooni väärtus, mis vastab arvutuse aluseks valitud neeldumismaksimumile E1cm1% - vaadeldava karotenoidi ekstinktsioonikoefitsient V ekstrakti kogumaht ml d kasutatud ekstrahendi tihedus g uurimiseks võetud taimse materjali mass 1000 tegur milligrammidele üleminekuks Kuna minul katse ebaõnnestus ning neeldumisspektrit ei olnud võimalik võtta, otsisin kirjanduseest infot paprikas ja tema sugulastes sisalduvate karotenoidide kohta. Karotenoidid paprikas ja tema sugulastes
8. Mida mõistetakse neelduvuse ehk optilise tiheduse (A ehk D) all? Spektroskoopia meetodeid, mis baseeruvad elektromagnetilise kiirguse neeldumisele ehk absorptsioonile uuritavas aines tuntakse absorptsioonspektroskoopia nime all. Mõõdetavaks parameetriks on absorptsioonspektroskoopia puhul aines absorbeerunud energia intensiivsus (= tugevus). (Väljendatakse aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse) absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Lainepikkused, millel mõõtmine läbi viiakse, sõltuvad uuritavate ainesegude koostisest 9. Millistest teguritest sõltub teatava lainepikkuse juures mõõdetud optilise tiheduse väärtus (avaldis vastavalt Beer'i seadusele)? Absorptsioonspektroskoopia baseerub Lambert'i ja Beer'i seadustele, mida kirjeldavate võrrandite kombineerimisel on saadud järgmine võrrand: I = Io 10 - c l , kus I proovi läbinud valguse intensiivsus,
proovide korral) või eluaadi summaarse mahu järgi, mis ei tohi olla väiksem kui kolonni kogumaht Vt. Kogutavate fraktsioonide üldarv peab vastama varem väljaarvutatule, võttes seejuures arvesse ka kolbi kogutud ühendatud fraktsiooni mahtu. Fraktsioonide analüüsimine Antud töös väljendatakse aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Lainepikkused, millel mõõtmine läbi viiakse, sõltuvad uuritavate ainesegude koostisest ja need soovitab praktikumi juhendaja. Absorptsiooni mõõdetakse spektrofoto- meetritel, millega töötamiseks tuleb eelnevalt tutvuda meetodi üldpõhimõttega (vt osa Spektrofotomeetria) ja seejärel seadme tööjuhendiga. Mõõtmist alustatakse, kui on saadud praktikumi juhendajalt luba.
annaabi.ee 
