Biokeemia protokoll 2.2 (0)

Töö teoreetilised alused

Karotenoidid on fotosünteesi abipigmendid ja neid leidub taimerakkude kloroplastides ja kromoplastides ning ka mõningates fotosünteesivates organismides ( vetikad , mõned seened ja bakterid ). Karotenoidid absorbeerivad valgust klorofüllist erinevatel lainepikkustel, seega on nad täiendavateks kiirguse retseptoriteks.
Karotenoide on üle 600 ja keemilise ehituse poolest klassifitseeritakse neid kui tetraterpenoide. Struktuurilt on karotenoidid polüeensed ahelad, milles ühes või mõlemas otsas on tavaliselt 6-liikmelised ionoontsüklid. Kõige pikema ahelaga karotenoid on lükopeen.
Karotenoidid jagunevad

• Karoteenideks.( Karoteenid on hapnikku mittesisaldavad molekulid (nt karoteeni α-, β-, γ-, δ-, ζ- jt isomeerid , lükopeen)
  
• Ksantofüllideks. (Ksantofüllid sisaldavad lisaks süsinikule ja vesinikule ka hapnikku (nt luteiin, zeaksantiin jt).
  

Lisaks valguse absorbeerimisele ja klorofülli edastamisele, täidavad karotenoidid taimedes ka kaistvat rolli. Nad neelavad liigset valgusenergiat ja kaitsevad rakke fotokahjustuste ja vabade hapnikuradikaalide eest.
α-, β- ja γ- karoteen ning β-krüptoksantiin on loomsetele organismidele vitamiin A eelühendiks. Karotenoidide muutumine retinaaliks toimub soole mikrofloora poolt toodetava karoteeni oksügenaasi toimel. Lisaks retinaalile omavad vitamiin A-aktiivsust ka retinool, retineenhape ja retinooli estrid .
Loomsed organismid ei sünteesi ise karotenoide ja peavad saama neid toiduga. Karotenoidid peavad vabanema taimerakkudest ning konjugeeruma sapphappega, et nad saaks imenduda.
Kõige suurema tähtsusega isomeer on β-karoteen, mis esineb looduslikest objektidest isoleerituna punakas-oranžide kristallidena. See isomeer ei lahustu vees ja vesilahustes ning ka etanoolis on ta lahustuvus piiratud. Samas lahustub β-karoteen hästi apolaarsetes orgaanilistes lahustites , millised on alifaatsed ja tsüklilised süsivesinikud ja nende segud . Optilist aktiivsust β-karoteen ei oma.
Karotenoidide värvus varieerub kollasest üle oranži kuni tumepunaseni. Mida rohkem karotenoid neelab valgust spektri nähtava osa lühematel lainepikkustel ja peegeldab pikematel lainepikkustel, seda intensiivsem on tema punane värvus. Karotenoidide molekulide ehitust iseloomustab polüeensus ja sellest tuleneb ka karotenoidide võime neelata valgust spektri nähtavas osas (400-700 nm).
Neeldumisspektri järgi saab uuritava materjali karotenoidide sisaldust ja koostist iseloomustada. Neeldumisspekter kujutab endast absorptsiooni (A) ehk optilise tiheduse (D,OD) sõltuvustuuritavat lahust läbiva valguse lainepikkusest λ.

Töö eesmärk

Karotenoidide eraldamine taimsetest materjalidest, saadud karotenoidide segu neeldumisspektri määramine spektrofotomeetril ja selle alusel:

uuritava materjali karotenoidse koostise analüüsimine ja iseloomustamine ,

uuritavas objektis domineeriva karotenoidi, β-karoteeni või mõne teise, kontsentratsiooni kindlaksmääramine,

klorofülli olemasolu kindlakstegemine

Katse käik

Karotenoidide isoleerimine taimsest materjalist

• Kaalusin kaalukausis tehnilistel kaaludel prooviks 0,51 g porgandit .
  
• Viisin proovi uhmrisse, lisasin väikese koguse pestud liiva ja hõõrusin uhmrinuiaga kuni sain ühtlase massi. Seejärel lisasin väikeste portsjonite kaupa NaHSO4 , et siduda porgandis sisalduvat vett. Jätkasin hõõrumist ja soola lisamist kuni oli moodustunud kuiv ja pulbriline mass.
  
• Karotenoidide ekstraktsiooniks võtsin 40 ml mõõtesilindri ja asetasin sellele lehtri ning lehtrisse filterpaberi.
  
• Seejärel lisasin peenestatud massile uhmris ektrahenti, milleks oli heptaan . Lisasin nii palju, et segu uhmris oli kaetud. Segasin segu uhmrinuiaga läbi, jälgides, et ka uhmri külgedelt saaks kogu materjal uhmrisse pestud. Ootasin massi settimist, et alustada dekanteerimist. Selle viisin läbi väikese lusikaga, tõstes sademe kohal olevat lahust filtrile nii, et sadet ennast filtrile ei satuks.
  
• Korduvektraktsioon toimus kuni sademe kohal olev ekstrakt muutus värvustuks. Minul tuli ekstrakti mõõtesilindrisse 7,5 ml (ekstrakti kogumaht ).
  

Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs

• Karotenoidide neeldumisspekter mõõtsin vahemikus 350-600 nm ning võrdluslahusena kasutasin puhast ektrahenti, milleks oli minu katse puhul heptaan. Töötasin klaasküvettidega.
  
• P
  ärast masina töövalmis sättimist joonistus spektrofotomeetri ekraanile uuritava lahuse neeldumisspekter, millel kursori nihutamisega sain kindlaks määrata need lainepikkused, kus paiknesid iseloomulikud neeldumismaksimumid (λmax) ja maksimumidele vastavad absoptsiooni (A) e optilise tiheduse (D) täpsed väärtused.
  

Võrdlesin saadud tulemusi laborimaterjalidega, sain tulemuseks, et minu proov (porgand) sisaldas β-karoteeni.
Lainepikkus λmax
(nm)
Absorptsioon A
1
477,0
0,4982
2
451,5
0,566
3
426,0
0,4587

-karoteen
λmax 1
λmax 2
λmax 3
E% 1cm
Heksaan
482
451
425
2650
Karotenoidi sisalduse arvutamine ( kvantitatiivne analüüs)
Karotenoidi sisalduse arvutamiseks kasutatakse neeldumisspektri analüüsimisel saadud andmeid ehk neeldumismaksimumidele λmax vastavaid absorptisooni (A) väärtusi. Reeglina võetakse arvutamisel aluseks selline absorptsiooni väärtus, mis vastab neeldumisspektri kõige kõrgemale „tipule“. Arvutus põhinebki nimetatud lainepikkusele λmax vastava A väärtuse ja samal lainepikkusel mõõdetud ekstinktsioonikoefitsiendi väärtuse suhtele.
Karotenoidi sisaldus (K, mg%) uuritavas proovis arvutatakse vastavalt valemile:
, kus
A – absorptsiooniväärtus, mis vastab aluseks valitud neeldumismaksimumile λmax (kõrgeimale „tipule“ vastav A väärtus
E1cm1% - vaadeldava karotenoidi ektstinktsioonikoefitsient (1%-lise karotenoidi lahuse absorptisoon) sama λmax juures
V – ekstrakti kogumaht, mL
d – kasutatud ekstrahendi tihedus, g/cm3
g – uurimiseks võetud taimse materjali mass, g
103 – tegur milligrammidele üleminekuks
ehk 2260 μg
Tulemus 2,26 mg% näitab, et 100 g porgandit sisaldab 2, 26 mg - karoteeni ?? . Millise karotenoidi identifitseerisite? : - karoteeni
Järeldus:
Antud töö eesmärgiks oli porgandi karotenoidse sisalduse määramine: - karoteeni sisaldus porgandis on 2,26mg%, 100g ekstraktis milles? porgandis on 2,26 mg  -karoteeni. Kirjanduse millise, viide ? andmetel peaks toores porgandis olema umbes 8285μg g - karoteeni, viga võis tulla kehvadest töövõtetest või oleneda ka porgandist, mida tööks kasutati.
Kirjanduse viide:
http://www.carrotmuseum.co.uk/betacarotene.html
4