Karotenoidide identifitseerimine ja määramine (0)

2.2 Karotenoidide identifitseerimine ja määramine
Üliõpilane: Silvia Laiv 112429KATB41
Juhendaja : Kaia Kukk
Töö teoreetilised alused
Karotenoidid on fotosünteesi abipigmendid ja neid leidub taimerakkude kloroplastides ja kromoplastides ning ka mõningates fotosünteesivates organismides ( vetikad , mõned seened ja bakterid ). Karotenoidid absorbeerivad valgust klorofüllist erinevatel lainepikkustel, seega on nad täiendavateks kiirguse retseptoriteks.
Karotenoide on üle 600 ja keemilise ehituse poolest klassifitseeritakse neid kui tetraterpenoide. Struktuurilt on karotenoidid polüeensed ahelad, milles ühes või mõlemas otsas on tavaliselt 6-liikmelised ionoontsüklid. Kõige pikema ahelaga karotenoid on lükopeen.
Karotenoidid jagunevad karoteenideks ja ksantofüllideks. Karoteenid on hapnikku mittesisaldavad molekulid (nt karoteeni α-, β-, γ-, δ-, ζ- jt isomeerid , lükopeen), ksantofüllid sisaldavad lisaks süsinikule ja vesinikule ka hapnikku (nt luteiin, zeaksantiin jt).
Lisaks valguse absorbeerimisele ja klorofülli edastamisele, täidavad karotenoidid taimedes ka kaistvat rolli. Nad neelavad liigset valgusenergiat ja kaitsevad rakke fotokahjustuste ja vabade hapnikuradikaalide eest.
α-, β- ja γ- karoteen ning β-krüptoksantiin on loomsetele organismidele vitamiin A eelühendiks. Karotenoidide muutumine retinaaliks toimub soole mikrofloora poolt toodetava karoteeni oksügenaasi toimel. Lisaks retinaalile omavad vitamiin A-aktiivsust ka retinool, retineenhape ja retinooli estrid .
Loomsed organismid ei sünteesi ise karotenoide ja peavad saama neid toiduga. Karotenoidid peavad vabanema taimerakkudest ning konjugeeruma sapphappega, et nad saaks imenduda.
Kõige suurema tähtsusega isomeer on β-karoteen, mis esineb looduslikest objektidest isoleerituna punakas-oranžide kristallidena. See isomeer ei lahustu vees ja vesilahustes ning ka etanoolis on ta lahustuvus piiratud. Samas lahustub β-karoteen hästi apolaarsetes orgaanilistes lahustites , millised on alifaatsed ja tsüklilised süsivesinikud ja nende segud . Optilist aktiivsust β-karoteen ei oma.
Karotenoidide värvus varieerub kollasest üle oranži kuni tumepunaseni. Mida rohkem karotenoid neelab valgust spektri nähtava osa lühematel lainepikkustel ja peegeldab pikematel lainepikkustel, seda intensiivsem on tema punane värvus. Karotenoidide molekulide ehitust iseloomustab polüeensus ja sellest tuleneb ka karotenoidide võime neelata valgust spektri nähtavas osas (400-700 nm).
Neeldumisspektri järgi saab uuritava materjali karotenoidide sisaldust ja koostist iseloomustada. Neeldumisspekter kujutab endast absorptsiooni (A) ehk optilise tiheduse (D,OD) sõltuvustuuritavat lahust läbiva valguse lainepikkusest λ.
Töö eesmärk
Karotenoidide eraldamine taimsetest materjalidest , saadud karotenoidide segu neeldumisspektri määramine spektrofotomeetril ja selle alusel:

uuritava materjali karotenoidse koostise analüüsimine ja iseloomustamine ,

uuritavas objektis domineeriva karotenoidi, β-karoteeni või mõne teise, kontsentratsiooni kindlaksmääramine,

klorofülli olemasolu kindlakstegemine
Katse käik
Karotenoidide isoleerimine taimsest materjalist
Kaalusin kaalukausis tehnilistel kaaludel prooviks 1,97g porru lehte. Viisin proovi uhmrisse, lisasin väikese koguse pestud liiva ja hõõrusin uhmrinuiaga kuni sain ühtlase massi. Seejärel lisasin väikeste portsjonite kaupa NaHSO4 , et siduda porrus sisalduvat vett. Jätkasin hõõrumist ja soola lisamist kuni oli moodustunud kuiv ja pulbriline mass.
Karotenoidide ekstraktsiooniks võtsin 50 ml mõõtesilindri ja asetasin sellele lehtri ning lehtrisse filterpaberi. Seejärel lisasin peenestatud massile uhmris ektrahenti, milleks oli oktaan . Lisasin nii palju, et segu uhmris oli kaetud. Segasin segu uhmrinuiaga läbi, jälgides, et ka uhmri külgedelt saaks kogu materjal uhmrisse pestud. Ootasin massi settimist, et alustada dekanteerimist. Selle viisin läbi väikese lusikaga, tõstes sademe kohal olevat lahust filtrile nii, et sadet ennast filtrile ei satuks . Tegin filtreerimist mitu korda. Minul tuli ekstrakti mõõtesilindrisse 46 ml (ekstrakti kogumaht ).
Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs
Karotenoidide neeldumisspekter mõõtsin vahemikus 350-650 nm ning võrdluslahusena kasutasin puhast ektrahenti, milleks oli minu katse puhul oktaan. Töötasin klaasküvettidega.
Pärast masina töövalmis sättimist joonistus spektrofotomeetri ekraanile uuritava lahuse neeldumisspekter, millel kursori nihutamisega sain kindlaks määrata need lainepikkused, kus paiknesid iseloomulikud neeldumismaksimumid (λmax) ja maksimumidele vastavad absoptsiooni (A) e optilise tiheduse (D) täpsed väärtused. Trükkisin neeldumisspektri välja. Pilt 1. Neeldumisspekter
Lainepikkus λmax
(nm)
Absorptsioon A
1
426
0, 1508
2
450
0,2000
3
476
0, 1755
Võrdlesin uuritava lahuse neeldumisspektril esinevaid neeldumismaksimumide asukohti teatmeteostes leiduvate andmetega erinevate karotenoidide neeldumismaksimumide paiknemise kohta . Selgus, et antud tulemused on väga sarnased β-karoteeni omadele (425; 451; 482
Karotenoidi sisalduse arvutamine (kvantitatiivne analüüs)
Karotenoidi sisalduse arvutamiseks kasutatakse neeldumisspektri analüüsimisel saadud andmeid ehk neeldumismaksimumidele λmax vastavaid absorptisooni (A) väärtusi. Reeglina võetakse arvutamisel aluseks selline absorptsiooni väärtus, mis vastab neeldumisspektri kõige kõrgemale „tipule“. Arvutus põhinebki nimetatud lainepikkusele λmax vastava A väärtuse ja samal lainepikkusel mõõdetud ekstinktsioonikoefitsiendi väärtuse suhtele.
Karotenoidi sisaldus (K, mg%) uuritavas proovis arvutatakse vastavalt valemile:
, kus
A – absorptsiooniväärtus, mis vastab aluseks valitud neeldumismaksimumile λmax (kõrgeimale „tipule“ vastav A väärtus
E1cm1% - vaadeldava karotenoidi ektstinktsioonikoefitsient (1%-lise karotenoidi lahuse absorptisoon) sama λmax juures
V – ekstrakti kogumaht, mL
d – kasutatud ekstrahendi tihedus, g/cm3 0,704
g – uurimiseks võetud taimse materjali mass, g
103 – tegur milligrammidele üleminekuks
Tulemus 1,24 mg% näitab, et 100 g porru lehes sisaldub 1,24 mg β-karoteeni.